一种生物膜样益生菌微胶囊及其制备方法和应用

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1.本发明属于食品与医药技术领域，具体涉及一种生物膜样益生菌微胶囊及其制备方法和应用。

背景技术：

2.近年来，研究人员尝试建立的各类与肠道菌改善相关的方法，最终目的都是为了利用特定的菌信息操控肠道微生态的组成与结构，以影响宿主的生理系统功能发生改变。正如目前已经开发的粪便微生物移植(fmt)已被证明是艰难梭菌感染(cdi)、炎症性肠病(ibd)和其他一些胃肠道疾病的有效方法。然而为了探究更加便利且有效的菌改善方法，研究人员们也在积极开发口服递送益生菌至肠道的微生态制剂。目前用于商业产品的益生菌大多属于乳杆菌属或者双歧杆菌属，它们对储存环境条件和许多胃肠道环境极为敏感。在之前的一项关于商业益生菌递送过程中存活率的可行性报告中显示，所有测试的商业产品在胃液中孵育5分钟内菌落形成单位(cfu)减少了106倍以上。因此需要更有效的递送策略来提高益生菌通过人体胃肠道的定植稳定性。
3.目前已经开发的向胃肠道递送益生菌的系统包括药物配方和食品基础产品两大类，特别是药物制剂被认为比食品产品更有效，但它们大多存在以下问题：(1)货架期短、保存条件苛刻；(2)服用方式困难或繁琐，剂型设计上患者依从性低；(3)难以通过胃液、胆汁、消化酶等环境因素的挑战，导致抵达肠道的活性菌数量不足；(4)消化道远端一次性释放导致保留时间短，肠道定植难度大。
4.与传统剂型相比，多层凝胶骨架的微胶囊主要功能集中在存储时保护细胞抵御异常温度、提高装载量和包封效率、通过胃肠道转运时保护细胞活性、改善黏附定植能力、可加入营养物质增强益生菌在胃肠道传代过程中的活性和功能、靶向结肠释放或者形成控释缓释的效果等。
5.在面对复杂严苛的生长环境时，微生物细胞会附着在生物或非生物表面形成聚集的微生物落，并在细胞外分泌自产的胞外聚合物(eps)。自分泌的eps为应对不利环境提供了物理屏障和营养供应，提高了生物膜样菌的粘附力，同时促进聚集的细胞落渗出代谢物和交换水。生物膜样的生命模式对微生物的定植与传代是非常有利的。

技术实现要素：

6.为生物膜样益生菌落的产生创造附着条件，发明人关注到了微胶囊制备的静电喷雾技术。该技术作为静电纺丝技术的变体，已被开发并用于制备药物输送的微球/微囊。发明人的研究发现，通过电喷具有一定导电性的含有益生菌单体的溶液，可以制造稳定、均匀的益生菌微胶囊；结合采用ph敏感性的结肠递送材料作为电喷液的组分，控制各类制备参数，形成理想的粒径尺寸后，通过诱导培养微胶囊内的菌体形成生物膜样菌落，最终可制备形成一种输送生物膜样益生菌落至肠道定植的毫米级静电喷雾微胶囊。
7.因此，本发明的第一个目的，在于提供一种生物膜样益生菌微胶囊，通过将海藻酸
钠溶液、乳清蛋白溶液和益生菌混合后，经静电喷雾得到。
8.根据本发明，所述海藻酸钠溶液的质量百分比溶度为2％～3％。
9.根据本发明，所述乳清蛋白溶液的质量百分比浓度为8～15％。
10.根据本发明的优选实施例，所述生物膜样益生菌微胶囊还包裹有壳聚糖外壳。
11.根据本发明，所述益生菌可以选用包括：乳杆菌，包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、卷曲乳杆菌、约氏乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌；芽孢杆菌，包括凝结芽孢杆菌；双歧杆菌，包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、假小链双歧杆菌；以及乳链球菌和嗜热链球菌中的一种或它们的任意组合。
