可活化细胞因子构建体和相关组合物以及方法与流程

可活化细胞因子构建体和相关组合物以及方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年4月10日提交的美国临时申请号63/008,542、2021年3月16日提交的美国临时申请号63/161,889和2021年3月23日提交的美国临时申请号63/164,849的优先权益，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
3.本技术包括以电子格式提交的序列表。序列表命名为“cytx-071-pct_st25.txt”，创建于2021年4月7日，并且大小为379,000字节。电子格式的序列表中的信息是本技术的一部分并以引用的方式整体并入本文。
技术领域
4.本公开涉及生物技术领域，并且更具体地，涉及可活化细胞因子构建体。

背景技术：

5.细胞因子是由大多数有核细胞响应于病毒感染和/或其他抗原刺激而产生和分泌的天然存在的小蛋白和糖蛋白家族。干扰素是细胞因子的一个亚类。干扰素目前分为三大类：i型干扰素、ii型干扰素和iii型干扰素。干扰素通过与细胞表面的特定膜受体结合发挥其细胞活性。
6.干扰素疗法具有许多临床益处。例如，已知干扰素上调免疫系统并且还具有抗病毒和抗增殖特性。这些生物学特性导致干扰素在临床上用作病毒感染和恶性肿瘤的剂。此外，干扰素适用于募集患者的先天免疫系统来鉴别和攻击癌细胞。因此，干扰素疗法已被广泛用于癌症和抗病毒疗法中，包括用于肝炎、卡波西肉瘤(kaposi sarcoma)、毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病(cml)、滤泡性淋巴瘤、肾细胞癌(rcc)、黑素瘤和其他疾病状态。然而，干扰素的全身施用伴随着剂量依赖性毒性，包括强烈的流感样症状、神经系统症状、肝毒性、骨髓抑制和心律失常等。在黑素瘤患者研究中，帕博利珠单抗(pembrolizumab)和聚乙二醇化ifna的组合导致orr为60.5％。组合还与49％的g3/g4不良事件有关，所述不良事件需要减少聚乙二醇化ifna剂量(davar等人,j.clin.oncol.,2018)。这些不希望的副作用限制了干扰素疗法的剂量，并且有时会导致干扰素的中断或延迟。
7.白介素是细胞因子的另一个亚类。白介素调节细胞生长、分化和运动。它们在刺激免疫反应(诸如炎症)方面特别重要。白介素已被用于癌症、自身免疫性病症和其他病症。例如，白介素2(il2)被指出用于黑素瘤、移植物抗宿主病(gvhd)、神经母细胞瘤、肾细胞癌(rcc)，并且也被认为适用于包括以下的病状：急性冠脉综合征、急性骨髓性综合征、特应性皮炎、自身免疫性肝病、基底细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、念珠菌病(candidiasis)、结直肠癌、皮肤t细胞淋巴瘤、子宫内膜异位瘤、hiv发明、缺血性心脏病、类风湿性关节炎、鼻咽腺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、卵巢癌、胰腺癌、系统性红斑狼疮、结核病和其他病症。其他白介素，诸如il-6、il-7、il-12和il-21等，是癌症和其他病症的潜在剂。白介素疗法通常伴有不希望的副作用，包括流感样症状、恶心、呕吐、腹泻、低血压和心
律失常等。
8.因此，对于细胞因子疗法对所需靶标的改善的特异性和选择性的需要和期望是非常令人感兴趣的。细胞因子剂对疾病位点的靶向增加可降低基于全身机制的毒性并导致更广泛的效用。

技术实现要素：

9.本公开提供了可活化细胞因子构建体(acc)，其包括：(a)第一单体，其包含第一成熟细胞因子蛋白(cp1)、第一可裂解部分(cm1)和第一二聚化结构域(dd1)，其中cm1位于cp1与dd1之间；和(b)第二单体，其包含第二成熟细胞因子蛋白(cp2)、第二可裂解部分(cm2)和第二二聚化结构域(dd2)，其中cm2位于cp2与dd2之间，其中：cm1和cm2充当蛋白酶的底物；dd1和dd2彼此结合；并且其中acc的特征在于与cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平相比，cp1和/或cp2的至少一种活性降低。相对于健康组织，裂解cm1和cm2的蛋白酶可能在患病组织(例如肿瘤组织)中过表达。acc可在cm1和/或cm2裂解后活化，使得细胞因子可在患病组织中(例如在肿瘤微环境中)中发挥其活性，而在健康组织的情况下细胞因子活性减弱。因此，本文提供的acc可提供相对于传统细胞因子剂降低的毒性，使细胞因子的有效剂量更高，并且/或者增加细胞因子的窗口。
10.本文提供了可活化细胞因子构建体(acc)，其包括第一单体构建体和第二单体构建体，其中：(a)第一单体构建体包含第一成熟细胞因子蛋白(cp1)、第一可裂解部分(cm1)和第一二聚化结构域(dd1)，其中cm1位于cp1与dd1之间；并且(b)第二单体构建体包含第二成熟细胞因子蛋白(cp2)、第二可裂解部分(cm2)和第二二聚化结构域(dd2)，其中cm2位于cp2与dd2之间；其中dd1和dd2彼此结合，从而形成第一单体构建体和第二单体构建体的二聚体；并且其中acc的特征在于具有与至少一种cp1和/或cp2活性的对照水平相比降低的至少一种cp1和/或cp2活性水平。
11.本公开提供了可活化细胞因子构建体(acc)，其包括：(a)第一单体，其包含第一成熟细胞因子蛋白(cp1)、第一二聚化结构域(dd1)；和(b)第二单体，其包含第二成熟细胞因子蛋白(cp2)、可裂解部分(cm)和第二二聚化结构域(dd2)，其中cm位于cp2与dd2之间，其中：cm充当蛋白酶的底物；dd1和dd2彼此结合；并且其中acc的特征在于与cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平相比，cp1和/或cp2的至少一种活性降低。
12.本公开提供了可活化细胞因子构建体(acc)，其包括：(a)第一单体，其包含第一成熟细胞因子蛋白(cp1)、可裂解部分(cm)和第一二聚化结构域(dd1)，其中cm位于cp1与dd1之间；和(b)第二单体，其包含第二成熟细胞因子蛋白(cp2)和第二二聚化结构域(dd2)，其中：cm充当蛋白酶的底物；dd1和dd2彼此结合；并且其中acc的特征在于与cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平相比，cp1和/或cp2的至少一种活性降低。
13.本公开提供了可活化细胞因子构建体(acc)，其包括：(a)第一单体，其包含第一成熟细胞因子蛋白(cp1)和第一二聚化结构域(dd1)；和(b)第二单体，其包含第二成熟细胞因子蛋白(cp2)和第二二聚化结构域(dd2)，其中cp1、cp2或cp1和cp2两者包括充当蛋白酶的底物的氨基酸序列；dd1和dd2彼此结合；并且其中acc的特征在于与cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平相比，cp1和/或cp2的至少一种活性降低。
14.本公开的acc的特征在于cp1和cp2不连接到肽掩蔽物，例如亲和掩蔽部分。
15.在一些实施方案中，第一单体构建体包含有包含cp1、cm1和dd1的第一多肽。在一些实施方案中，第二单体构建体包含有包含cp2、cm2和dd2的第二多肽。在一些实施方案中，dd1和dd2是选自由以下组成的组的对：一对fc结构域，来自人类il-15受体α链(il15rα)的寿司结构域(sushi domain)和可溶性il-15；barnase和barnstar；蛋白激酶a(pka)和a激酶锚定蛋白(akap)；基于突变的rna酶i片段的衔接子/对接标签模块；表位和单结构域抗体(sdab)；表位和单链可变片段(scfv)；以及基于蛋白质突触蛋白(synaptin)、突触结合蛋白(synaptotagmin)、小突触小泡蛋白(synaptobrevin)和snap25的相互作用的可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白(snare)模块，抗原结合结构域和表位。
16.在一些实施方案中，dd1和dd2是一对fc结构域。在一些实施方案中，所述一对fc结构域是一对人类fc结构域。在一些实施方案中，人类fc结构域是人类igg1 fc结构域、人类igg2 fc结构域、人类igg3 fc结构域或人类igg4 fc结构域。在一些实施方案中，人类fc结构域是人类igg4 fc结构域。在一些实施方案中，人类fc结构域包含与seq id no:3具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，人类fc结构域各自包含与seq id no:3具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，人类fc结构域各自包含seq id no:3。在一些实施方案中，dd1和dd2相同。例如，dd1和dd2可以是一对相同的人类igg4 fc结构域。在一些实施方案中，二聚化结构域分别具有seq id no:315和316的氨基酸序列。在一些实施方案中，人类fc结构域包括消除糖基化和/或减少fc-γ受体结合的突变。在一些实施方案中，人类fc结构域包含突变n297q、n297a或n297g；在一些实施方案中，人类fc结构域包含位置234和/或235处的突变，例如l235e、或l234a和l235a(在igg1中)，或f234a和l235a(在igg4中)；在一些实施方案中，人类fc结构域是包含突变v234a、g237a、p238s、h268q/a、v309l、a330s或p331s或其组合(全部根据eu编号)的igg2 fc结构域。
17.本领域技术人员已知工程化人类fc结构域的其他实例。其中至少一个氨基酸中的突变导致fc功能降低的ig重链恒定区氨基酸的实例包括但不限于重链恒定区的氨基酸228、233、234、235、236、237、239、252、254、256、265、270、297、318、320、322、327、329、330和331中的突变(均根据eu编号)。突变氨基酸组合的实例也是本领域已知的，诸如但不限于氨基酸234、235和331中的突变组合，诸如l234f、l235e和p331s，或氨基酸318、320和322的组合，诸如e318a、k320a和k322a。
18.工程化fc结构域的其他实例包括f243l/r292p/y300l/v305i/p396 igg1；s239d/i332e igg1；s239d/i332e/a330l igg1；s298a/e333a/k334a；在一个重链中，l234y/l235q/g236w/s239m/h268d/d270e/s298a igg1，并且在相反重链中，d270e/k326d,a330m/k334e igg；g236a/s239d/i332e igg1；k326w/e333s igg1；s267e/h268f/s324t igg1；e345r/e430g/s440y igg1；n297a或n297q或n297g igg1；l235e igg1；l234a/l235a igg1；f234a/l235a igg4；h268q/v309l/a330s/p331s igg2；v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s igg2；m252y/s254t/t256e igg1；m428l/n434s igg1；s267e/l328f igg1；n325s/l328f igg1等。在一些实施方案中，工程化fc结构域包含一个或多个选自由n297a igg1、n297q igg1和s228p igg4组成的组的取代。
