一种ProteinA的残留量检测方法与流程

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一种protein a的残留量检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物蛋白的质量控制领域，具体涉及一种protein a残留量检测样品处理及检测方法。

背景技术：

2.protein a是一种金黄葡萄球菌细胞壁蛋白质，分子量42kd，能够特异性地结合多种免疫球蛋白的fc区段。其可与样品中的抗体分子(人igg
l
、igg2、igg4)特异性结合，具有极高的选择性。因此protein a作为亲和谱的重要介质，广泛应用于fc融合蛋白和单克隆抗体的纯化工艺过程中。尽管protein a通过共价键与亲和配基连接，但在纯化过程中可能会出现少量脱落，成为下游工艺源性杂质，从而影响产品的药理作用和生物学活性，并且protein a具有免疫原性，有促进有丝分裂的作用，所以控制其残留水平是保证药物安全性的一项重要指标。who、ich、fda和《中国药典》等均严格规定了protein a蛋白质可接受的水平。
3.elisa是目前应用最广泛的protein a残留量检测方法。该方法相对简单，精良度好，方便设定控制范围和建立技术规范。目前已经有多种商品化的elisa试剂盒可以用于protein a残留量的检测，还可以通过自制多克隆抗体进行检测。虽然目前的检测方法给protein a残留量的检测原理和方法提供了一种通行的指引，但是很少有人关注到检测样品处理对检测结果的影响。如因protein a具有能够结合igg分子的特点，从而阻碍其与相应检测抗体的结合，常常造成检测结果的不准确，因此检测样品的处理成为了protein a质量控制的难点。