12.本发明的第二个方面，提供了上述的生物膜样益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
13.s1：配制海藻酸钠溶液，质量百分比溶度为2％～3％；
14.s2：配制乳清蛋白溶液，质量百分比溶度为8～15％，调节ph至7.0，然后加入益生菌菌体，混合均匀；
15.s3：将s1和s2配制的两种溶液以体积比1:1混合均匀；
16.s4：将s3得到的混合溶液注入注射器，采用静电喷雾仪，以cacl2溶液作收集液，静电喷雾得到生物膜样益生菌微胶囊。
17.根据本发明的优选实施例，所述静电喷雾的具体条件如下：
18.静电喷雾仪的喷雾针距离收集液液面9～13cm，推注速率为40～50μl/min，电压为10～14kv。
19.根据本发明的优选实施例，所述制备方法还包括s5：将s4得到的微胶囊在mrs液体培养基中培养12～16h后，移至壳聚糖溶液中包裹外壳。
20.优选的，所述壳聚糖溶液的浓度为30～80g/l。
21.本发明的第三个方面，提供了上述的生物膜样益生菌微胶囊的应用，用于肠道或结直肠的益生菌菌落递送。
22.本发明具有以下有益效果：
23.1、本发明的微胶囊所使用的成分简单易得、成本低廉，不涉及复杂聚合物的改性或反应，方法简便易控，设备要求低，成品收率高、质量稳定，适合于大工业生产。
24.2、本发明将静电喷雾技术应用于益生菌制剂的制备，包埋率高达99.9％。通过电压作用，一定程度地提高了菌体的活性。
25.3、本发明的微胶囊通过静电喷雾技术构建了海藻酸钠凝胶骨架，通过后培养诱导菌体在微胶囊内部产生生物膜样菌落，一方面提高了输送的菌体的有效数量，另一方面提高了菌落自身对于外界环境的抵抗能力，更好地保留了菌体活性，延长了益生菌微胶囊在不同温度条件下的储存时间，具有高稳定性，也为益生菌在肠道黏膜内定植创造了更优地先决条件。
26.4、本发明在微胶囊中添加了营养物质乳清蛋白，一方面促进菌落生物膜的产生，在肠道内释放提供氮源类营养物质；另一方面利用乳清蛋白网格缩水功能，提高了微胶囊对环境温度的耐受能力。
27.5、本发明由静电喷雾技术制备的毫米级微胶囊干燥前粒径为0.1～3.0mm，优选控
制为0.4～0.8mm，且粒径均匀，干燥分散后粒径约为0.2～0.35mm。方便运输携带和各类人服用的同时，可添加于多种食品药品中。
28.6、本发明的微胶囊具有ph敏感性，且遇水会迅速膨胀复原，粘附性提高。在模拟胃液(ph1.5)的环境中可保持3h形态未发生明显变化，在模拟小肠液(ph6.8)和模拟结肠液(ph7.5)的环境中外壳能迅速膨胀，易机械破坏产生孔隙，可控释放营养物质和生物膜样益生菌落至肠道中。
29.7、本发明的微胶囊可延长有效活菌数在体内肠道、尤其是盲肠和结直肠中的保留时间，为进一步定植增殖创造了良好的条件，也为活菌在体内发挥功效作用提供了足够的时间。
附图说明
30.图1显示了实施例1的不同海藻酸钠浓度下制备的毫米级微胶囊(dc)和光学显微镜图像(om)、荧光显微镜图像(cm)，图中的标尺均为0.5mm。
31.图2为微胶囊粒径与不同海藻酸钠浓度之间的变化趋势图。
32.图3为实施例2的喷雾针与收集液液面不同距离条件下制备的毫米级微胶囊(dc)和光学显微镜图像(om)、荧光显微镜图像(cm)，图中的标尺均为0.5mm。
33.图4为微胶囊粒径与不同距离之间的变化趋势图。