19.在一些实施方案中，dd1包含抗原结合结构域并且dd2包含相应表位。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗his标签抗原结合结构域并且其中dd2包含his标签。在一些实施方案中，抗原结合结构域是单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，抗原结合结构域是
单结构域抗体(sdab)。在一些实施方案中，dd1和dd2中的至少一个包含选自由非多肽聚合物和小分子组成的组的二聚化结构域取代基。在一些实施方案中，dd1和dd2包含彼此共价结合的非多肽聚合物。在一些实施方案中，非多肽聚合物是含硫聚乙二醇，并且其中dd1和dd2通过一个或多个二硫键彼此共价结合。在一些实施方案中，dd1和dd2中的至少一个包含小分子。在一些实施方案中，小分子是生物素。在一些实施方案中，dd1包含生物素并且dd2包含抗生物素蛋白。
20.在一些实施方案中，cp1和cp2是成熟细胞因子。在一些实施方案中，cp1和cp2中的每一个包含成熟细胞因子序列并且还包含信号肽(在本文中也称为“信号序列”)。在一些实施方案中，cp1和/或cp2各自单独地选自由以下组成的组：干扰素、白介素、gm-csf、g-csf、lif、osm、cd154、lt-β、tnf-α、tnf-β、4-1bbl、april、cd70、cd153、cd178、gitrl、light、ox40l、tall-1、trail、tweak、trance、tgf-β1、tgf-β1、tgf-β3、epo、tpo、flt-3l、scf、m-csf和msp。cp1和/或cp2可以是野生型人类或非人类动物序列、突变序列、截短序列、杂合序列或包含插入的序列。在一些实施方案中，cp1和cp2相同。在一些实施方案中，cp1和cp2不同，并且本公开包括本文列出的细胞因子蛋白中的任两种的选择和组合。在一些实施方案中，cp1和/或cp2是干扰素。在一些实施方案中，cp1和cp2都是干扰素。在一些实施方案中，cp1和cp2是不同的干扰素。在一些实施方案中，cp1和cp2是相同的干扰素。在一些实施方案中，cp1或cp2是干扰素。在一些实施方案中，cp1和cp2中的一个是干扰素，而cp1或cp2中的另一个是除干扰素之外的细胞因子。在一些方面，一种或两种细胞因子是单体细胞因子。在一些方面，一种或两种干扰素是单体干扰素。在一些方面，cp1或cp2是单体干扰素，而另一个cp1或cp2是不同的细胞因子。在一些方面，cp1和/或cp2包括突变细胞因子序列。在一些方面，cp1和/或cp2包括通用细胞因子序列。在一些方面，cp1和/或cp2包括保留细胞因子活性的截短序列。
21.在一些实施方案中，干扰素是人类野生型成熟干扰素。在一些实施方案中，干扰素可以是i型和ii型干扰素，例如包括但不限于干扰素-α、干扰素-β、干扰素-ω、干扰素-γ和干扰素-τ。在一些实施方案中，干扰素是干扰素-α。在一些实施方案中，干扰素选自由以下组成的组：干扰素α-2a、干扰素α-2b和干扰素α-n3。在一些实施方案中，干扰素是干扰素α-2b。在一些实施方案中，干扰素是突变干扰素。在一些实施方案中，干扰素是突变干扰素，其中内源性蛋白酶裂解位点已通过一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入而失去功能。在一些实施方案中，干扰素是通用细胞因子分子，例如具有不同细胞因子亚型的杂合序列或嵌合细胞因子序列或人源化细胞因子序列。在一些实施方案中，干扰素是通用干扰素分子。在一些实施方案中，干扰素是通用干扰素α，例如干扰素α1和干扰素α2b的杂合物。在一些实施方案中，cp1和/或cp2包含与seq id no:1具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，cp1和/或cp2包含与seq id no:1具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，cp1和/或cp2包含seq id no:1的序列。在一些实施方案中，干扰素是干扰素β。在一些实施方案中，干扰素β选自由干扰素β-1a和干扰素β-1b组成的组。在一些实施方案中，cp1和/或cp2包含ifab结构域。在一些实施方案中，cp1和/或cp2包含白介素。在一些实施方案中，白介素选自由以下组成的组：il-1α、il-1β、il-1ra、il-18、il-2、il-4、il-7、il-9、il-13、il-15、il-3、il-5、il-6、il-11、il-12、il-10、il-20、il-14、il-16和il-17。
no:58)、issgllsgrsani(seq id no:59)、avgllappgglsgrsddh(seq id no:60)、avgllappgglsgrsdih(seq id no:61)、avgllappgglsgrsdqh(seq id no:62)、avgllappgglsgrsdth(seq id no:63)、avgllappgglsgrsdyh(seq id no:64)、avgllappgglsgrsdnp(seq id no:65)、avgllappgglsgrsanp(seq id no:66)、avgllappgglsgrsani(seq id no:67)、issgllsgrsdni(seq id no:68)、avgllappgglsgrsdni(seq id no:69)、glsgrsdnhggavgllapp(seq id no:70)、glsgrsdnhggvhmplgflgp(seq id no:71)、lsgrsdnhggvhmplgflgp(seq id no:72)、issglss(seq id no:73)、pvgytssl(seq id no:74)、dwlywpgi(seq id no:75)、lkaaprwa(seq id no:76)、gpshlvlt(seq id no:77)、lpgglspw(seq id no:78)、mglfseag(seq id no:79)、splplrvp(seq id no:80)、rmhlrslg(seq id no:81)、llapshra(seq id no:82)、gprsfgl(seq id no:83)、gprsfg(seq id no:84)、sargpsrw(seq id no:85)、ggwhtgrn(seq id no:86)、htgrsgal(seq id no:87)、aargpaih(seq id no:88)、rgpafnpm(seq id no:89)、ssrgpayl(seq id no:90)、rgpatpim(seq id no:91)、rgpa(seq id no:92)、ggqpsgmwgw(seq id no:93)、fprplgitgl(seq id no:94)、spltgrsg(seq id no:95)、sagfslpa(seq id no:96)、laplglqrr(seq id no:97)、sggplgvr(seq id no:98)、plgl(seq id no:99)和sgrsdni(seq id no:100)。在一些实施方案中，cm包含选自由以下组成的组的序列：issgllsgrsdnh(seq id no:28)、lsgrsddh(seq id no:33)、issgllsgrsdqh(seq id no:54)、sgrsdni(seq id no:100)和issgllsgrsdni(seq id no:68)。在一些实施方案中，蛋白酶由受试者的肿瘤产生，例如蛋白酶在肿瘤中产生的量比在受试者的健康组织中产生的量更大。在一些实施方案中，受试者已诊断或鉴别为患有癌症。
25.在一些实施方案中，cp1和cm1在第一单体构建体中彼此直接邻接。在一些实施方案中，cm1和dd1在第一单体构建体中彼此直接邻接。在一些实施方案中，cp2和cm2在第二单体构建体中彼此直接邻接。在一些实施方案中，cm2和dd2在第二单体构建体中彼此直接邻接。在一些实施方案中，第一单体构建体包含直接邻接cm1的cp1和直接邻接dd1的cm1，其中cm1包含选自由seq id no 5-100组成的组的序列。在一些实施方案中，第二单体构建体包含直接邻接cm2的cp2和直接邻接dd2的cm2，其中cm2包含选自由seq id no 5-100组成的组的序列。在一些实施方案中，第一单体构建体包含直接邻接cm1的cp1和直接邻接dd1的cm1，其中cm1包含长度不超过13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个氨基酸的序列。在一些实施方案中，第二单体构建体包含直接邻接cm2的cp2和直接邻接dd2的cm2，其中cm2包含长度不超过13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个氨基酸的序列。在一些实施方案中，第一单体构建体和第二单体构建体各自被配置成使得细胞因子(分别为cm1和cm2)直接邻接长度不超过10、9、8、7、6、5或4个氨基酸的可裂解部分(分别为cm1和cm2)，并且可裂解部分直接邻接作为人类igg的fc区的二聚化结构域(分别为dd1和dd2)，其中fc区的n端是铰链区中在n方向至c方向上读取的第一个半胱氨酸残基(例如人类igg1的半胱氨酸226，使用eu编号)。在一些方面，二聚化结构域是其中已缺失上游铰链残基的igg fc区。例如，fc是其中已缺失n端序列epkscdktht(seq id no:516)、erk、elktplgdttht(seq id no:517)或eskygpp(seq id no:518)的变体。
26.在一些实施方案中，第一单体构建体包含至少一个接头。在一些实施方案中，至少一个接头是设置在cp1与cm1之间的接头l1和/或设置在cm1与dd1之间的接头l2。在一些实
施方案中，第二单体构建体包含至少一个接头。在一些实施方案中，至少一个接头是设置在cp2与cm2之间的接头l3和/或设置在cm2与dd2之间的接头l4。在一些实施方案中，第一单体构建体包含接头l1并且第二单体构建体包含接头l3。在一些实施方案中，l1和l3相同。在一些实施方案中，第一单体构建体包含接头l2并且第二单体构建体包含接头l4。在一些实施方案中，l2和l4相同。在一些实施方案中，每个接头具有1个氨基酸至约15个氨基酸的总长度。在一些实施方案中，每个接头具有至少5个氨基酸的总长度。如本文所用，术语“接头”是指肽，所述肽的氨基酸序列不是蛋白酶的底物。