技术实现要素：

4.本发明为了解决现有技术中protein a残留量检测的缺陷，提供了一种回收率高、准确度和精密度好的protein a残留量检测方法，包括：
5.1)将待测蛋白样品溶液经过还原处理；
6.2)通过elisa对步骤1)所述的样品溶液进行protein a残留量检测。
7.其中，还原所采用的还原剂选自二硫苏糖醇、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐或β-巯基乙醇，优选二硫苏糖醇或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐。
8.其中所述蛋白可以为本领域已知的包含抗体、蛋白或多肽产品，也可以是本领域技术人员根据已知的生物学方法进行构建以及通过cho细胞生产获得的蛋白。优选的，所述蛋白含有fc片段的融合蛋白，例如康柏西普或阿柏西普；在一个具体的实施例中，本发明所述的蛋白为康柏西普，具有如seq id no:1所述的氨基酸序列。
9.在一些优选实施例中，本发明所述的蛋白样品溶液的浓度为0.1mg/ml-1.0mg/ml，优选0.2-0.5mg/ml。
10.在一个具体的实施方案中，本发明所述的检测方法，步骤2)中，首先用protein a捕获抗体包被微孔板，然后将步骤1)中的待测样品溶液加入微孔板形成抗体-抗原复合物，
再将生物素化的protein a抗体加入抗体-抗原复合物中，形成抗体-抗原-生物素化的抗体复合物，然后加入辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素，形成抗体-抗原-生物素化的抗体-辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素复合物，孵育后加入显液进行显，加入终止液终止反应，在450nm进行读数，通过protein a标准曲线计算待测样品溶液中的protein a含量。
11.在一个具体的实施方案中，显液为3,3,5,5-四甲基联苯胺。
12.在一个具体的实施方案中，本发明所述的检测方法包括：
13.1)将浓度为0.2-0.5mg/ml的蛋白样品溶液加入二硫苏糖醇或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行还原处理；
14.2)首先用protein a捕获抗体包被微孔板，然后将步骤1)中的待测样品溶液加入微孔板形成抗体-抗原复合物，再将生物素化的protein a抗体加入抗体-抗原复合物中，形成抗体-抗原-生物素化的抗体复合物，然后加入辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素，形成抗体-抗原-生物素化的抗体-辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素复合物，孵育后加入显液进行显，加入终止液终止反应，在450nm进行读数，通过protein a标准曲线计算待测样品溶液中的protein a含量。
15.本发明的技术效果在于通过大量的实验摸索提供了一种样品前处理简单、专属性强、准确度高、重复性好的protein a残留量检测方法，对蛋白的质量控制具有重要意义。
具体实施方式
16.本发明通过以下实施例对本发明的内容作进一步的详细说明，并不能用于限制本发明的保护范围。
17.本技术所用试剂及仪器：
18.protein a elisa kit(enzo life sciences，cat:adi-900-057)
19.ides酶(promega，cat:v7511)
20.rapigestsf(waters，cat:186008090)
21.二硫苏糖醇(ge，17-1318-01)
22.磷酸三钠(分析纯)
23.氯化钠(分析纯)
24.tritonx-100(sigma，x100-100ml)仪器设备
25.酶标仪(spectraxmaxi3x)
26.实施例1专属性实验
27.取康柏西普原液缓冲液(自制，不含康柏西普蛋白，辅料含有柠檬酸、蔗糖、精氨酸)，采用protein a elisa kit试剂盒(enzo life sciences)样品稀释液(assay buffer 13)稀释3.3倍(按蛋白浓度10mg/ml进行稀释，记为样品1、2、3)及6.6倍(按蛋白浓度20mg/ml进行稀释，记为样品4、5、6)，各做3个平行样品。然后按试剂盒操作步骤进行protein a残留量检测，其中试剂盒操作步骤为：样品溶液于沸水中煮沸5min后室温冷却5～7min，13800g离心4min，取上清加入试剂盒酶标板(酶标板被protein a抗体包被)，100μl/孔，室温500rpm震荡孵育1h；洗板后加入生物素化的protein a抗体(作为检测抗体)100μl/孔，室温500rpm震荡孵育1h；洗板后加入辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素100μl/孔，室温500rpm震荡孵育0.5h；洗板后加入tmb(3,3,5,5-四甲基联苯胺)显液100μl/孔，室温
500rpm震荡孵育15min后加终止液(盐酸溶液)100μl/孔，终止反应；450nm读数。根据标准曲线计算protein a含量，结果如表1。
28.protein a标准曲线制备：取protein a标准品，用试剂盒稀释液(assay buffer13)稀释至1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml、15.6pg/ml；然后按照上述试剂盒操作步骤，测定不同浓度下protein a标准品在450nm的读数，并制定protein a标准曲线。
29.表1
[0030][0031]
实验结果显示，康柏西普蛋白原液缓冲液不同浓度条件下的3个平行样品的检测结果均未检出protein a，表明蛋白原液缓冲液对方法无明显干扰。
[0032]
实施例2样品溶液不经前处理直接检测
[0033]
采用protein a elisa kit(enzo，adi-900-057)中样品稀释液(assay buffer 13)将康柏西普原液(10.9mg/ml)稀释至1.0mg/ml，分别取稀释后的原液300μl，加入样品稀释液6μl，分别加入不同浓度protein a标准品(protein a standard，10000pg/ml)，37℃孵育50min。再按试剂盒操作步骤进行操作，计算protein a含量，并按下式计算protein a加标回收率：
[0034][0035]
其中：
[0036]
原液加标检测值为康柏西普原液加入protein a标准品后经检测计算得到的protein a含量(浓度)；
[0037]
原液检测值为康柏西普原液(未加入protein a标准品)经检测计算得到的protein a含量(浓度)；
[0038]
理论加标量为加入的protein a标准品浓度。
[0039]
检测结果如表2。
[0040]
表2
13)将康柏西普原液(10.9mg/ml)稀释至0.025mg/ml或0.01mg/ml，分别加入ides酶酶切，表面活性剂rapigest sf(5％)或tritonx-100(5％)至终浓度0.08％，protein a标准品5μl，37℃酶切20min或60min。再按试剂盒操作步骤进行protein a含量检测，计算protein a加标回收率，结果如表4所示。
[0050]
表4
[0051][0052][0053]
上述结果表明，添加表面活性剂进行变性处理，进一步破坏康柏西普蛋白结构，protein a蛋白的加标回收率在60％附近，且添加相同浓度的两种表面活性剂rapigest sf和tritionx-100加标回收率差异较小。
[0054]
实施例5样品溶液经还原后进行检测
[0055]
采用试剂盒样品稀释液(assay buffer 13)将康柏西普原液(11.0mg/ml)分别稀释至1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml，分别取稀释后的原液150μl，加入protein a标准品(protein a standard，10000pg/ml)10μl，再加入1m dtt 10μl(dtt终浓度60mm)，室温静置10min，或加入1m tcep-hcl(三(2-羰基乙基)磷盐酸盐)至终浓度18mm，室温静置10min；再用试剂盒样品稀释液(assay buffer13)将样品稀释8倍，按试剂盒操作步骤进行protein a含量检测(其中煮沸时间为10min，加样孵育时间2h)，计算protein a加标回收率，结果如表5所示。
[0056]
表5
[0057][0058]
实验结果表明，蛋白样品溶液经过还原处理后进行检测，protein a回收率均有所提升，高于76％。尤其当蛋白浓度为0.2l-0.5mg/m条件下，protein a加标回收率为86.8～100.6％，且dtt与tcep-hcl加标回收率差异较小，均可作为优选还原剂使用。
[0059]
实施例6重复性和准确度验证
[0060]
分别取康柏西普原液(11.0mg/ml)加入protein a标准品(protein a standard，10000pg/ml)，加入试剂盒样品稀释液(assaybuffer13)使康柏西普蛋白终浓度为0.2mg/ml，再加入1mdtt 10μl(dtt终浓度60mm)，室温静置10min。再用试剂盒样品稀释液(assay buffer13)将样品稀释8倍，按试剂盒操作步骤进行protein a含量检测(其中煮沸时间为10min，加样孵育时间2h)，计算protein a加标回收率，结果如表6。
[0061]
表6
[0062][0063]
实验结果显示，不同protein a加标浓度样品回收率在90％～110％范围内，各浓度3个平行样品rsd在4％～6％范围内。