34.图5为实施例3的不同推注速率条件下制备的毫米级微胶囊(dc)和光学显微镜图像(om)、荧光显微镜图像(cm)，图中的标尺均为0.5mm。
35.图6为微胶囊粒径与不同速率之间的变化趋势图。
36.图7为实施例4的不同电压条件下制备的毫米级微胶囊(dc)和光学显微镜图像(om)、荧光显微镜图像(cm)，图中的标尺均为0.5mm。
37.图8为微胶囊粒径与不同电压之间的变化趋势图(a)，微胶囊包封率与不同电压之间的变化趋势图(b)。
38.图9为实施例5的游离菌体经过不同电压后接入mrs液体培养基的生长曲线(a)，以及实施例6的含有海藻酸钠、乳清蛋白的静电喷雾混合液中的菌体经过不同电压后接入mrs液体培养基的生长曲线(b)。
39.图10为实施例7的不同组成物在不同培养时间下对植物乳杆菌产生生物膜的催化作用对比图。
40.图11为实施例8的扫描电镜图，其中a和b为微胶囊外表面形貌扫描电镜图，c和d为对照组sa+wp+chi微胶囊横截面内部的扫描电镜图，e和f为实验组sa+wp+b(mrs)+chi微胶囊横截面内部的扫描电镜图。
41.图12为实施例9的不同温度条件下组成物不同的微胶囊与游离菌体的存活率对比图，其中a为-20℃下组成物不同的微胶囊内菌体、游离菌体的存活率对比图，b为25℃下组成物不同的微胶囊内菌体、游离菌体的存活率对比图，c为40℃下组成物不同的微胶囊内菌体、游离菌体的存活率对比图。
42.图13为实施例10的在模拟胃液环境中组成物不同的微胶囊内菌体、游离菌体的存活率随时间变化的对比图。
43.图14为实施例11的在模拟小肠液环境中实验组sa+wp+b(mrs)+chi微胶囊的菌体
累计释放曲线(a)，以及在模拟结肠液环境中实验组sa+wp+b(mrs)+chi微胶囊的菌体累计释放曲线(b)。
44.图15显示了实施例12中的sa+wp+b(mrs)+chi微胶囊(a)与游离菌体(b)在小鼠体内胃、小肠、盲肠、结直肠各部位的活菌数保留情况。
具体实施方式
45.下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的范围。
46.本发明通过将海藻酸钠溶液、乳清蛋白溶液和益生菌混合后，经静电喷雾得到了一种生物膜样益生菌微胶囊。通过静电喷雾技术构建了海藻酸钠凝胶骨架，通过后培养诱导菌体在微胶囊内部产生生物膜样菌落，一方面提高了输送的菌体的有效数量，另一方面提高了菌落自身对于外界环境的抵抗能力，更好地保留了菌体活性，延长了益生菌微胶囊在不同温度条件下的储存时间，具有高稳定性。
47.本发明的生物膜样益生菌微胶囊的制备方法包括以下步骤：
48.s1：配制海藻酸钠溶液，质量百分比溶度为2％～3％；
49.s2：配制乳清蛋白溶液，质量百分比溶度为8～15％，调节ph至7.0，然后加入益生菌菌体，混合均匀；
50.s3：将s1和s2配制的两种溶液以体积比1:1混合均匀；
51.s4：将s3得到的混合溶液注入注射器，采用静电喷雾仪，以cacl2溶液作收集液，静电喷雾得到生物膜样益生菌微胶囊。
52.优选的，所述制备方法还包括s5：将s4得到的微胶囊在mrs液体培养基中培养12～16h后，移至壳聚糖溶液中包裹外壳；所述壳聚糖溶液的优选浓度范围为30～80g/l。
53.实施例1：海藻酸钠浓度对制备含有荧光蛋白益生菌的毫米级微胶囊性能的影响
54.本实施例采用植物乳杆菌wcfs1(杭州弘赛生物科技有限公司)为益生菌菌株，为了更好地观测菌体在微胶囊中的包埋分散情况，在植物乳杆菌wcfs1导入了pmg36e-egfp荧光蛋白质粒(湖南丰晖生物科技有限公司)。