27.在一些实施方案中，第一单体构建体包含至少一个接头，其中每个接头独立地选自由以下组成的组：gssggsggsgg(seq id no:210)；gggs(seq id no:2)；gggsgggs(seq id no:211)；gggsgggsgggs(seq id no:212)；ggggsggggsggggs(seq id no:213)；ggggsggggsggggsggggsggggs(seq id no:214)；ggggsggggs(seq id no:215)；ggggs(seq id no:216)；gs；ggggsgs(seq id no:217)；ggggsggggsggggsgs(seq id no:218)；ggsldpkggggs(seq id no:219)；pkscdkthtcppcpapellg(seq id no:220)；skygppcppcpapeflg(seq id no:221)；gkssgsgsesks(seq id no:222)；gstsgsgkssegkg(seq id no:223)；gstsgsgkssegsgstkg(seq id no:224)；gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no:225)；gstsgsgkpgssegst(seq id no:226)；(gs)n、(ggs)n、(gsggs)n(seq id no:227)、(gggs)n(seq id no:228)、(ggggs)n(seq id no:216)，其中每个n是至少一的整数；ggsg(seq id no:229)；ggsgg(seq id no:230)；gsgsg(seq id no:231)；gsggg(seq id no:232)；gggsg(seq id no:233)；gsssg(seq id no:234)；ggggsggggsggggs(seq id no:213)；ggggsggggsggggsggggs(seq id no:214)；和gstsgsgkpgssegst(seq id no:226)。在一些实施方案中，接头包含序列gggs(seq id no:2)。
28.如本文所用，术语“间隔子”在本文中是指在成熟acc的游离末端(例如信号肽与成熟acc的n端之间)掺入的氨基酸残基或肽。在一些方面，间隔子(或“头部”)可含有谷氨酰胺(q)残基。在一些方面，间隔子中的残基使氨肽酶和/或外肽酶作用降至最低以防止n端氨基酸的裂解。说明性和非限制性间隔子氨基酸序列可包含以下示例性氨基酸序列中的任一种或由其组成：qgqsgs(seq id no:504)；gqsgs(seq id no:505)；qsgs(seq id no:506)；sgs；gs；s；qgqsgqg(seq id no:507)；gqsgqg(seq id no:508)；qsgqg(seq id no:509)；sgqg(seq id no:510)；gqg；qg；g；qgqsgq(seq id no:511)；gqsgq(seq id no:512)；qsgq(seq id no:513)；qgqsg(seq id no:514)；qgqs(seq id no:515)；sgq；gq；和q。在一些实施方案中，间隔子序列可忽略。
29.在一些实施方案中，第一单体构建体在n端至c端方向上包含cp1、cm1和直接或间接连接至cm1的c端的dd1。在一些实施方案中，第一多肽在c端至n端方向上包含cp1、cm1和直接或间接连接至cm1的n端的dd1。在一些实施方案中，第二多肽在n端至c端方向上包含cp2、cm2和直接或间接连接至cm2的c端的dd2。在一些实施方案中，第二多肽在c端至n端方向上包含cp2、cm2和直接或间接连接至cm2的dd2。
30.在一些实施方案中，第一单体构建体在n端至c端方向上包含cp1、任选的接头、cm1、任选的接头和dd1，其中dd1是igg的fc区，其中fc区的n端是铰链区中在n方向至c方向上读取的第一个半胱氨酸残基(例如人类igg1或igg4的半胱氨酸226，使用eu编号)，并且其中cm1和插在cp1与dd1的n端半胱氨酸之间的任何接头具有不超过15、14、13、12、11、10、9、
8、7、6、5或4个氨基酸，优选不超过10个氨基酸，尤其优选不超过7个氨基酸的组合总长度。在一些实施方案中，第二单体构建体在n端至c端方向上包含cp2、任选的接头、cm2、任选的接头和dd2，其中dd2是igg的fc区，其中fc区的n端是铰链区中在n方向至c方向上读取的第一个半胱氨酸残基(例如人类igg1或igg4的半胱氨酸226，使用eu编号)，并且其中cm2和插在cp2与dd2的n端半胱氨酸之间的任何接头具有不超过15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个氨基酸，优选不超过10个氨基酸，尤其优选不超过7个氨基酸的组合总长度。
31.在一些实施方案中，acc是同二聚体，其中第一单体构建体和第二单体构建体相同并且包含seq id no:313的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一单体构建体和第二单体构建体各自包含与seq id no:313具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一单体构建体和第二单体构建体各自在n端至c端方向上包含seq id no:1；包含选自由seq id no:41、seq id no:68和seq id no:100组成的组的氨基酸序列的cm；和二聚化结构域。
32.在一些实施方案中，至少一种cp1和/或cp2活性是如使用表面等离子体共振所确定的cp1和/或cp2对其同源受体的结合亲和力(kd)。例如，当cp1或cp2是干扰素时，同源受体可能是干扰素-α/β受体(ifnar)。在一些实施方案中，至少一种cp1和/或cp2活性是淋巴瘤细胞的增殖水平。在一些实施方案中，至少一种cp1和/或cp2活性是淋巴瘤细胞中jak/stat/isgf3通路活化的水平。在一些实施方案中，至少一种活性是淋巴瘤细胞中分泌的碱性磷酸酶(seap)产生的水平。在一些实施方案中，acc(在暴露于蛋白酶之前)的特征在于与对照水平相比，至少一种cp1和/或cp2活性降低至少2倍。在一些实施方案中，acc的特征在于与对照水平相比，至少一种cp1和/或cp2活性降低至少5倍。在一些实施方案中，acc的特征在于与对照水平相比，cp1和/或cp2的至少一种活性降低至少10倍。在一些实施方案中，acc的特征在于与对照水平相比，至少一种cp1和/或cp2活性降低至少20倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍。在一些实施方案中，cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平是在将acc暴露于蛋白酶之后cp1和/或cp2在acc中的活性。在一些实施方案中，至少一种cp1和/或cp2的对照水平是相应野生型成熟细胞因子的相应cp1和/或cp2活性。
33.在一些实施方案中，acc的特征在于在暴露于蛋白酶之后产生裂解产物，其中裂解产物包含cp1和/或cp2的至少一种活性。在一些实施方案中，cp1和/或cp2的至少一种活性是抗增殖活性。在一些实施方案中，对照水平是野生型成熟细胞因子的ec50值，并且其中ec50(裂解产物)与ec50(野生型对照水平)的比率小于约10、或小于约9、或小于约8、或小于约7、或小于约6、或小于约5、或小于约4、或小于约3、或小于约2、或小于约1.5、或等于约1。在一些实施方案中，裂解产物的ec50与野生型成熟细胞因子的ec50大致相同，证明在裂解后，cp1和/或cp2的活性完全恢复，或几乎完全恢复。
34.本文提供了包含本文所描述的acc中的任一种的组合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。本文还提供了包括至少一剂本文所描述的组合物中的任一种的药盒。
35.本文提供了有需要的受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所描述的acc中的任一种或本文所描述的组合物中的任一种。在一些实施方案中，受试者已被鉴别或诊断为患有癌症。在一些非限制性实施方案中，癌症是卡波西肉瘤、毛细胞白血
病、慢性骨髓性白血病(cml)、滤泡性淋巴瘤、肾细胞癌(rcc)、黑素瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、皮肤t细胞淋巴瘤、鼻咽腺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、卵巢癌、胰腺癌。在一些非限制性实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些非限制性实施方案中，淋巴瘤是伯基特淋巴瘤。
36.本文提供了编码多肽的核酸，所述多肽包含本文所描述的acc中的任一种的cp1和cm1。在一些实施方案中，多肽还包含本文所描述的dd1中的任一种。本文还提供了编码多肽的核酸，所述多肽包含本文所描述的acc中的任一种的cp2和cm2。当单体相同时，本公开提供了编码单体的单一核酸，所述单体二聚化以形成acc。在一些实施方案中，多肽还包含本文所描述的dd2中的任一种。本文还提供了包含本文所描述的核酸中的任一种的载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。本文还提供了包含本文所描述的核酸中的任一种或本文所描述的载体中的任一种的细胞。
37.本文提供了核酸对，所述核酸一起编码包含本文所描述的acc中的任一种的第一单体构建体的cp1和cm1的多肽和包含第二单体构建体的cp2和cm2的多肽。本文还提供了载体对，所述载体一起包含本文所描述的核酸对中的任一个。在一些实施方案中，所述载体对是一对表达载体。本文还提供了包含本文所描述的核酸对中的任一个或本文所描述的载体对中的任一个的细胞。在其他实施方案中，本发明提供了包含载体对的载体。
38.本文提供了产生acc的方法，其包括：在液体培养基中在足以产生acc的条件下培养本文所描述的细胞中的任一种；以及从细胞或液体培养基回收acc。在一些实施方案中，所述方法还包括：分离从细胞或液体培养基回收的acc。在一些实施方案中，所述方法还包括：将分离的acc配制成药物组合物。
39.本文提供了通过本文所描述的方法中的任一种产生的acc。本文还提供了包含本文所描述的acc中的任一种的组合物。本文还提供了本文所描述的组合物中的任一种的组合物，其中所述组合物是药物组合物。本文还提供了包括至少一剂本文所描述的组合物中的任一种的药盒。
40.除非另有限定，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在限制。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目以及其他参考文献以引用的方式整体并入本文。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。
41.本发明的其他特征和优势将根据以下详细描述和附图以及根据权利要求而显而易知。
42.术语“一(a/an)”是指冠词的一个或多个(即至少一个)语法对象。借助于实例，“一细胞”涵盖一个或多个细胞。
43.如本文所用，术语“约”和“大约”当用于修饰数值或范围内指定的量时，表示数值以及与本领域技术人员已知的值的合理偏差。例如在适当的情况下，
±
20％、
±
10％或
±
5％在所述值的预期含义内。
44.浓度、量和其他数值数据可在本文中以范围格式表示或呈现。应理解，使用这种范围格式仅仅是为了方便和简洁，因此应灵活解释为不仅包括明确列举为范围限制的数值，还包括涵盖在所述范围内的所有个别数值或子范围，就好像每个数值和子范围都被明确列
举一样。作为说明，“约0.01至2.0”的数值范围应解释为不仅包括明确列举的约0.01至约2.0的值，而且还包括指定范围内的个别值和子范围。因此，包括在所述数值范围内的是诸如0.5、0.7和1.5的个别值，以及诸如0.5至1.7、0.7至1.5和1.0至1.5等的子范围。此外，这种解释应适用于任何情况范围的广度或所描述的特征。另外，应注意所有百分比均以重量计，除非另有说明。
