一种降解煤的丝状真菌分离方法与流程

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1.本发明属于低阶煤的微生物转化技术领域，具体涉及一种降解煤的丝状真菌分离方法。

背景技术：

2.2017年中国煤炭探明储量为16666.73亿t，其中低阶煤储量占全国总体煤储量的50%以上[1]，最典型的低阶煤是褐煤，储量占到中国煤炭总储量的12%[2]。褐煤煤化程度低，水分含量高，挥发分高，热稳定性差，化学反应性强，易风化，发热量低，直接燃烧环境污染严重。
[0003]
长期以来，“富煤、少气、缺油”的资源条件使得煤在我国能源结构中一直占据主导地位，近年来我国能源消费结构持续优化，煤炭消费占比持续降低，但在2020年煤炭消费量仍然占能源消费总量56.8%。根据预测，煤炭消费预计2025年前达峰，占比持续下降，2030年煤炭消费占比降至43%左右，2060年降至4.7%[3]，绿低碳成为能源发展方向。
[0004]
上世纪20年代，fischer等[4]发现储存在实验室中未经处理的湿煤样品上长出了白和绿的菌丝，经研究后还发现煤块或者硬煤都可以作为真菌作用的底物，他们的研究开创了煤微生物降解的先河。该技术具有反应条件温和、设备简单、无污染等优点，降解产生的液相产物可进一步用于农业、工业、医药等领域[5]，是煤炭洁净利用的有效途径之一。高效降解煤的菌种资源是该技术的关键，因此开展煤降解微生物的筛选及研究，寻新的降解菌丰富相关菌种资源对于该技术具有重要意义。
[0005]
煤降解微生物的分离筛选过程中通常情况是将硝酸氧化煤粉撒在菌丝表面，通过观察是否有如图1所示黑液滴或培养基是否有如图2所示被降解产物染黑作为微生物是否具有溶煤能力的标志。实验过程中使用的硝酸氧化煤通常是将煤与硝酸按一定比例混合反应一定时间，然后过滤、用水清洗，直到滤液为中性[6-10]。
[0006]
基于上述方法已经从自然界中分离出了上百种能降解褐煤、经氧化处理呈强氧化状态的烟煤以及无烟煤的细菌、放线菌和真菌类微生物[6]。但是该方法存在着两个方面的问题：一是当分离的微生物菌丝生长旺盛时，菌丝在短时间内充满分离平板的空间，往菌丝表面撒煤粉难以观察到煤降解后的黑液滴，据此排除该微生物具有降解煤的能力会造成菌种资源的遗漏。二是通过清水将硝酸氧化煤清洗至中性在实际中需要耗费大量的水，且难以实现清洗液达到中性的目的。