55.将海藻酸钠固体粉末分散在灭菌后的超纯水中，50℃恒温搅拌，制得溶解均匀的海藻酸钠溶液。海藻酸钠溶液质量百分比浓度分别为0.5％、1％、2％、3％、和4％。
56.将10％的分离乳清蛋白溶液置于85℃水浴中30分钟，用1m氢氧化钠调节蛋白质溶液的ph值为7.0，通过100nm滤网冷却。将活化两次后，培养至对数生长期的植物乳杆菌菌液，3500rpm离心3分钟，弃去培养基上清液，菌体用dpbs溶液洗涤两次后，加入103～105cfu/ml的菌体至冷却的分离乳清蛋白溶液中，磁力搅拌15分钟。
57.按体积比1:1分别加入不同浓度的海藻酸钠溶液。磁力搅拌至少20分钟混合均匀，无明显颗粒结块，具有一定的流动性。
58.将组合溶液加入10ml注射器中，采用静电喷雾仪，注射器联通17#喷雾针，以25mm cacl2溶液作收集液，喷雾针距离收集液液面约9cm，推注速率为40μl/min，电压为10kv。
59.用数码相机拍摄微胶囊形态，结果如图1的dc所示，拍摄视野为直径20mm的圆形共
聚焦培养皿；用光学显微镜观察并拍摄微胶囊形状，结果如图1的om所示；用荧光显微镜观察拍摄同一视野中微胶囊内含荧光蛋白的植物乳杆菌的分布情况，结果如图1的cm所示，图中的标尺均为0.5mm。以下其它实施例进行的数码相机、光学显微镜、荧光显微镜拍摄时均作同样处理。
60.粒径测量方法为：采用imagej软件测量dc图像中微胶囊的最大、最小费雷特直径，随机选取100个微胶囊进行测量，计算最大和最小费雷特直径的几何平均值来表示微胶囊粒径的大小。以下其它实施例进行的粒径测量均作同样处理。
61.图1的结果显示，干燥前的毫米级微胶囊粒径为0.37～2.57mm，优选为0.8～0.4mm。较小的粒径使得微胶囊拥有较大的比表面积，增加了与胃肠道黏膜的接触，从而促进黏附与释放。稳定性优良和包埋率高的特点也符合制剂合成的要求。
62.制作不同海藻酸钠浓度条件下制备的微胶囊粒径的变化趋势图，结果如图2所示。
63.由图2的结果可知，海藻酸钠浓度在0.5％时，微胶囊形态难以均匀成形；海藻酸钠浓度增加到1％后，微胶囊形态逐渐稳定；当海藻酸钠浓度为2％时，微胶囊成形性良好，形态圆润稳定，含有荧光蛋白的植物乳杆菌菌体均匀分布，粒径分布较均匀；之后随着海藻酸钠浓度的逐渐增大，微胶囊粒径呈逐渐减小的趋势；但当海藻酸钠浓度增加至3％时，微胶囊形态开始出现变化，且粒径分布不均匀差异性较大；至海藻酸钠浓度达4％时，电喷液粘度过大导致微胶囊形态发生变化。可见海藻酸钠的浓度宜控制在2～3％。
64.实施例2：喷雾针与收集液液面不同距离对制备含有荧光蛋白益生菌的毫米级微胶囊性能的影响
65.本实施例采用与实施例1相同的制备方法，不同之处在于海藻酸钠溶液的浓度设定为2％。喷雾针距离收集液液面分别为5cm、7cm、9cm、11cm、和13cm。
66.用数码相机、光学显微镜及荧光显微镜拍摄各组微胶囊形态，结果如图3所示；计算各组微胶囊的粒径，并制作不同接收距离条件与该条件下制备的微胶囊粒径之间的变化趋势图，结果如图4所示。
67.由图4的结果可知，随着接收距离的增大，微胶囊粒径的整体变化趋势是减小的。由于静电场力与其他作用力之间存在一定的平衡关系，接收距离决定了微胶囊喷出时受到的静电场力的作用力大小。根据图4的结果，静电喷雾仪的喷雾针距离收集液液面宜控制在9～13cm。
68.实施例3：不同电喷雾推注速率对制备含有荧光蛋白益生菌的毫米级微胶囊性能的影响
69.本实施例采用与实施例1相同的制备方法，不同之处在于海藻酸钠溶液的浓度设定为2％，喷雾针距离收集液液面设定为9cm，电喷雾仪的推注速率分别设定为30μl/min、35μl/min、40μl/min、45μl/min、和50μl/min。