45.在理解本公开的范围时，如本文所用，术语“包括”或“包含”和它们的派生词旨在为指定所陈述的特征、元件、组分、组、整数和/或步骤的存在，但不排除存在其他未陈述的特征、元件、组分、组、整数和/或步骤的开放式术语。上述内容还适用于具有类似含义的词语，诸如术语“包括”、“具有”和它们的派生词。如本文所用，术语“组成”和它的派生词旨在为指定所陈述的特征、元件、组分、组、整数和/或步骤的存在，但排除其他未陈述的特征、元件、组分、组、整数和/或步骤的存在的封闭式术语。如本文所用，术语“基本上由
……
组成”旨在指定所陈述的特征、元件、组分、组、整数和/或步骤以及不会对特征、元件、组分、组、整数和/或步骤的一个或多个基本和新颖特征产生实质性影响的那些特征、元件、组分、组、整数和/或步骤的存在。应理解，对这些过渡术语中的任一个(即“包括”、“组成”或“基本上组成”)的引用提供了对替换未具体使用的其他过渡术语中的任一个的直接支持。例如，将术语从“包含”修改为“基本上由
……
组成”或“由
……
组成”将得到直接支持，因为所述定义适用于在本公开中通篇所公开的任何元件。基于所述定义，本文所公开的或以引用的方式并入的任何元件可包括在要求保护的发明中或从所述发明排除。
46.如本文所用，为方便起见，多个化合物、元件或步骤可呈现在共同列表中。然而，这些列表应解释为好像列表的每个成员都被个别地鉴别为单独的和唯一的成员。因此，在没有相反的指示的情况下，所述列表的任何个别成员均不应仅基于其在一个共同组中的呈现而被解释为事实上等同于同一列表中的任何其他成员。
47.此外，某些分子、构建体、组合物、元件、部分、赋形剂、病症、病状、特性、步骤等可在一个具体实施方案或方面的上下文中或在本公开的单独段落或章节中讨论。应理解，这仅仅是为了方便和简洁，并且任何这样的公开同样适用于并且旨在与在本公开和权利要求中的任何地方发现的任何其他实施方案或方面相结合，所有这些在提交日都形成了申请和要求保护的发明。例如，关于构建体、组合物或方法所描述的构建体、分子、方法步骤、药盒或组合物的列表旨在并且确实到了对与本公开的任何其他部分所描述的构建体、组合物、制剂和方法相关的实施方案的直接支持，即使那些方法步骤、活性剂、药盒或组合物未在所述实施方案或方面的上下文或章节中重新列出。
48.除非另有说明，否则“编码蛋白质的核酸序列”包括彼此为简并形式并因此编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
49.当提及多肽初级氨基酸序列中第一结构域或序列相对于第二结构域或序列的位置时，术语“n端定位”意指第一结构域或序列比第二个结构域或序列更靠近多肽初级氨基酸序列的n端。在一些实施方案中，在第一结构域或序列与第二结构域或序列之间可能存在额外的序列和/或结构域。
50.当提及多肽初级氨基酸序列中第一结构域或序列相对于第二结构域或序列的位置时，术语“c端定位”意指第一结构域或序列比第二个结构域或序列更靠近多肽初级氨基酸序列的c端。在一些实施方案中，在第一结构域或序列与第二结构域或序列之间可能存在
额外的序列和/或结构域。
51.术语“外源”是指从细胞、组织或生物体外部引入或来源于外部的任何材料，所述材料不由引入其的相同细胞、组织或生物体产生或不源自它们。
52.术语“转导的”、“转染的”或“转化的”是指将外源核酸引入或转移到细胞中的过程。“转导的”、“转染的”或“转化的”细胞(例如哺乳动物细胞)是已用外源核酸(例如载体)转导、转染或转化的细胞，所述外源核酸包括编码本文所描述的可活化细胞因子构建体中的任一种的外源核酸。
53.术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)或其组合。除非特别限定，否则所述术语涵盖含有已知的具有与参考核苷酸相似的结合特性的天然核苷酸类似物的核酸。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖互补序列以及明确指定的序列。在本文所描述的核酸中的任一种的一些实施方案中，核酸是dna。在本文所描述的核酸中的任一种的一些实施方案中，核酸是rna。
54.可通过本领域已知的标准技术将修饰引入核苷酸序列，所述技术诸如定点诱变和聚合酶链反应(pcr)介导的诱变。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。在本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和氨酸)、不带电荷的极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)、亲水性氨基酸(例如精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)、疏水性氨基酸(例如丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、氨酸、酪氨酸和缬氨酸)。其他氨基酸家族包括：脂肪族-羟基氨基酸(例如丝氨酸和苏氨酸)、酰胺家族(例如天冬酰胺和谷氨酰胺)、脂肪族家族(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、芳香族家族(例如苯丙氨酸、氨酸和酪氨酸)。
55.如本文所用，短语“特异性结合”或“与
……
免疫反应”意指可活化的抗原结合蛋白复合物与所需靶抗原的一种或多种抗原决定簇反应并且不与其他多肽反应，或以低得多的亲和力(例如约或大于10-6
m)结合。
56.术语“”是指改善病症的至少一种症状。在一些实施方案中，所的病症是癌症并且改善癌症的至少一种症状。
附图说明
57.图1a是说明性可活化细胞因子构建体的示意图，所述可活化细胞因子构建体包含分别通过第一和第二二聚化结构域dd1 140和dd2 190彼此以共价或非共价方式结合的第一单体构建体和第二单体构建体。第一单体构建体从n端至c端包含第一成熟细胞因子蛋白cp1 100、第一任选接头110、第一可裂解部分cm1 120、第二任选接头130和第一二聚化结构域dd1 140。第二单体构建体从n端至c端包含第二成熟细胞因子蛋白cp2 150、第三任选接头160、第二可裂解部分cm2 170、第四任选接头180和第二二聚化结构域dd2 190。
58.图1b是说明性可活化细胞因子构建体的示意图，所述可活化细胞因子构建体包含分别通过第一和第二二聚化结构域dd1 200和dd2 250彼此以共价或非共价方式结合的第
一单体构建体和第二单体构建体。第一单体构建体从n端至c端包含第一二聚化结构域dd1 200、第二任选接头210、第一可裂解部分cm1 220、第一任选接头230和第一成熟细胞因子蛋白cp1 240。第二单体构建体从n端至c端包含第二二聚化结构域dd2 250、第四任选接头260、第二可裂解部分cm2 270、第三任选接头280和第二成熟细胞因子蛋白cp2 290。
59.图2a是说明性可活化细胞因子构建体的示意图，所述可活化细胞因子构建体包含分别通过第一和第二二聚化结构域dd1 340和dd2 390彼此以非共价方式结合的第一单体构建体和第二单体构建体。第一单体构建体从n端至c端包含第一成熟细胞因子蛋白cp1 300、第一任选接头310、第一可裂解部分cm1 320、第二任选接头330和第一二聚化结构域dd1 340。第二单体构建体从n端至c端包含第二成熟细胞因子蛋白cp2 350、第三任选接头360、第二可裂解部分cm2 370、第四任选接头380和第二二聚化结构域dd2 390。
60.图2b是说明性可活化细胞因子构建体的示意图，所述可活化细胞因子构建体包含分别通过第一和第二二聚化结构域dd1 400和dd2 450彼此以非共价方式结合的第一单体构建体和第二单体构建体。第一单体构建体从n端至c端包含第一二聚化结构域dd1 400、第二任选接头410、第一可裂解部分cm1 420、第一任选接头430和第一成熟细胞因子蛋白cp1 440。第二单体构建体从n端至c端包含第二二聚化结构域dd2 450、第四任选接头460、第二可裂解部分cm2 470、第三任选接头480和第二成熟细胞因子蛋白cp2 490。
61.图3提供了说明性可活化细胞因子构建体ifn-α2b-1204dl-higg4(seq id no:309)的氨基酸序列，其中第一单体构建体和第二单体构建体具有相同的氨基酸序列。从n端至c端，第一单体构建体和第二单体构建体的氨基酸序列编码：小鼠信号肽(斜体文本，非粗体)；成熟人类干扰素-α2b(下划线文本)；可裂解部分1204dl(粗体文本)；接头(斜体和粗体文本)；和人类igg4 fc结构域(非斜体、粗体或下划线文本)。
62.图4提供了说明性可活化细胞因子构建体ifn-α2b-1490dni-higg4(seq id no:311)的氨基酸序列，其中第一单体构建体和第二单体构建体具有相同的氨基酸序列。从n端至c端，氨基酸序列编码：小鼠信号肽(斜体文本，非粗体)；成熟人类干扰素-α2b(下划线文本)；可裂解部分1490dni(粗体文本，非斜体)；接头(斜体和粗体文本)；和人类igg4 fc结构域(非斜体、粗体或下划线文本)。
63.图5描绘了可活化细胞因子构建体ifnα-2b-higg4 fc(具有可裂解部分1204dl或可裂解部分1490)和蛋白酶(upa或mt-sp1)的裂解反应，所述裂解反应产生单体成熟ifnα-2b。
64.图6是装载有以下的凝胶的图像：(1)具有可裂解部分1204的acc(1204)；(2)蛋白酶膜型丝氨酸蛋白酶1(mt-sp1)和具有可裂解部分1204的acc ifnα-2b-higg4 fc的产物(1204mt-sp1)；(3)具有可裂解部分1204的acc ifnα-2b-higg4 fc和蛋白酶upa的产物(1204upa)；(4)具有与5个氨基酸的接头融合的可裂解部分1204的acc ifnα-2b-higg4 fc(1204+1)；(5)ifnα-2b-higg4 fc 1204+1和mt-sp1的产物(1204+1mt-sp1)；(6)具有可裂解部分1490的acc ifnα-2b-higg4 fc；(7)mt-sp1和具有可裂解部分1490的acc ifnα-2b-higg4 fc的产物；upa和具有可裂解部分1490的acc ifnα-2b-higg4 fc的产物(1490upa)。
65.图7提供了基于hek293细胞的报道基因测定的结果，所述测定评估了(聚乙二醇干扰素α-2b)和各种干扰素α-2b(ifna2b)融合物的干扰素-α2b活性：n端融合至ifna2b的人类igg4(ifna2b nhg4)；通过五个氨基酸的接头n端融合至ifna2b的人类igg4
(ifna2b 5aa nhg4)；可活化细胞因子构建体ifn-α2b-1204dl-higg4(ifna2b 1204dnidl nhg4)；包括与ifn-α2b-1204dl-higg4相同的组分，但还具有位于成熟细胞因子蛋白组分与可切裂解部分之间的5个氨基酸的接头的可活化细胞因子构建体(ifna2b 5aa 1204dnidl nhg4)；和可活化细胞因子构建体ifn-α2b-1490dni-higg4(ifna2b 1490dni nhg4)。
66.图8a描绘了干扰素-α2b-fc融合物中柔性接头的长度对ec50的影响，如通过基于hek293细胞的报道基因测定所确定的。图8b描绘了干扰素-α2b-fc融合物中连接区(lr)的长度对ec50的影响，如通过基于hek293细胞的报道基因测定所确定的。