技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供一种降解煤的丝状真菌分离方法，尤其适用于菌丝生长特别旺盛的菌种。
[0008]
本发明由如下技术方案实现的：一种降解煤的丝状真菌分离方法，具体步骤为：（1）煤样硝酸氧化：将煤破碎并筛分，煤粉中边搅拌边加入硝酸，使煤与硝酸充分混合，直到煤粉不再冒黄烟；
（2）清洗硝酸氧化煤：煤与硝酸反应完成后，煤粉中加入纯水搅拌、静置，待煤沉淀后弃去上清液，重复2-3次后加满水，添加碳酸钠或碳酸氢钠的饱和水溶液并搅拌，有气泡产生，重复2-3次后无气泡生成再加水搅拌，静置待煤沉淀后弃去上清液并检测ph值，重复加水搅拌、静置沉淀，至上清液的ph》6，清洗后的煤放入烘箱80℃，烘干48h后121℃湿热灭菌30min备用；（3）制备菌液：采集腐木1g，加入到盛有200ml无菌水及玻璃珠的三角瓶中，封口震荡后取出三角瓶静置；（4）涂布培养：孟加拉红琼脂平板上涂布菌液并培养，观察平板上菌丝生长情况，挑选长势良好的真菌划线分离培养至得到纯种；（5）筛选溶煤菌株：溶煤培养基平板上接种分离得到的真菌，待其布满平板后均匀撒煤，菌丝生长旺盛的真菌，其菌丝体充满平板整个空间，将菌丝压实，至菌丝体紧贴培养基表面，然后再向其表面撒硝酸氧化煤；放入恒温培养箱30℃培养，每天观察培养基颜的变化，当观察到煤覆盖的培养基颜变深变黑，该真菌具有降解煤的潜力。
[0009]
所述煤破碎并筛分至80目~120目；煤样中加入硝酸为体积比为1：1的硝酸水溶液，煤粉与硝酸水溶液的比例为：150g：100 ml，煤与硝酸反应24h。
[0010]
与现有技术相比，本发明在硝酸氧化煤的清洗过程中使用碳酸钠或碳酸氢钠的饱和水溶液，可简化操作步骤，省时、省力、省水。本发明所述方法能够完全筛选分离出降解煤的丝状真菌，尤其适用于菌丝生长特别旺盛的菌种，并且省时省力，并且不会造成菌种资源的遗漏。
附图说明
[0011]
图 1为煤降解后的黑液滴；图2为培养基被染黑的现象；图3为本发明所述工艺流程图；图4为硝酸氧化煤清洗时的泡沫；图5为腐木原液在孟加拉红平板上的菌落；图6为真菌在固体培养基上的煤降解现象；图7为基于18s rdna序列的f11的进化树；图8为煤的真菌降解液a450变化结果；图9为煤的真菌降解液ph变化图。
具体实施方式
[0012]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0013]
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
[0014]
本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等
同技术，都将包含在本技术中。
[0015]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。
[0016]
本发明所用培养基配方如下：sma培养基：蛋白胨10g、琼脂粉20g,麦芽糖 40g、纯水1l,121℃高压灭菌20分钟，倒平板；pda苯胺蓝培养基：5.00g苯胺蓝，定容到50 ml，使用0.45
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m的无菌过滤器将定容后的苯胺蓝溶液过滤到无菌试剂瓶中备用。称取市售马铃薯葡萄糖琼脂（不含抗生素）38 g，加入1000 ml蒸馏水中，121℃高压灭菌20分钟，加入1 ml无菌苯胺蓝溶液，倒平板；改良的pda培养基：市售马铃薯葡萄糖琼脂（不含抗生素）38 g，磷酸氢二钾3 g、硫酸镁1.5 g、硫酸亚铁1 mg、硫酸铜2 mg、盐酸硫胺（维生素b1）8 mg, 纯水1 l, 121℃高压灭菌20分钟，倒平板；czapeck dox-medium培养基：谷氨酸钠20 g、硝酸钠30 g、葡萄糖10 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、ph7.0、琼脂粉20 g、纯水1 l，121℃高压灭菌20分钟，倒平板。
[0017]
实施例1：一种可降解煤的丝状真菌分离方法，工艺流程图如图3所示，具体步骤如下：1、煤样的硝酸氧化：河南义马低阶煤，破碎筛分至80目~120目（0.125 mm-0.20 mm），80℃烘干48 h。在500 ml烧杯中加入煤样150 g、（1+1）硝酸100 ml，搅拌至黄烟消失后静置反应24 h。
[0018]
2、硝酸氧化煤的清洗。煤与硝酸反应24h后，往烧杯中加入纯水并搅拌，有图4所示大量泡沫产生，静置后弃去上清液，重复清洗2~3次至加入纯水搅拌时不再有大量泡沫产生。继续往烧杯中加入纯水，静置后滴加饱和碳酸氢钠溶液，可见大量细小气泡从沉淀的煤样中产生，继续滴加至不再有小气泡产生，静置后弃去上清液。继续往烧杯中加入纯水并搅拌、静置弃去上清液，重复清洗2~3次直至上清液ph》6，弃去上清液后将煤样在80℃下烘干72 h备用。该方法使得清洗150g硝酸氧化煤的水从20l减少到2~4l，同时避免了过滤的操作步骤，使得清洗150g硝酸氧化煤的时间从5h~8h左右减少为30~45min左右。
[0019]
3、菌液制备。称取腐木1 g加入200 ml含玻璃珠的无菌水中，30℃恒温振荡器中振荡培养2 h。
[0020]
4、涂布及培养。菌液静置后取200
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l上清液涂布于孟加拉红琼脂平板，30℃恒温培养，每天观察平板上菌落生长情况，标记出不同形态的菌落，依次记为f1、f2、f3等，如图5所示，将不同形态的菌落在孟加拉红琼脂上反复划线分离纯化，直至获得纯菌株，制作斜面保存。
[0021]
5、溶煤菌株筛选。用接种环从保存的f3、f8、f10、f11斜面上刮取适量菌丝转入含有5 ml无菌水的离心管中，充分震荡离心管使菌液均匀，取200