70.用数码相机、光学显微镜及荧光显微镜拍摄各组微胶囊形态，结果如图5所示；计算各组微胶囊的粒径，并制作不同推注速率条件与该条件下制备的微胶囊粒径之间的变化趋势图，结果如图6所示。
71.由图6的结果可知，推注速率对微胶囊粒径大小存在一定的影响，并呈现随着速率的提高，微胶囊粒径逐渐变小的趋势。当推注速率在30μl/min、35μl/min时，微胶囊粒径仍保持在1mm左右。当推注速率达到40μl/min时开始出现转折，粒径缩小到0.42mm，均一性良
好。且随着推注速率的增大，粒径没有出现较大的减小变化。因此推注速率宜控制在40～50μl/min。
72.实施例4：不同电压对制备含有荧光蛋白益生菌的毫米级微胶囊性能的影响
73.本实施例采用与实施例1相同的制备方法，不同之处在于海藻酸钠溶液的浓度设定为2％，喷雾针距离收集液液面设定为9cm，电喷雾仪的推注速率设定为40μl/min，电压分别设定为0kv、6kv、8kv、10kv、12kv、和14kv。同时，收集接收液和推注液中的样本，通过平板计数的方法计算不同电压条件下微胶囊的包封率。
74.用数码相机、光学显微镜及荧光显微镜拍摄各组微胶囊形态，结果如图7所示；计算各组微胶囊的粒径和包封率，并制作不同电压条件与该条件下制备的微胶囊粒径(a)、包封率(b)之间的变化趋势图，结果如图8所示。
75.由图8的结果可知，不同电压下，包埋率均高达99.9％。但微胶囊粒径受电压影响较大，随着电压的增大，微胶囊粒径整体呈减小的趋势；当电压增加到10kv时，粒径的变化逐渐变平稳，稳定在0.40mm左右。且电压在10、12、和14kv时微胶囊形态和颗粒均匀度也逐渐稳定。因此电压宜控制在10～14kv。
76.实施例5：不同电压对菌体活性的影响
77.将活化两次后，培养16小时至对数生长期的植物乳杆菌菌液于3500rpm离心3分钟，弃去培养基上清液，菌体用pbs溶液洗涤两次后，于pbs溶液中重悬。将重悬液加入注射器中，联通电喷雾仪喷雾针，使菌液分别在电压0kv、5kv、10kv、15kv、和20kv的条件下经过喷嘴后接收。
78.取各组菌液按照0.1％的接种量接入mrs液体培养基中，放入生长曲线仪测定不同时间的600nm波长下的吸光度值(od
600
)，并绘制生长曲线，结果如图9a所示。
79.由图9a的结果可知，不同电压条件下，植物乳杆菌生长曲线的走势与各拐点的时间均未有较大改变，可见电喷雾仪中产生的电压刺激并不会影响植物乳杆菌的生长活性，在利用静电高压制备含有荧光蛋白益生菌的毫米级微胶囊时，微胶囊内的益生菌生长活性并未下降，证明本发明的微胶囊用于输送活性的生物膜样益生菌落至肠道定植是可行的。
80.实施例6：不同电压条件下海藻酸钠、乳清蛋白组合物对菌体活性的作用
81.采用与实施例1相同的制备方法，准备好含有植物乳杆菌的电喷混合液。加入注射器中，联通电喷雾仪喷雾针，使菌液分别在电压0kv、5kv、10kv、15kv、和20kv的条件下经过喷嘴后直接接收于离心管中。
82.取各组混合菌液稀释后，按照0.1％的接种量接入mrs液体培养基中，放入生长曲线仪测定不同时间的600nm波长下的吸光度值(od
600
)，并绘制生长曲线，结果如图9b所示。
83.由图9b的结果可知，经过不同电压后，在含有海藻酸钠、乳清蛋白的电喷混合液中的植物乳杆菌的生长活性不仅没有受到抑制，相同的生长条件下，经过电压后的植物乳杆菌的活性还有所提升。推测海藻酸钠、乳清蛋白的组合物增加了电喷混合液整体的导电性，电压刺激了菌体表面的通路，使养分更好地进入吸收，从而引起活性的增强。