67.图9提供了daudi细胞凋亡测定的结果，所述测定确定了和各种ifna2b融合物的抗增殖活性：n端融合至ifna2b的人类igg4(ifna2b nhg4)；通过五个氨基酸的接头n端融合至ifna2b的人类igg4(ifna2b 5aa nhg4)；可活化细胞因子构建体ifn-α2b-1204dl-higg4(ifna2b 1204dnidl nhg4)；包括与ifn-α2b-1204dl-higg4相同的组分，但还具有位于成熟细胞因子蛋白组分与可切裂解部分之间的5个氨基酸的接头的可活化细胞因子构建体(ifna2b 5aa 1204dnidl nhg4)；和可活化细胞因子构建体ifn-α2b-1490dni-higg4(ifna2b 1490dni nhg4)。
68.图10a描绘了干扰素-α2b-fc融合蛋白中接头的长度对ec50的影响，如根据daudi凋亡测定所确定的。图10b描绘了干扰素-α2b-fc融合物中连接区(lr)的长度对ec50的影响，如根据daudi凋亡测定所确定的。
69.图11提供了基于daudi淋巴瘤细胞的测定结果，所述测定用于测量acc(ifna2b 1204dnidl nhg4)；蛋白酶处理的acc(ifna2b 1204dnidl nhg4+upa)；和重组亲本细胞因子(ifna2b)的抗增殖活性。结果表明，在用蛋白酶处理acc后，acc中细胞因子的活性可恢复到与重组亲本细胞因子相当的水平。
70.图12描绘了基于hek293细胞的报道基因测定的结果，所述测定评估了acc(ifna2b 1204dnidl nhg4)；蛋白酶处理的(活化的)acc(ifnα-2b 1204dnidl nhg4+upa)；和重组亲本细胞因子(ifna2b)的活性。结果表明，在用蛋白酶处理acc后，acc中细胞因子的活性可恢复到与重组亲本细胞因子相当的水平。
71.图13描绘了用于测量acc(proc440)、蛋白酶处理的acc(proc440+upa)和干细胞ifna2b的抗增殖活性的基于daudi淋巴瘤细胞的测定结果(上图)和用于测量它们的活性的基于hek293细胞的报道基因测定的结果(下图)。结果表明，通过制备本公开的acc结构，活性降低了1000倍，并且在用蛋白酶处理acc后，acc中细胞因子的活性恢复到与重组亲本细胞因子相当的水平。
72.图14a描绘了proc440的结构，并示出了在cm中的预期位点用upa进行的裂解通过质谱分析得到证实。除了对upa活化敏感之外，proc440还被mmp4裂解。图14b示出了通过质谱的分析，鉴别了在可裂解部分附近的ifna的c末端处(l161处)的mmp14裂解位点。用mmp14进行蛋白酶活化使活性恢复到与重组细胞因子相当的水平。
73.图15描绘了proc440和proc657(n ifna2b 0aa 1204dnidl 0aa igg4 kihss)的结构。acc proc440和proc657、蛋白酶处理的acc(proc440+upa)和干细胞ifna2b的活性使用ifn反应性hek293细胞进行测试。结果表明，与干细胞ifnα-2b或upa活化的proc440相比，proc657的活性降低，但与proc440相比，活性增加。
74.图16(上图)描绘了使用daudi异种移植肿瘤模型，acc proc440在体内的抗增殖作
用。acc proc440以低至0.1mg/kg的剂量诱导肿瘤完全消退并以0.02mg/kg的剂量减缓肿瘤生长.图16(下图)描绘了使用daudi异种移植肿瘤模型，在体内的抗增殖作用。
75.图17a描绘了proc286的结构和在daudi细胞凋亡测定中proc286的活性与的活性的比较。proc286和显示出相似的活性水平，表明proc286可用作对照的替代物，以评价仓鼠研究中ifnα-2b的耐受性。图17b描绘了proc291的结构和在daudi细胞凋亡测定中proc291的活性与的活性的比较。与和proc286相比，proc291的活性明显降低。
76.图18描绘了在体内剂量递增研究(例如以0.08、0.4、2、10、15mg/kg(“mpk”)的递增剂量)中ifna-con(重组干扰素α，一种非天然存在的i型干扰素)、proc440+upa、peg-ifna2b(sylatron)和proc440的比活性和预期毒性剂量。
77.图19描绘了acc proc859通用干扰素的结构(上图)、acc proc859在b16小鼠黑素瘤细测定中的抗增殖作用和acc proc859在ifn反应性hek293测定中的活性。
78.图20a是说明性可活化细胞因子构建体的示意图，所述可活化细胞因子构建体包含分别通过第一和第二二聚化结构域dd1 540和dd2彼此以非共价方式结合的第一单体构建体和第二单体构建体。第一单体构建体从n端至c端包含第一成熟细胞因子蛋白cp1 500、第一任选接头510、第一可裂解部分cm1 520、第二任选接头530和第一二聚化结构域dd1 540。第二单体构建体从n端至c端包含第二成熟细胞因子蛋白cp2 550、第三任选接头560和第二二聚化结构域dd2 590。
79.图20b是说明性可活化细胞因子构建体的示意图，所述可活化细胞因子构建体包含分别通过第一和第二二聚化结构域dd1 600和dd2彼此以非共价方式结合的第一单体构建体和第二单体构建体。第一单体构建体从n端至c端包含第一二聚化结构域dd1 600、第一任选接头630和第一成熟细胞因子蛋白cp1 640。第二单体构建体从n端至c端包含第二二聚化结构域dd2 650、第二任选接头660、可裂解部分cm 670、第三任选接头680和第二成熟细胞因子蛋白cp2 690。
80.图21a是说明性可活化细胞因子构建体的示意图，所述可活化细胞因子构建体包含分别通过第一和第二二聚化结构域dd1 740和dd2彼此以非共价方式结合的第一单体构建体和第二单体构建体。第一单体构建体从n端至c端包含第一成熟细胞因子蛋白cp 700、第一任选接头710、第一可裂解部分cm1 720、第二任选接头730和第一二聚化结构域dd1 740。第二单体构建体从n端至c端包含缺乏细胞因子活性的多肽或蛋白质780和第二二聚化结构域dd2 790。缺乏细胞因子活性的多肽或蛋白质780可以是例如缺乏细胞因子活性的截短的细胞因子蛋白、缺乏细胞因子活性的突变的细胞因子蛋白、残端序列(stub sequence)或以高亲和力与cp 700结合并且与第二部分的对照水平相比降低了第二部分的细胞因子活性的多肽序列。dd1 740和dd2 790可相同或不同。
81.图21b是说明性可活化细胞因子构建体的示意图，所述可活化细胞因子构建体包含分别通过第一和第二二聚化结构域dd1 800和dd2彼此以非共价方式结合的第一单体构建体和第二单体构建体。第一单体构建体从n端至c端包含第一二聚化结构域dd1 800和缺乏细胞因子活性的多肽或蛋白质830。第二单体构建体从n端至c端包含第二二聚化结构域dd2 850、第一任选接头860、可裂解部分cm 870、第二任选接头880和成熟细胞因子蛋白cp。
缺乏细胞因子活性的多肽或蛋白质830可以是例如缺乏细胞因子活性的截短的细胞因子蛋白、缺乏细胞因子活性的突变的细胞因子蛋白、残端序列或以高亲和力与cp 700结合并且与第二部分的对照水平相比降低了第二部分的细胞因子活性的多肽序列。dd1 800和dd2 850可相同或不同。
82.图22显示了当在叙利亚金仓鼠(syrian gold hamster)中的期内给药2mpk、10mpk和15mpk的对照higg4、proc286或proc440时，动物体重减轻。
83.图23显示了在给药2mpk、10mpk和15mpk的对照higg4、proc286或proc440的叙利亚金仓鼠中的临床化学结果(碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶)。
84.图24显示了在给药2mpk、10mpk和15mpk的对照higg4、proc286或proc440的叙利亚金仓鼠中的血液学分析结果(网织红细胞、中性粒细胞和白细胞(wbc)计数)。
85.图25示意性地示出了表示acc的连接区(lr)的acc的实施方案。
具体实施方式
86.本文提供了可活化细胞因子构建体(acc)，其展现出相应细胞因子的至少一种活性的水平降低，但在暴露于活化条件后，产生具有大致上恢复的活性的细胞因子产物。本发明的可活化细胞因子构建体可设计成在暴露于患病组织时选择性活化，而在正常组织中不活化。因此，这些化合物具有赋予基于细胞因子的疗法的益处的潜力，与某些基于细胞因子的疗法相关的毒性可能更小。
87.本文还提供了相关的中间物、组合物、药盒、核酸和重组细胞，以及相关方法，包括使用本文所描述的可活化细胞因子构建体中的任一种的方法和生产它们的方法。
88.本发明人惊奇地发现，具有本文所描述的特定元件和结构取向的acc在提高细胞因子在疗法(特别是对于癌症)中的安全性和指数方面可能有效。虽然细胞因子是先天性和适应性免疫系统的调节物，并且在临床前模型中具有广泛的抗肿瘤活性，但它们的临床成功受到全身性毒性和对靶组织的全身暴露不足的限制。本发明人惊奇地发现，具有本文所描述的特定元件和结构取向的acc似乎降低了与细胞因子剂相关的全身性毒性并提高了对靶组织的靶向和暴露。因此，本公开提供了一种通过向受试者施用具有本文所描述的特定元件和结构取向的acc来减少细胞因子剂的靶标介导的药物处置(target-mediated drug dispos i t ion，tmdd)的方法。因此，本发明解决了所施用的细胞因子剂量中相当大一部分被正常组织隔离的问题，所述问题是在常规细胞因子剂方面限制体循环中可用的剂量部分到达靶组织(例如癌组织)的问题。本发明细胞因子构建体使靶标与肿瘤组织的结合局部化，从而保持效力，减少副作用，提供新的靶标机会，改进已验证靶标的窗口，为不可成药的靶标创建窗口，并提供多种结合方式。本公开能够实现安全和有效的全身递送，从而避免常规全身细胞因子疗法的剂量依赖性毒性，并且还避免了对肿瘤内注射的要求。本公开提供了一种用于赋予局部抗病毒活性、免疫调节活性、抗增殖活性和促细胞凋亡活性的方式。本发明人惊奇地发现，第一单体构建体和第二单体构建体的二聚化实现了细胞因子活性的高度降低，特别是与单个细胞因子连接至二聚化结构域时相比更高的降低。参见图15。
89.另外，本发明人发现细胞因子活性降低的程度可通过改变柔性接头长度或连接区长度来调节。本发明人惊奇地发现，通过将细胞因子经由短的蛋白酶可裂解序列连接至空
间受限的二聚化结构域(诸如在铰链区的第一个半胱氨酸(例如按eu编号来编号的cys226)处被截短的人类igg的fc结构域)，可实现细胞因子活性降低约1,000倍或更多。令人惊讶的是，尽管存在空间限制，但仍发生蛋白酶裂解，并且在从二聚化结构域裂解细胞因子后恢复完全的细胞因子活性。
90.2020年4月10日提交的申请人的美国临时申请号63/008,542描述了某些可活化细胞因子构建体，所述申请以引用的方式整体并入本文。
91.可活化细胞因子构建体
92.本发明的可活化细胞因子构建体是包含第一单体构建体和第二单体构建体的二聚体复合物。通过一对二聚化结构域促进了单体组分的二聚化。一方面，每个单体构建体包括细胞因子蛋白、可裂解部分和二聚化结构域(dd)。一方面，一个单体构建体包括细胞因子蛋白、可裂解部分和dd，而另一个单体构建体包括细胞因子蛋白和dd，但不包括可裂解部分。一方面，一个单体构建体包括细胞因子蛋白、可裂解部分和dd，而另一个单体构建体包括缺乏细胞因子活性的蛋白质或肽和dd，但不包括可裂解部分。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种可活化细胞因子构建体(acc)，其包括第一单体构建体和第二单体构建体，其中：