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l菌液分别滴加于sma培养基、pda苯胺蓝培养基、改良的pda培养基、czapeck dox-medium培养基，用涂布棒均匀涂布，30℃恒温倒置培养，观察菌落生长情况，待菌丝或菌落铺满平板后，向平板的一侧均匀撒上灭过菌的硝酸氧化煤，向另一侧均匀撒上灭过菌的原煤作为对照，尤其是f3、f11两株菌的
菌丝特别旺盛，需先使用涂布棒等工具将菌丝压实再撒煤，30℃恒温培养，定期从平板底面观察培养基是否被染黑或是否有黑液滴产生，结果如图6所示，f3、f8、f11均可降解硝酸氧化煤并将培养基染黑，尤其是f3、f11的菌丝生长特别旺盛，如果不将菌丝压实再撒煤，而是直接在菌丝表面撒煤，则不能观察到黑液滴或培养基被染黑的现象，从而遗漏该菌种。
[0022]
6、菌种鉴定：采用上海生工真菌提取试剂盒提取真菌f3、f11的dna，使用18s rdna扩增通用引物ns1/ns8对真菌dna进行pcr，pcr产物送至上海生工生物工程有限公司测序.将测序结果提交至bcbi的genbank数据库进行blast比对，确定与已报道的微生物序列的同源性。下载相似性最高的同源序列，采用mega 6.0中的clustalw进行多序列比对，采用邻接（neighbor-joining，nj）法构建分子进化树，其中建树的检验方法（test of phylogeny）选择自助法（bootstrap method），抽样数（no. of bootstrap replications）为500。
[0023]
测序结果显示，f3和f11相似性为99.7%（仅5个碱基不同），为同一株菌。根据f11的18s rdna 序列构建的系统发育树如图7所示，f11与雅致小克银汉霉（cunninghamellaelegans）处于同一分支，同源性最高，相似度为99.45%，因此鉴定为该菌株为雅致小克银汉霉（cunninghamellaelegans），查阅文献尚未见有关于该菌可降解煤的研究。
[0024]
7、真菌f11在液体培养基中的煤降解实验：用接种环从保存的f11斜面上刮取适量菌丝转入含有5 ml无菌水的离心管中，充分震荡离心管使菌液均匀，取200
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l菌液滴加于pda培养基，用涂布棒均匀涂布，30℃恒温倒置培养5d，菌丝铺满平板。
[0025]
在250 ml三角瓶中加入150 mllb培养基，121℃湿热灭菌30min后，接入三孔真菌f11，放入恒温振荡器在30℃、150 rpm条件下恒温振荡培养4d，加入2g灭菌的硝酸氧化煤，放入恒温振荡器在30℃、150 rpm条件下继续恒温振荡培养，每5天取菌液测ph、450nm处的吸光度a450。无菌对照组的培养基中不加入煤，无煤对照组的培养基中不加菌。每组实验做三个平行样。
[0026]
待a450稳定后，将降解液在10000 rpm下离心10min，收集上清液，用盐酸将上清液ph值调至2以下，沉淀24 h以上，离心收集沉淀，80℃烘干24 h。
[0027]
降解液的a450变化如图8所示，a450在第20天达到8.33并保持相对稳定。一个降解周期可分为三个阶段，第0~5天为第一阶段，a450缓慢上升。第5~15天为第二阶段，a450迅速上升。第15~25天为第三阶段，a450保持相对稳定。
[0028]
煤的真菌降解液ph变化如图9所示，无煤对照（f11+lb）、实验组（f11+硝酸氧化煤+lb）ph值相近且变化趋势一致，因ph测定时使用的是ph试纸，取值都为整数，所以在图中曲线重合。加煤启动降解实验时，无煤对照（f11+lb）、无菌对照（硝酸氧化煤+lb）、实验组（f11+硝酸氧化煤+lb）的ph分别约为7、5、7。加煤启动降解实验第5天，无煤对照（f11+lb）、实验组（f11+硝酸氧化煤+lb）的ph升至8附近。加煤启动降解实验第10天，无煤对照（f11+lb）、实验组（f11+硝酸氧化煤+lb）的ph升至9附近，稳定至实验结束。整个实验周期内，无菌对照（硝酸氧化煤+lb）的ph值稳定，约为5，说明真菌f11在生长过程中分泌了碱性物质，随着ph的升高，实验组（f11+硝酸氧化煤+lb）的a450也升高，这与真菌碱性物质作用机理规律一致。
[0029]
待a450稳定后，将降解液在10000 rpm下离心10 min，收集上清液，用盐酸将上清
液ph值调至2以下，沉淀24 h以上，离心收集沉淀，80℃烘干24 h后称量，沉淀质量0.22g，实验启动时加入的煤粉是2g，因此产物得率11%。
[0030]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
[0031]
参考文献：[1]简阔. 低阶煤生物成因气与热成因气模拟及其结构演化研究[d]. 中国矿业大学, 2016. 宁晓钧，党晗，张建良，等. 低阶煤热解与兰炭生产工艺研究进展[j]. 钢铁, 2021, 56(01): 1-11. 苏健，梁英波，丁麟，等. 碳中和目标下我国能源发展战略探讨[j]. 中国科学院院刊, 2021, 36(09): 1001-1009.[4] fkaoussa-r m. coal a substrate of microorganism:investigation with microbial conversion of national coal [d]. friedrichwilhelms university, 1981.[5] m-s cohen, gabriele p-d. degradation of coal by the fungi polyporus versicolor and poriamonticola[j]. appl environ microbiol, 1982, 44(1): 23-27.[6] 石开仪. 白腐真菌hypocrealixii ah对抚顺长焰煤及其模型化合物生物液化机理研究[d]. 中国矿业大学, 2011.[7]natalia kwiatos, j
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技术特征：