84.实施例7：不同培养时间下乳清蛋白和海藻酸钠对植物乳杆菌产生物膜的影响作用
85.将活化两次后的植物乳杆菌培养16h至对数生长期，按照0.1％的接种至含有不同
组分的mrs液体培养基混合物中。将96孔板静置于37℃培养箱中培养，不同时间(4h、8h、12h、16h)取出，检测生物膜形成状态。
86.生物膜检测方法：取出96孔板用300μl生理盐水洗三次，放入60℃烘箱烘干1h，每孔加入150μl 0.1％的结晶紫，15min后冲洗，于37℃控干，每孔再加入200μl 30％的冰醋酸溶液，静置10min后测量570nm的吸光度值(od
570
)。每组设置3个复孔，不同培养时间下各组od
570
数值对比，结果如图10所示。
87.从图10的结果可知，植物乳杆菌在mrs液体培养基上可贴壁诱导产生生物膜样菌落，而分离乳清蛋白的加入有利于生物膜样菌落更多的形成。在海藻酸钠凝胶骨架中，生物膜样菌落形成的最佳时间会有所延后，故本发明选用培养时间12～16小时为毫米级静电喷雾微胶囊内诱导培养产生生物膜样菌落的优选方案。
88.实施例8：含有生物膜样益生菌落的毫米级静电喷雾微胶囊的形貌观察
89.依照实施例1的制备方法，静置培养16h后，取出微胶囊用dpbs溶液冲洗，移至40g/l的壳聚糖溶液中，搅拌30分钟，包裹壳聚糖外壳。取出后用无菌纯水冲洗分散，低温/室温干燥。
90.将含有和不含有生物膜样益生菌落的毫米级静电喷雾微胶囊横切开固定和直接固定在导电胶上，喷金预处理60s后，用扫描电镜在加速电压5.0kv下观察微胶囊的整体全貌，结果如图11a和11b所示，图中标尺为100μm；不含生物膜样益生菌落的对照组横切面的形貌如图11c和11d所示，标尺为100μm和1μm；含有生物膜样益生菌落的实验组横切面的形貌如图11e和11f所示，标尺为10μm和1μm。
91.从图11的结果可知，含有生物膜样益生菌落的静电喷雾微胶囊内形成了团块状的生物膜样益生菌落。
92.实施例9：不同温度条件下生物膜样益生菌落的毫米级静电喷雾微胶囊内的细胞存活率随时间的变化
93.将游离的植物乳杆菌组(free cells)、以海藻酸钠为主要组分的植物乳杆菌电喷雾微胶囊(sa+b(none))、以分离乳清蛋白和海藻酸钠为主要组分的植物乳杆菌电喷雾微胶囊(sa+wp+b(none))、采用实施例8的制备方法制得的含有生物膜样益生菌落的静电喷雾微胶囊(sa+wp+b(mrs)+chi)共四组对象，分别放置于-20℃、25℃、和40℃的温度环境中，分别于第0、1、2、3、4天取样，微胶囊破碎后通过平板计数的方法计算cfu，对比不同温度条件下各组每天的细胞存活率变化，结果如图12a(-20℃)、12b(25℃)和12c(40℃)所示。
94.细胞存活率计算方法如下：
[0095][0096]
从图12的结果可知，乳清蛋白由于其特殊的网格缩水功能可保护益生菌菌体在不同温度环境下的活性，且乳清蛋白作为一种氮源类营养物质，可使植物乳杆菌在合适的温度环境下继续在微胶囊中以生物膜样菌落的形式生长。
[0097]
实施例10：人工模拟胃液中生物膜样益生菌落的毫米级静电喷雾微胶囊内的细胞存活率随时间的变化
[0098]