93.(a)第一单体构建体包含第一成熟细胞因子蛋白(cp1)、第一可裂解部分(cm1)和第一二聚化结构域(dd1)，
94.其中cm1位于cp1与dd1之间；并且
95.(b)第二单体构建体包含第二成熟细胞因子蛋白(cp2)、第二可裂解部分(cm2)和第二二聚化结构域(dd2)，
96.其中cm2位于cp2与dd2之间；
97.其中dd1和dd2彼此结合，从而形成第一单体构建体和第二单体构建体的二聚体；并且
98.其中acc的特征在于具有与至少一种cp1和/或cp2活性的对照水平相比降低的至少一种cp1和/或cp2活性的水平。
99.当用于指细胞因子构建体时，术语“可活化”是指展现出一种或多种活性的第一水平的细胞因子构建体，随之暴露于导致一个或两个可裂解部分裂解的条件，导致产生展现出一种或多种活性的第二水平的细胞因子构建体，其中活性的第二水平大于活性的第一水平。活性的非限制性实例包括本文所描述或本领域已知的细胞因子的示例性活性中的任一种。
100.术语“成熟细胞因子蛋白”在本文中是指缺乏信号序列的细胞因子蛋白。细胞因子蛋白(cp)可以是成熟细胞因子蛋白或具有信号肽的细胞因子蛋白。因此，本公开的acc在一些方面可以包括成熟细胞因子蛋白序列。在一些方面，本公开的acc可以包括成熟细胞因子蛋白序列和另外的信号序列。在一些方面，本公开的acc可以包括本文所公开的序列，其包括或缺乏本文所叙述的信号序列。
101.术语“可裂解部分”和“cm”在本文中可互换地用于指代肽，所述肽的氨基酸序列包含序列特异性蛋白酶的底物。适用作cm1和/或cm2的可裂解部分包括本领域已知的蛋白酶底物中的任一种。下文更详细地描述了示例性可裂解部分。
102.术语“二聚化结构域”和“dd”在本文中可互换地用于指代一对二聚化结构域中的
一个成员，其中所述对中的每个成员能够通过一种或多种共价或非共价相互作用与另一个成员结合。第一dd和第二dd可相同或不同。在下文更详细地描述了适用作dd1和/或dd2的示例性dd。
103.如本文所用，多肽(诸如细胞因子或fc结构域)可以是野生型多肽(例如天然存在的多肽)或野生型多肽的变体。变体可以是通过取代、插入、缺失和/或添加野生型多肽的一个或多个氨基酸而修饰的多肽，前提是变体保留野生型多肽的基本功能或活性。在一些实例中，变体与野生型多肽相比可能具有改变(例如增加或减少)的功能或活性。在一些方面，变体可以是野生型多肽的功能片段。术语“功能片段”意指多肽(例如细胞因子)的序列可包括比全长多肽序列少的氨基酸，但具有足够的多肽链长度以赋予活性(例如细胞因子活性)。
104.第一单体构建体和第二单体构建体可以还包含额外元件，诸如一个或多个接头等。下文更详细地描述了额外元件。第一单体构建体和第二单体构建体中的每一个中的cp、cm和dd组分的组织可以在每个单体构建体中以相同的顺序排列。与相应cp2、cm2和dd2相比，cp1、cm1和dd1组分在例如cp和cm组分(以及在dd组分是多肽的实施方案中的dd组分)的分子量、大小、氨基酸序列等方面可相同或不同。因此，所得二聚体可具有对称或不对称的单体结构组分。
105.在一些实施方案中，第一单体构建体从cp和cm组分的n端至c端包含cp1、cm1和直接或间接(通过接头)连接至cm1的c端的dd1。在其他实施方案中，第一单体构建体从cp和cm组分的c端至n端包含cp1、cm1和直接或间接(通过接头)连接至cm1的n端的dd1。在一些实施方案中，第二单体构建体从cp和cm组分的n端至c端包含cp2、cm2和直接或间接(通过接头)连接至cm2的c端的dd2。在其他实施方案中，第二单体构建体从cp和cm组分的c端至n端包含cp2、cm2和直接或间接(通过接头)连接至cm2的n端的dd2。
106.在某些实施方案中，第一单体构建体和第二单体构建体被取向使得二聚体的每个成员中的组分以相同的顺序从cp和cm组分的n端至c端组织。图1a中提供了说明性acc的示意图。参考图1a，acc从cp和cm组分的n端至c端包含：(1)第一单体构建体，其具有cp1 100；cm1 120，其相对于cp1 100c端定位；任选接头110，其(如果存在的话)定位于cp1 100的c端与cm1 120的n端之间；dd1 140；和任选接头130，其(如果存在的话)定位于cm1 120的c端与dd1 140之间；(2)第二单体构建体，其具有cp2 150；cm2 170，其相对于cp2 150c端定位；任选接头160，其(如果存在的话)定位于cp2 150的c端与cm2 170的n端之间；dd2 190；和任选接头180，其(如果存在的话)定位于cm2 170的c端与dd2 190之间；以及(3)一个或多个共价或非共价键(
←→
)。
107.图1b中提供了另一说明性acc的示意图，其组分以acc的相反取向组织。参考图1b，acc从cp和cm组分的n端至c端包含：(1)第一单体构建体，其具有dd1 200；cm1 220；任选接头210，其(如果存在的话)定位于dd1 200与cm1 220的n端之间；cp1 240，其相对于cm1 220c端定位；和任选接头230，其(如果存在的话)定位于cm1 220的c端与cp1 240的n端之间；(2)第二单体构建体，其具有dd2 250；cm2 270；任选接头260，其(如果存在的话)定位于dd2 250与cm2 270的n端之间；cp2 290，其相对于cm2 270c端定位；和任选接头280，其(如果存在的话)定位于cm2 290的c端与cp2 290的n端之间；以及(3)一个或多个共价或非共价键(
←→
)。
108.图2a是说明性可活化细胞因子构建体的示意图，所述可活化细胞因子构建体包含分别通过第一和第二二聚化结构域dd1 340和dd2 390彼此以非共价方式结合的第一单体构建体和第二单体构建体。第一单体构建体从cp和cm组分的n端至c端包含第一成熟细胞因子蛋白cp1 300、第一任选接头310、第一可裂解部分cm1 320、第二任选接头330和第一二聚化结构域dd1 340。第二单体构建体从n端至c端包含第二成熟细胞因子蛋白cp2 350、第三任选接头360、第二可裂解部分cm2 370、第四任选接头380和第二二聚化结构域dd2 390。
109.图2b是说明性可活化细胞因子构建体的示意图，所述可活化细胞因子构建体包含分别通过第一和第二二聚化结构域dd1 400和dd2 450彼此以非共价方式结合的第一单体构建体和第二单体构建体。第一单体构建体从cp和cm组分的n端至c端包含第一二聚化结构域dd1 400、第二任选接头410、第一可裂解部分cm1 420、第一任选接头430和第一成熟细胞因子蛋白cp1 440。第二单体构建体从cp和cm组分的n端至c端包含第二二聚化结构域dd2 450、第四任选接头460、第二可裂解部分cm2 470、第三任选接头480和第二成熟细胞因子蛋白cp2 490。在替代方面，描绘为cp1 440和cp2 490的两个部分中的一个是缺乏细胞因子活性的截短的细胞因子蛋白。例如，cp1或cp2可以是具有野生型干扰素α2b的前151个氨基酸的截短的干扰素α2b。在替代方面，描绘为cp1 440和cp2 490的两个部分中的一个是缺乏细胞因子活性的突变的细胞因子蛋白。例如，cp1或cp2可以是具有l130p突变的截短的干扰素α2b。在替代方面，描绘为cp1 440和cp2 490的两个部分中的一个是缺乏细胞因子活性的多肽序列，例如信号部分和/或残端序列。在替代方面，描绘为cp1 440和cp2 490的两个部分中的第一个是多肽序列，其以高亲和力与描绘为cp1 440和cp2 490的两个部分中的第二个结合并且与第二部分的对照水平相比降低第二部分的细胞因子活性。
110.发现acc结构非常有效地降低成熟细胞因子蛋白组分的活性，其方式不会导致活化后细胞因子活性明显受损。本文所描述的acc的活化条件是暴露于可裂解acc中的可裂解部分(cm)中的至少一个的蛋白酶。如实例中所证明的，acc的活化导致细胞因子活性的明显恢复。结果表明，在acc的情况下，细胞因子组分的构象未发生不可逆转的改变。重要的是，acc不依赖于必须鉴别和利用对细胞因子蛋白组分具有结合亲和力的肽掩蔽物来实现掩蔽效果。因此，acc不包含对细胞因子蛋白组分具有结合亲和力的肽掩蔽物。本发明人出乎意料地发现，acc结构足以避免细胞因子的脱靶和不希望的活性和/或毒副作用，无需使用任何对细胞因子蛋白组分具有结合亲和力的掩蔽部分。因此，本文所描述的acc的特征在于它们缺乏亲和力掩蔽部分或肽掩蔽部分。
111.acc可使用多种成熟细胞因子蛋白、可裂解部分和dd中的任一种分别作为cp1、cp2、cm1、cm2、dd1和dd2。例如，本领域已知的多种成熟细胞因子蛋白或其序列和/或截短变体中的任一种可能适合用作acc的cp1和cp2组分中的一种或两种。成熟细胞因子蛋白cp1和cp2可相同或不同。在某些具体实施方案中，cp1和cp2相同。在其他实施方案中，cp1和cp2不同。acc可以在cp1和/或cp2的n端和/或c端中的一个或两个处包含额外的氨基酸残基。
112.在一些实施方案中，cp1和/或cp2可各自独立地包含选自下组的成熟细胞因子蛋白：干扰素(诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素τ和干扰素ω)、白介素(诸如il-1α、il-1β、il-1ra、il-18、il-2、il-4、il-7、il-9、il-13、il-15、il-3、il-5、gm-csf、il-6、il-11、il-21)、g-csf、il-12、lif、osm、il-10、il-20、il-14、il-16、il-17、cd154、lt-β、tnf-α、tnf-β、4-1bbl、april、cd70、cd153、cd178、gitrl、light、ox40l、tall-1、trail、tweak、
trance、tgf-β1、tgf-β1、tgf-β3、epoo、tpo、fl t-3l、scf、m-csf和msp等，以及其序列和截短变体。例如，所述蛋白质的序列包括本文示例的那些序列，并且可以从ncbi.nlm.nih.gov/protein获得额外序列。适用于本发明的acc的截短变体包括保留细胞因子活性的任何n端或c端截短的细胞因子。用于本发明的示例性截短变体包括本领域(参见例如slutzki等人,j.mol.biol.360:1019-1030,2006和us 2009/0025106)已知的任何截短的细胞因子多肽，以及保留细胞因子活性的n端和/或c端截短1至约40个氨基酸、1至约35个氨基酸、1至约30个氨基酸、1至约25个氨基酸、1至约20个氨基酸、1至约15个氨基酸、1至约10个氨基酸、1至约8个氨基酸、1至约6个氨基酸、1至约4个氨基酸的细胞因子多肽。在一些前述实施方案中，截短的cp是n端截短的cp。在其他实施方案中，截短的cp是c端截短的cp。在某些实施方案中，截短的cp是c端和n端截短的cp。