技术特征：

1.一种protein a残留量的检测方法，其特征在于所述检测方法包含步骤：1)将待测蛋白样品溶液经过还原处理；2)通过elisa对步骤1)所述的样品溶液进行protein a残留量检测。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述还原所采用的还原剂选自二硫苏糖醇、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐或β-巯基乙醇。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述还原剂选自二硫苏糖醇或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述蛋白为含有fc片段的融合蛋白。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述蛋白为康柏西普或阿柏西普。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述蛋白样品溶液的浓度为0.1mg/ml-1.0mg/ml。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述蛋白样品溶液的浓度为0.2-0.5mg/ml。8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤2)中，首先用protein a捕获抗体包被微孔板，然后将步骤1)中的待测样品溶液加入微孔板形成抗体-抗原复合物，再将生物素化的protein a抗体加入抗体-抗原复合物中，形成抗体-抗原-生物素化的抗体复合物，然后加入辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素，形成抗体-抗原-生物素化的抗体-辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素复合物，孵育后加入显液进行显，加入终止液终止反应，在450nm进行读数，通过protein a标准曲线计算待测样品溶液中的protein a含量。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于显液为3,3,5,5-四甲基联苯胺。10.根据权利要求1-9任一项所述的检测方法，其特征在于检测方法包括：将浓度为0.2-0.5mg/ml的蛋白样品溶液加入二硫苏糖醇或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行还原处理；2)首先用protein a捕获抗体包被微孔板，然后将步骤1)中的待测样品溶液加入微孔板形成抗体-抗原复合物，再将生物素化的protein a抗体加入抗体-抗原复合物中，形成抗体-抗原-生物素化的抗体复合物，然后加入辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素，形成抗体-抗原-生物素化的抗体-辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素复合物，孵育后加入显液进行显，加入终止液终止反应，在450nm进行读数，通过protein a标准曲线计算待测样品溶液中的protein a含量。

技术总结

本发明提供一种ProteinA残留量检测方法，所述方法包括对蛋白样品溶液进行还原处理，然后通过ELISA对蛋白样品溶液进行ProteinA残留量检测，本发明提供了一种样品前处理简单、专属性强、准确度高、重复性好的ProteinA残留量检测方法，对蛋白的质量控制具有重要意义。对蛋白的质量控制具有重要意义。