豌豆不同组织中的内参基因TF2A及其应用

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豌豆不同组织中的内参基因tf2a及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种豌豆不同组织中的内参基因tf2a及其应用。

背景技术：

2.豌豆(pisum sativum l.)属豆科(leguminosae)，豌豆属(pisum)，是春播一年生或秋冬播越年生草本植物，染体2n＝14，地理分布广泛。豌豆是人类栽培的最古老的食用豆类作物之一，它是世界上第三大豆类作物。豌豆在中国的栽培历史已有2000多年，并早已遍及全国，是农民增收的重要经济作物。
3.实时荧光定量pcr(qrt-pcr)因其灵敏度、准确性和快速性而被广泛应用于基因表达的定量分析。而rt-qpcr结果的可靠与否，依赖于内参基因这一重要因素。然而目前大量的研究表明，没有任何一个内参基因mrna表达水平在所有的实验条件下都是恒定的。使用不稳定的内参基因作为数据标准化的内部参照会导致对定量数据的错误解释，最终导致错误的生物学结论。因此，选择一个在处理因素作用下表达相对稳定的基因作内参基因是实时荧光定量pcr成功与否的关键所在。
4.由于内参基因不存在绝对的稳定性，同一物种不同实验条件、不同发育时期、不同部位等表达量差异较大。目前为止，尚缺在豌豆不同组织中稳定表达的内参基因。