113.在一些实施方案中，cp1和/或cp2各自独立地包含与选自由以下组成的组的细胞因子参考序列具有至少80％同一性(例如至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列：seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106、seq id no:107、seq id no:108、seq id no:109、seq id no:110、seq id no:111、seq id no:112、seq id no:113、seq id no:114、seq id no:115、seq id no:116、seq id no:117、seq id no:118、seq id no:119、seq id no:12、seq id no:121、seq id no:122、seq id no:123、seq id no:124、seq id no:125、seq id no:126、seq id no:127、seq id no:128、seq id no:129、seq id no:130、seq id no:131、seq id no:132、seq id no:133、seq id no:134、seq id no:135、seq id no:136、seq id no:137、seq id no:138、seq id no:139、seq id no:140、seq id no:141、seq id no:142、seq id no:143、seq id no:144、seq id no:145、seq id no:146、seq id no:147、seq id no:148、seq id no:149、seq id no:150、seq id no:151、seq id no:152、seq id no:153、seq id no:154、seq id no:155、seq id no:156、seq id no:157、seq id no:158、seq id no:159、seq id no:160、seq id no:161、seq id no:162、seq id no:163、seq id no:164、seq id no:165、seq id no:166、seq id no:167、seq id no:168、seq id no:169、seq id no:170、seq id no:171、seq id no:172、seq id no:173、seq id no:174、seq id no:175、seq id no:176、seq id no:177、seq id no:178、seq id no:179、seq id no:180、seq id no:181、seq id no:182、seq id no:183、seq id no:184、seq id no:185、seq id no:186、seq id no:187、seq id no:188、seq id no:189、seq id no:190、seq id no:191、seq id no:192、seq id no:193、seq id no:194、seq id no:195、seq id no:196、seq id no:197、seq id no:198、seq id no:199、seq id no:200、seq id no:201、seq id no:202、seq id no:203、seq id no:204、seq id no:205、seq id no:206、seq id no:207、seq id no:208和seq id no:209。序列同一性百分比是指当使用序列比对程序(例如可在互联网上的ncbi网站上公开获得的blast程序组)进行比对时，两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同一性水平。还参见al tschul等人,j.mol.biol.215:403-10,1990。在一些方面，acc包括干扰素α2b突变体，例如，在位置l130处具有突变的干扰素α2b分子，例如l130p突变，如cp1或cp2。在一些方面，acc包括在位置i24、f64、i60、i63、f64、w76、i116、l117、f123或l128或其组合处具有突变的干扰素α2b突变体。例如，干扰素α2b突变体可包括突变i116至t、n或r；l128至n、h或r；i24至
p或q；l117h；或l128t；或其组合。在一些方面，干扰素α2b突变体可包括突变i24q、i60t、f64a、w76h、i 116r和l128n，或其子集。在一些方面，acc包括缺乏细胞因子活性的截短的干扰素α2b分子作为cp1和cp2中的一个。例如，截短的干扰素α2b可由以下组成：干扰素α2b的151个或更少的氨基酸，例如野生型干扰素α2b序列中从n端至c端的1至151、1至150、1至149、1至148
……
1至10、1至9、1至8、1至7、1至6或2至151、3至151、4至151、5至150、6至149、7至148、8至147个氨基酸中的任一个；或所述干扰素的氨基酸或突变体的任何间插序列。
114.在某些具体实施方案中，cp1和/或cp2包含干扰素。适合在本发明的构建体中用作cp1和/或cp2的干扰素包括例如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-ω和干扰素-τ。在一些实施方案中，当干扰素是干扰素α时，其可以是干扰素α-2a、干扰素α-2b或干扰素α-n3。干扰素α的其他实例包括干扰素α-1、干扰素α-4、干扰素α-5、干扰素α-6、干扰素α-7、干扰素α-8、干扰素α-10、干扰素α-13、干扰素α-14、干扰素α-16、干扰素α-17和干扰素α-21。在一些实施方案中，干扰素是重组的或纯化的干扰素α。在某些实施方案中，当干扰素是干扰素-β时，其选自由干扰素β-1a和干扰素β-1b组成的组。在一些实施方案中，cp1和/或cp2包含干扰素α或干扰素β的ifab结构域。ifab结构域负责干扰素的细胞因子释放和抗病毒功能。示例性ifab序列在seq id no:325-334中提供。
115.在一些实施方案中，cp1和/或cp2展现出干扰素活性并包括与选自由以下组成的组的干扰素α参考序列具有至少80％同一性、至少82％同一性、至少84％同一性、至少86％同一性、至少88％同一性、至少90％同一性、至少92％同一性、至少94％同一性、至少96％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103、seq id no:104和seq id no:105。在某些具体实施方案中，干扰素α参考序列是seq id no:1(人类干扰素α-2b)。在一些实施方案中，cp1和/或cp2包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的成熟α干扰素：seq id no:1、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103、seq id no:104和seq id no:105。在某些实施方案中，cp1和/或cp2包含具有seq id no:1的氨基酸序列的成熟人类α干扰素。在一些上述实施方案中，cp1和cp2包含相同的氨基酸序列。
116.在其他实施方案中，cp1和/或cp2展现出干扰素活性并包括与选自由以下组成的组的干扰素β参考序列具有至少80％同一性、至少82％同一性、至少84％同一性、至少86％同一性、至少88％同一性、至少90％同一性、至少92％同一性、至少94％同一性、至少96％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列：seq id no:106、seq id no:107、seq id no:108和seq id no:109。在某些实施方案中，干扰素β参考序列是选自由seq id no:106和seq id no:107组成的组的人类干扰素β参考序列。在一些实施方案中，cp1和/或cp2包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的成熟β干扰素：seq id no:106、seq id no:107、seq id no:108和seq id no:109。在一些上述实施方案中，cp1和cp2包含相同的氨基酸序列。
117.在一些实施方案中，cp1和/或cp2展现出干扰素活性并包括与对应于seq id no:110(人类干扰素ω)的干扰素ω参考序列具有至少80％同一性、至少82％同一性、至少84％同一性、至少86％同一性、至少88％同一性、至少90％同一性、至少92％同一性、至少94％同一性、至少96％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。在某些具体实施方案中，cp1和/或cp2包含具有seq id no:110的氨基酸序列的成熟人类ω
id no:151(人类il-10)、seq id no:153(人类il-20)、seq id no:155(人类il-14)、seq id no:157(人类il-16)和seq id no:159(人类il-17)。在一些上述实施方案中，cp1和cp2包含相同的氨基酸序列。
120.所使用的细胞因子蛋白的序列中的氨基酸数量可能有所不同，这取决于所使用的具体细胞因子蛋白。在一些实施方案中，cp1和/或cp2包括总计约10个氨基酸至约700个氨基酸、约10个氨基酸至约650个氨基酸、约10个氨基酸至约600个氨基酸、约10个氨基酸至约550个氨基酸、约10个氨基酸至约500个氨基酸、约10个氨基酸至约450个氨基酸、约10个氨基酸至约400个氨基酸、约10个氨基酸至约350个氨基酸、约10个氨基酸至约300个氨基酸、约10个氨基酸至约250个氨基酸、约10个氨基酸至约200个氨基酸、约10个氨基酸至约150个氨基酸、约10个氨基酸至约100个氨基酸、约10个氨基酸至约80个氨基酸、约10个氨基酸至约60个氨基酸、约10个氨基酸至约40个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约700个氨基酸、约20个氨基酸至约650个氨基酸、约20个氨基酸至约600个氨基酸、约20个氨基酸至约550个氨基酸、约20个氨基酸至约500个氨基酸、约20个氨基酸至约450个氨基酸、约20个氨基酸至约400个氨基酸、约20个氨基酸至约350个氨基酸、约20个氨基酸至约300个氨基酸、约20个氨基酸至约250个氨基酸、约20个氨基酸至约200个氨基酸、约20个氨基酸至约150个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约80个氨基酸、约20个氨基酸至约60个氨基酸、约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约700个氨基酸、约40个氨基酸至约650个氨基酸、约40个氨基酸至约600个氨基酸、约40个氨基酸至约550个氨基酸、约40个氨基酸至约500个氨基酸、约40个氨基酸至约450个氨基酸、约40个氨基酸至约400个氨基酸、约40个氨基酸至约350个氨基酸、约40个氨基酸至约300个氨基酸、约40个氨基酸至约250个氨基酸、约40个氨基酸至约200个氨基酸、约40个氨基酸至约150个氨基酸、约40个氨基酸至约100个氨基酸、约40个氨基酸至约80个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约700个氨基酸、约60个氨基酸至约650个氨基酸、约60个氨基酸至约600个氨基酸、约60个氨基酸至约550个氨基酸、约60个氨基酸至约500个氨基酸、约60个氨基酸至约450个氨基酸、约60个氨基酸至约400个氨基酸、约60个氨基酸至约350个氨基酸、约60个氨基酸至约300个氨基酸、约60个氨基酸至约250个氨基酸、约60个氨基酸至约200个氨基酸、约60个氨基酸至约150个氨基酸、约60个氨基酸至约100个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约700个氨基酸、约80个氨基酸至约650个氨基酸、约80个氨基酸至约600个氨基酸、约80个氨基酸至约550个氨基酸、约80个氨基酸至约500个氨基酸、约80个氨基酸至约450个氨基酸、约80个氨基酸至约400个氨基酸、约80个氨基酸至约350个氨基酸、约80个氨基酸至约300个氨基酸、约80个氨基酸至约250个氨基酸、约80个氨基酸至约200个氨基酸、约80个氨基酸至约150个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约700个氨基酸、约100个氨基酸至约650个氨基酸、约100个氨基酸至约600个氨基酸、约100个氨基酸至约550个氨基酸、约100个氨基酸至约500个氨基酸、约100个氨基酸至约450个氨基酸、约100个氨基酸至约400个氨基酸、约100个氨基酸至约350个氨基酸、约100个氨基酸至约300个氨基酸、约100个氨基酸至约250个氨基酸、约100个氨基酸至约200个氨基酸、约100个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约700个氨基酸、约150个氨基酸至约650个氨基酸、约150个氨基酸至约600个氨基酸、约150个氨基酸至约550个氨基酸、约150个氨基酸至约500个氨基酸、约150个氨基酸至约450个氨基酸、约150个氨