将游离的植物乳杆菌组(free cells)、以分离乳清蛋白和海藻酸钠为主要组分的植物乳杆菌电喷雾微胶囊(sa+wp+b(none))、采用实施例1的制备方法制得的未诱导培养生物膜样菌落和包裹壳聚糖外壳的植物乳杆菌电喷雾微胶囊(sa+wp+b(none)+chi)、采用实施例8的制备方法制得的含有生物膜样益生菌落的静电喷雾微胶囊(sa+wp+b(mrs)+chi)共四组对象，分别放置于人工模拟胃液溶液中，放入摇床内220rpm震荡以模拟胃内的机械消化。于0、1、2、3小时分别取样，通过破碎后平板计数的方法检测每克微胶囊内/每毫升游离菌液中的活菌数量，并计算各组细胞存活率随时间的变化情况，结果如图13所示。
[0099]
细胞存活率计算方法如下：
[0100][0101]
从图13的结果可知，和对照组相比，本发明的微胶囊在模拟胃液中有较高的细胞存活率，能减少胃部的酸性环境对益生菌植物乳杆菌的侵蚀，有效保护益生菌通过胃部转运，在抵达肠道时保有较高的活菌数量。进一步地，含有生物膜样益生菌落的静电喷雾微胶囊(sa+wp+b(mrs)+chi)较未经过mrs液体培养基诱导产生生物膜的微胶囊表现出了更强的胃液环境抵御能力。
[0102]
实施例11：人工模拟小肠液、人工模拟结肠液环境中，含有生物膜样益生菌落的毫米级静电喷雾微胶囊中的植物乳杆菌活菌随时间的累积释放情况
[0103]
将采用实施例8的制备方法制得的含有生物膜样益生菌落的毫米级静电喷雾微胶囊置于人工模拟小肠液中，放入摇床内220rpm震荡以模拟体内小肠的蠕动环境。每隔20分钟取样并更换一次容器内的人工模拟小肠液，通过平板计数的方法计算cfu和绘制累计释放曲线，结果如图14a所示。
[0104]
将采用实施例8的制备方法制得的含有生物膜样益生菌落的毫米级静电喷雾微胶囊置于人工模拟结肠液中，放入摇床内220rpm震荡以模拟体内结肠的蠕动环境。每隔1小时取样并更换一次容器内的人工模拟结肠液，通过平板计数的方法计算cfu和绘制累计释放曲线，如图14b所示。
[0105]
从图14的结果可知，本发明的微胶囊表现出ph响应性释放，在模拟小肠与结肠的环境中，含有生物膜样益生菌落的毫米级静电喷雾微胶囊能迅速膨大产生较大孔隙，使生物膜样益生菌落在肠道蠕动的机械作用力下从微胶囊中渗出后粘附于肠粘膜表面，得以继续生长传代。本发明的微胶囊累计释放时间较长且均匀，加之特殊的组分设计使得微胶囊表面遇水后产生较大粘性，可黏附于肠道内表面黏膜层，形成缓控释效果。
[0106]
实施例12：生物膜样益生菌微胶囊中的活菌与游离益生菌细胞在小鼠体内消化系统的定植保留时间对比
[0107]
将采用实施例8的制备方法制得的含有生物膜样益生菌落的毫米级静电喷雾微胶囊与游离的植物乳杆菌分别通过灌胃给药的方法递送至balb/c小鼠的体内，分别经过0、2、和4天后取部分小鼠处死，然后取出胃、小肠、盲肠、结直肠部位，机械破碎后，取上清液稀释后涂板计数，结果如图15所示。
[0108]
图15a和15b分别显示了sa+wp+b(mrs)+chi微胶囊与游离菌体在小鼠体内胃、小
肠、盲肠、结直肠各部位的活菌数保留情况。从图15的结果可知，本发明的微胶囊在一次性给药后表现出优异的胃肠道保留，为肠道定植提供了足够的活菌数先决条件。与游离的植物乳杆菌组相比，微胶囊组一次性给药后，经过4天，盲肠结直肠处的活菌数量仍可达到107cfu，而游离的植物乳杆菌组一次给药后，结直肠处的活菌数量则从10
8-109cfu下降至10
5-106cfu。微胶囊组的cfu在盲肠和结直肠中减少了10倍以下，而游离的植物乳杆菌组中盲肠和结直肠的cfu减少了超过103倍。