技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的之一在于提供一种豌豆不同组织中的内参基因tf2a，所述内参基因tf2a在豌豆不同组织中表达稳定。
6.实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
7.一种豌豆不同组织中的内参基因tf2a，所述内参基因tf2a的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.本发明还提供了扩增上述内参基因tf2a的特异性引物，包括核苷酸序列如seq id no.2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的反向引物。
9.本发明还提供了上述内参基因tf2a在豌豆不同组织mrna的qrt-pcr检测中的应用。
10.本发明还提供了上述内参基因tf2a的特异性引物在豌豆不同组织mrna的qrt-pcr检测中的应用。
11.本发明还提供了上述内参基因tf2a的特异性引物在制备豌豆不同组织mrna的qrt-pcr检测试剂盒中的应用。
12.本发明还提供了一种豌豆不同组织mrna的qrt-pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括上述特异性引物作为内参基因的引物。
13.本发明还提供了一种豌豆不同组织中的相关基因的检测方法，包括以下步骤：以豌豆不同组织的cdna为模板，以豌豆tf2a基因作为内参基因，检测相关基因的表达。
14.在其中一些实施例中，以豌豆tf2a基因作为内参基因，进行qrt-pcr检测相关基因的表达。
15.在其中一些实施例中，所述qrt-pcr以上述特异性引物作为内参基因的引物。
16.在其中一些实施例中，所述qrt-pcr扩增的反应体系为：0.5μl cdna、5μl premix ex taq ii、0.2μl正向引物、0.2μl反向引物和4.1μl ddh2o。
17.在其中一些实施例中，所述qrt-pcr扩增的反应程序为：95℃，30秒；95℃，10秒，40个循环；60℃，30秒。
18.在其中一些实施例中，利用bestkeeper，genorm，normfinder和delta ct法，以及reffinder分析软件评估所述4个候选基因在豌豆不同组织中的稳定性。
19.在其中一些实施例中，所述豌豆不同组织包括根、茎或叶片。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21.针对目前尚未发现豌豆不同组织中稳定表达的内参基因，发明人在研究中发现tf2a基因可以在豌豆不同组织中稳定表达，因此，tf2a基因可以作为研究豌豆不同组织基因表达的内参基因。根据在不同组织中稳定表达的内参基因tf2a所设计的实时荧光定量pcr引物用于豌豆不同组织基因的基因表达分析，可提高研究的稳定性、可靠性和重复性。
附图说明
22.图1为本发明实施例1中琼脂糖凝胶电泳图。
23.图2为本发明实施例1中的qrt-pcr的溶解曲线图。
24.图3为本发明实施例2中qrt-pcr分析候选内参基因的表达结果。
25.图4为本发明实施例2中采用delta-ct方法分析候选内参基因稳定性的结果。
26.图5为本发明实施例2中采用genorm方法分析候选内参基因稳定性的结果。
27.图6为本发明实施例2中采用normfinder方法分析候选内参基因稳定性的结果。
28.图7为本发明实施例2中利用reffinder综合评价候选内参基因稳定性的结果。
具体实施方式
29.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
30.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
31.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
32.以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
33.实施例1内参基因tf2a的引物的获得及特异性检测
34.一、豌豆不同组织的内参基因tf2a，其核苷酸序列为seq id no.1。
35.seq id no.1
36.atgcaacctccttctccttggatgaatcagaggcctccacttgatgtcaatgttgcttatgtggaaggacgggaagaggcagatagaggagcttctaatcagcctatgacacaagatttcttcacagtgcctggtggaaagcgtaaacgcaatgatatgcctccaccatatgatgtcggagggtatatacctcagcaagatggagctggtgatgctggatccagcgattttgaaattgaggtatgtggagggagcatctccttcagttcacaacacactaattcaaaagggaaaatgcccgcagacttggagaaactgacttctaggattcctcaacttgatggaccaattccttacgaggatgatgtgctttcaactccaaatatatactataatggtggagtgtacagtgaagactacaacgttgcaaatacaccagctcctcctgaagcaccagtaagcacccctgctctcgttgctcaaaatgaggtggtaaatgacgatgacgacgatgagcctccattaaatgaaaacgatgatgatgatttagatgacttggaccaaggggatgatcaaaatacacatcatctagttttggcccagtttgacaaggtgacacgtactaagagcaggtggaaatgcacattaaaggatggcatcatgcatataaataacaaggatattctcttcaacaaggcaacaggagagtttgacttctga
37.二、设计针对豌豆内参基因tf2a的引物
38.以内参基因tf2a的核苷酸序列为基础，利用primerpremier5.0软件进行设计针对豌豆不同组织中内参基因tf2a的特异性引物，包括核苷酸序列如seq id no.2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的反向引物。具体序列如下：
39.正向引物f
40.5'-gaccaagtgactactcttcttct-3'(seq id no.2)
41.反向引物r
42.5'-gctcctctatctgcctcttc-3'(seq id no.3)
43.三、常规pcr检测引物的特异性
44.提取豌豆各组织的总rna，反转录合成cdna；以cdna为模板，并以上述步骤二的引物进行常规pcr扩增反应，检测上述引物的特异性。
45.pcr反应体系：反应总体积为25μl，包括2
×
easytaq pcr supermix(北京全式金生物，中国)12.5μl、正向引物(0.4μmol/l)1μl、反向引物(0.4μmol/l)1μl、模板cdna(100ng)2μl和ddh2o 8.5μl。
46.pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，33个循环；最后72℃下延伸5min。
47.所得pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示；由图1可知，pcr扩增得到一条单一条带，没有发现引物二聚体和非特异性扩增，经测序大小为167bp，符合预期大小，表明该引物特异性较好、可信度高，可用于qrt-pcr分析。
48.四、qrt-pcr检测引物的特异性
49.以步骤三所得的cdna为模板，并以上述特异性引物进行qrt-pcr扩增反应，检测上述引物对的特异性。
50.使用quantstudio 6flex(abi，usa)在10μl反应体系中进行qrt-pcr。
51.qrt-pcr扩增的反应体系：0.5μl cdna、5μl sybr premix ex taq ii(takara,日本)、0.2μl正向引物(10μm)、0.2μl反向引物(10μm)和4.1μl ddh2o。
52.qrt-pcr扩增的反应程序：95℃，30秒；95℃，10秒，40个循环；60℃，30秒。在65℃到95℃下采集溶解曲线荧光信号，进行熔解曲线分析，来验证其特异性反应。
53.结果如图2所示，从图2可知，内参基因tf2a表现出单峰熔化曲线，说明引物具有很高的特异性，并且扩增曲线重复性好，qrt-pcr结果准确可靠，可以用于表达稳定性分析(其中δrn指荧光强度)。
54.实施例2豌豆不同组织中的内参基因的筛选
55.包括以下步骤：
56.(1)、分别提取豌豆根、茎、叶片的总rna，利用one-step gdna removal and cdna synthesis supermix(全式金，中国)，反转录合成cdna；
57.(2)、以步骤(1)的cdna为模板，4个候选内参基因act(actin，psat3g166680.1)、h3(histone h3，psat0s1184g0040.1)、tf2a(transcription factor iia，psat5g118600.1)、pp2a(phosphoproteinphosphatase 2a，psat1g039040.1)的荧光定量引物对(表1)进行qrt-pcr扩增反应。
58.表1候选基因的荧光定量引物对
[0059][0060]
qrt-pcr扩增的反应体系：0.5μl cdna、5μl sybr premix ex taq ii(takara,日本)、0.2μl正向引物(10μm)、0.2μl反向引物(10μm)和4.1μl ddh2o。
[0061]
qrt-pcr扩增的反应程序：95℃，30秒；95℃，10秒，40个循环；60℃，30秒。
[0062]
qrt-pcr检测4个候选参考基因的表达水平，所有检测结果见图3。可以看出所有样本中候选参考基因的cq值从h3(21.0)到tf2a(23.6)不等。act的cq值变异最小(0.64)，h3的cq值变异最高(1.17)。
[0063]
(3)、利用bestkeeper，genorm，normfinder和delta ct法，以及reffinder分析软件对4个候选内参基因的稳定性进行评估。
[0064]
稳定性评估步骤如下：
[0065]
(a)、bestkeeper根据标准差sd和变异系数cv值进行排序，分析结果显示，cv
±
sd最低的是act为0.56，表明该基因是最稳定的基因，而h3的cv
±
sd最高，为0.89，是最不稳定的基因。
[0066]
表3 bestkeeper分析候选内参基因
[0067] h3acttf2app2an27272727
geomean[cp]20.9622.0623.5822.94armean[cp]20.9922.0723.5922.96min[cp]19.1620.7422.221.67max[cp]23.6722.8724.624.81stddev[+/-cp]0.890.560.580.72cv[％cp]4.252.532.453.13min[x-fold]-3.48-2.5-2.61-2.41max[x-fold]6.551.752.023.65stddev[+/-x-fold]1.861.471.491.65
[0068]
(b)、delta-ct方法结果如图4，sd值较低的基因表现出较高的表达稳定性，tf2a是所有候选基因中最稳定的基因，其stdev值的平均值最低为0.637，而h3的稳定性最低，stdev值的平均值最高为1.106。
[0069]
(c)、genorm通过计算稳定性值(m)来评价候选参考基因的稳定性，m值最低的基因被认为是最稳定的，结果如图5。对于不同的组织，genorm将tf2a和pp2a作为最佳参考基因对，m值为0.356，而h3是最不稳定的参考基因，m值为0.795。
[0070]
(d)、利用normfinder程序，根据各基因间的变异情况，评价参考基因的稳定性，最稳定的参考基因的稳定性值最低，结果如图6。tf2a被认为是最适合的内参基因，稳定性值最低为0.205。同时，h3是最不稳定的参考基因，稳定值为1.056。
[0071]
(e)、最后，利用reffinder基于上述四个程序的候选参考基因的综合排名，结果如图7和表2所示。
[0072]
表2候选基因的稳定性分析
[0073][0074]
从图7和表2结果可知，tf2a是最稳定的参考基因，稳定性值最低为1.189，h3是最不稳定的参考基因，稳定性值最高，为4.00。
[0075]
综上所述，确定tf2a在不同组织中最稳定，可以作为豌豆不同组织中的内参基因。
[0076]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0077]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：