1.一种降解煤的丝状真菌分离方法，其特征在于：具体步骤为：（1）煤样硝酸氧化：将煤破碎并筛分，煤粉中边搅拌边加入硝酸，使煤与硝酸充分混合，直到煤粉不再冒黄烟；（2）清洗硝酸氧化煤：煤与硝酸反应完成后，煤粉中加入纯水搅拌、静置，待煤沉淀后弃去上清液，重复2-3次后加满水，添加碳酸钠或碳酸氢钠的饱和水溶液并搅拌，有气泡产生，重复2-3次后无气泡生成再加水搅拌，静置待煤沉淀后弃去上清液并检测ph值，重复加水搅拌、静置沉淀，至上清液的ph>6，清洗后的煤80℃，烘干48h，然后121℃湿热灭菌30min备用；（3）制备菌液：采集腐木1g，加入到盛有200ml无菌水及玻璃珠的三角瓶中，封口震荡后取出三角瓶静置；（4）涂布培养：孟加拉红琼脂平板上涂布菌液并培养，观察平板上菌丝生长情况，挑选长势良好的真菌划线分离培养至得到纯种；（5）筛选溶煤菌株：溶煤培养基平板上接种分离得到的真菌，待其布满平板后均匀撒煤，菌丝生长旺盛的真菌，其菌丝体充满平板整个空间，将菌丝压实，至菌丝体紧贴培养基表面，然后再向其表面撒硝酸氧化煤， 30℃恒温培养，每天观察培养基颜的变化，当观察到煤覆盖的培养基颜变深变黑，该真菌具有降解煤的潜力。2.根据权利要求1所述的一种降解煤的丝状真菌分离方法，其特征在于：所述煤破碎并筛分至80目~120目；煤样中加入硝酸为体积比为1：1的硝酸水溶液，煤粉与硝酸水溶液的比例为：150g：100 ml，煤与硝酸反应24h。

技术总结

本发明属于低阶煤的微生物转化技术领域，提供一种降解煤的丝状真菌分离方法，尤其适用于菌丝生长特别旺盛的菌种，将煤破碎并筛分，煤粉中边搅拌边加入硝酸，使煤与硝酸充分混合，直到煤粉不再冒黄烟；清洗硝酸氧化煤，制备菌液，涂布培养，溶煤培养基平板上接种分离得到的真菌，待其布满平板后均匀撒煤，菌丝生长旺盛的真菌，其菌丝体充满平板整个空间，将菌丝压实，至菌丝体紧贴培养基表面，然后再向其表面撒硝酸氧化煤；30℃恒温培养，每天观察培养基颜的变化，当观察到煤覆盖的培养基颜变深变黑，该真菌具有降解煤的潜力。可简化操作步骤，省时、省力、省水。省水。省水。