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这些结果表明，本发明构建了海藻酸钠凝胶骨架，加入了乳清蛋白作为营养物质且延长了益生菌微胶囊在不同温度条件下的储存时间，具有高稳定性。同时通过后培养诱导菌体在微胶囊内部产生生物膜样菌落，以生物膜菌落的形式输送益生菌至肠道内定植，更好地保留了菌体活性，也为益生菌在肠道黏膜内粘附定植创造了更优的先决条件。本发明不仅保证了递送益生菌的有效活性数量，还使发挥功效作用的活菌在肠道中的保留时间得以延长，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种生物膜样益生菌微胶囊，其特征在于，通过将海藻酸钠溶液、乳清蛋白溶液和益生菌混合后，经静电喷雾得到。2.根据权利要求1所述的生物膜样益生菌微胶囊，其特征在于，所述海藻酸钠溶液的质量百分比溶度为2～3％。3.根据权利要求1所述的生物膜样益生菌微胶囊，其特征在于，所述乳清蛋白溶液的质量百分比浓度为8～15％。4.根据权利要求1所述的生物膜样益生菌微胶囊，其特征在于，还包裹有壳聚糖外壳。5.根据权利要求1所述的生物膜样益生菌微胶囊，其特征在于，所述益生菌选自：乳杆菌，包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、卷曲乳杆菌、约氏乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌；芽孢杆菌，包括凝结芽孢杆菌；双歧杆菌，包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、假小链双歧杆菌；以及乳链球菌和嗜热链球菌中的一种或它们的任意组合。6.根据权利要求1～5中任一项所述的生物膜样益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于包括以下步骤：s1：配制海藻酸钠溶液，质量百分比溶度为2～3％；s2：配制乳清蛋白溶液，质量百分比溶度为8～15％，调节ph至7.0，然后加入益生菌菌体，混合均匀；s3：将s1和s2配制的两种溶液以体积比1:1混合均匀；s4：将s3得到的混合溶液注入注射器，采用静电喷雾仪，以cacl2溶液作收集液，静电喷雾得到生物膜样益生菌微胶囊。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述静电喷雾的具体条件如下：静电喷雾仪的喷雾针距离收集液液面9～13cm，推注速率为40～50μl/min，电压为10～14kv。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括s5：将s4得到的微胶囊在mrs液体培养基中培养12～16h后，移至壳聚糖溶液中包裹外壳。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液的浓度为30～80g/l。10.根据权利要求1～5中任一项所述的生物膜样益生菌微胶囊的应用，其特征在于，用于肠道或结直肠的益生菌菌落递送。

技术总结

本发明公开了一种生物膜样益生菌微胶囊，通过将海藻酸钠溶液、乳清蛋白溶液和益生菌混合后，经静电喷雾而得到。本发明还公开了所述生物膜样益生菌微胶囊的制备方法。本发明通过静电喷雾技术构建了海藻酸钠凝胶骨架，通过后培养诱导菌体在微胶囊内部产生生物膜样菌落，一方面提高了输送的菌体的有效数量，另一方面提高了菌落自身对于外界环境的抵抗能力，更好地保留了菌体活性，延长了益生菌微胶囊在不同温度条件下的储存时间，具有高稳定性，也为益生菌在肠道黏膜内定植创造了更优地先决条件。生菌在肠道黏膜内定植创造了更优地先决条件。生菌在肠道黏膜内定植创造了更优地先决条件。