1.一种豌豆不同组织中的内参基因tf2a，其特征在于，所述内参基因tf2a的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.权利要求1所述的内参基因tf2a在豌豆不同组织mrna的qrt-pcr检测中的应用。3.扩增权利要求1所述内参基因tf2a的特异性引物，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no.2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的反向引物。4.权利要求3所述的特异性引物在豌豆不同组织mrna的qrt-pcr检测中的应用。5.权利要求3所述的特异性引物在制备豌豆不同组织mrna的qrt-pcr检测试剂盒中的应用。6.一种豌豆不同组织mrna的qrt-pcr检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的特异性引物作为内参基因的引物。7.一种豌豆不同组织中的相关基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以豌豆不同组织的cdna为模板，以豌豆tf2a基因作为内参基因，检测相关基因的表达。8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，以豌豆tf2a基因作为内参基因，进行qrt-pcr检测相关基因的表达。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述qrt-pcr以权利要求3所述特异性引物作为内参基因的引物。10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述豌豆不同组织包括根、茎或叶片。

技术总结

本发明公开了一种豌豆不同组织中的内参基因TF2A及其应用，所述内参基因为TF2A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。TF2A基因在豌豆不同组织中表达最稳定，可以作为研究豌豆不同组织基因表达的内参基因。根据其所设计的实时荧光定量PCR引物用于豌豆不同组织基因的基因表达分析，可提高研究的稳定性、可靠性和重复性。可靠性和重复性。可靠性和重复性。