基酸至约400个氨基酸、约150个氨基酸至约350个氨基酸、约150个氨基酸至约300个氨基酸、约150个氨基酸至约250个氨基酸、约150个氨基酸至约200个氨基酸、约200个氨基酸至约700个氨基酸、约200个氨基酸至约650个氨基酸、约200个氨基酸至约600个氨基酸、约200个氨基酸至约550个氨基酸、约200个氨基酸至约500个氨基酸、约200个氨基酸至约450个氨基酸、约200个氨基酸至约400个氨基酸、约200个氨基酸至约350个氨基酸、约200个氨基酸至约300个氨基酸、约200个氨基酸至约250个氨基酸、约250个氨基酸至约700个氨基酸、约250个氨基酸至约650个氨基酸、约250个氨基酸至约600个氨基酸、约250个氨基酸至约550个氨基酸、约250个氨基酸至约500个氨基酸、约250个氨基酸至约450个氨基酸、约250个氨基酸至约400个氨基酸、约250个氨基酸至约350个氨基酸、约250个氨基酸至约300个氨基酸、约300个氨基酸至约700个氨基酸、约300个氨基酸至约650个氨基酸、约300个氨基酸至约600个氨基酸、约300个氨基酸至约550个氨基酸、约300个氨基酸至约500个氨基酸、约300个氨基酸至约450个氨基酸、约300个氨基酸至约400个氨基酸、约300个氨基酸至约350个氨基酸、约350个氨基酸至约700个氨基酸、约350个氨基酸至约650个氨基酸、约350个氨基酸至约600个氨基酸、约350个氨基酸至约550个氨基酸、约350个氨基酸至约500个氨基酸、约350个氨基酸至约450个氨基酸、约350个氨基酸至约400个氨基酸、约400个氨基酸至约700个氨基酸、约400个氨基酸至约650个氨基酸、约400个氨基酸至约600个氨基酸、约400个氨基酸至约550个氨基酸、约400个氨基酸至约500个氨基酸、约400个氨基酸至约450个氨基酸、约450个氨基酸至约700个氨基酸、约450个氨基酸至约650个氨基酸、约450个氨基酸至约600个氨基酸、约450个氨基酸至约550个氨基酸、约450个氨基酸至约500个氨基酸、约500个氨基酸至约700个氨基酸、约500个氨基酸至约650个氨基酸、约500个氨基酸至约600个氨基酸、约500个氨基酸至约550个氨基酸、约550个氨基酸至约700个氨基酸、约550个氨基酸至约650个氨基酸、约550个氨基酸至约600个氨基酸、约600个氨基酸至约700个氨基酸、约600个氨基酸至约650个氨基酸或约650个氨基酸至约700个氨基酸。在一些实施方案中，cp1和/或cp2是成熟野生型人类细胞因子蛋白。
121.acc的每个单体构建体可使用多种二聚化结构域中的任一个。合适的dd包括聚合物(例如合成聚合物、多肽、多核苷酸等)和小分子(分子量小于约1千道尔顿，并且有时小于约800道尔顿的非聚合部分)型部分。dd对可以是本领域已知彼此结合的任何一对部分。
122.例如，在一些实施方案中，dd1和dd2是选自下组的一对成员：来自人类il-15受体α链(il15rα)的寿司结构域和可溶性il-15；barnase和barns tar；pka和akap；基于突变的rna酶i片段的衔接子/对接标签分子；一对抗原结合结构域(例如一对单结构域抗体)；基于蛋白质突触蛋白、突触结合蛋白、小突触小泡蛋白和snap25的相互作用的可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(snare)模块；单结构域抗体(sdab)和相应表位；抗原结合结构域(例如单链抗体(诸如单链可变片段(scfv))、单结构域抗体等)和相应表位；卷曲螺旋多肽结构(例如fos-jun卷曲螺旋结构、酸/碱卷曲螺旋线、glu-lys卷曲螺旋线、亮氨酸拉链结构)、小分子结合对，诸如生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、胺/醛、凝集素/碳水化合物；可彼此结合的一对聚合物，诸如一对含硫聚合物或含硫醇聚合物(例如一对fc结构域、一对硫醇化人类血清白蛋白多肽等)；等等。
123.在一些实施方案中，dd1和dd2是非多肽聚合物。非多肽聚合物可彼此共价结合。在一些实例中，非多肽聚合物可以是含硫聚合物，例如含硫聚乙二醇。在此类情况下，dd1和
dd2可通过一个或多个二硫键彼此共价结合。
124.当dd1和dd2对是一对表位和抗原结合结构域的成员时，表位可以是天然存在或非天然存在的表位。示例性非天然存在的表位包括例如非天然存在的肽，诸如poly-his肽(例如his标签等)。
125.在某些具体实施方案中，dd1和dd2是一对fc结构域。如本文所用，“fc结构域”是指免疫球蛋白的单个重链的连续氨基酸序列。一对fc结构域缔合在一起形成免疫球蛋白的fc区。
126.在一些实施方案中，所述fc结构域对是一对人类fc结构域(例如一对野生型人类fc结构域)。在一些实施方案中，人类fc结构域是人类igg1 fc结构域(例如野生型人类igg1 fc结构域)、人类igg2fc结构域(例如野生型人类igg2 fc结构域)、人类igg3 fc结构域(例如野生型人类igg3 fc结构域)或人类igg4 fc结构域(例如野生型人类igg4 fc结构域)。在一些实施方案中，人类fc结构域包含与seq id no:3具有至少80％同一性(例如至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。
127.在一些实施方案中，所述fc结构域对包含fc结构域的杵状(knob)突变体和臼状(hole)突变体。杵状和臼状突变体可彼此相互作用以促进二聚化。在一些实施方案中，杵状和臼状突变体可在两个fc结构域之间的界面内(例如在ch3结构域中)包含一个或多个氨基酸修饰。在一个实例中，修饰包含一条抗体重链中的氨基酸取代t366w和任选氨基酸取代s354c，以及另一条抗体重链中的氨基酸取代t366s、l368a、y407v和任选y349c(根据kabat编号系统的eu索引进行编号)。杵状和臼状突变体的实例包括seq id no:315和316的fc突变体，以及美国专利号5,731,168；7,695,936；和10,683,368中所描述的那些突变体，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一个实施方案中，二聚化结构域包含分别与seq id no:315和316具有至少80％同一性(例如至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。
128.在一些实施方案中，dd1和/或dd2还可以包括血清半衰期延长部分(例如结合血清蛋白的多肽，诸如免疫球蛋白(例如igg)或血清白蛋白(例如人类血清白蛋白(hsa))。半衰期延长部分的实例包括六帽gst(谷胱甘肽s-转移酶)谷胱甘肽亲和力、钙调蛋白结合肽(cbp)、strep-tag、纤维素结合结构域、麦芽糖结合蛋白、s-肽标签、几丁质结合标签、免疫反应性表位、表位标签、e2tag、ha表位标签、myc表位、flag表位、au1和au5表位、glu-glu表位、kt3表位、irs表位、btag表位、蛋白激酶-c表位和vsv表位。
129.在一些实施方案中，dd1和/或dd2各自包括总计约5个氨基酸至约250个氨基酸、约5个氨基酸至约200个氨基酸、约5个氨基酸至约180个氨基酸、约5个氨基酸至约160个氨基酸、约5个氨基酸至约140个氨基酸、约5个氨基酸至约120个氨基酸、约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约80个氨基酸、约5个氨基酸至约60个氨基酸、约5个氨基酸至约40个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约250个氨基酸、约10个氨基酸至约200个氨基酸、约10个氨基酸至约180个氨基酸、约10个氨基酸至约160个氨基酸、约10个氨基酸至约140个氨基酸、约10个氨基酸至约120个氨基酸、约10个氨基酸至约100个氨基酸、约10个氨基酸至约80个氨基酸、约10个氨基酸至约60个氨
基酸、约10个氨基酸至约40个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约250个氨基酸、约20个氨基酸至约200个氨基酸、约20个氨基酸至约180个氨基酸、约20个氨基酸至约160个氨基酸、约20个氨基酸至约140个氨基酸、约20个氨基酸至约120个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约80个氨基酸、约20个氨基酸至约60个氨基酸、约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约250个氨基酸、约40个氨基酸至约200个氨基酸、约40个氨基酸至约180个氨基酸、约40个氨基酸至约160个氨基酸、约40个氨基酸至约140个氨基酸、约40个氨基酸至约120个氨基酸、约40个氨基酸至约100个氨基酸、约40个氨基酸至约80个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约250个氨基酸、约60个氨基酸至约200个氨基酸、约60个氨基酸至约180个氨基酸、约60个氨基酸至约160个氨基酸、约60个氨基酸至约140个氨基酸、约60个氨基酸至约120个氨基酸、约60个氨基酸至约100个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约250个氨基酸、约80个氨基酸至约200个氨基酸、约80个氨基酸至约180个氨基酸、约80个氨基酸至约160个氨基酸、约80个氨基酸至约140个氨基酸、约80个氨基酸至约120个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约250个氨基酸、约100个氨基酸至约200个氨基酸、约100个氨基酸至约180个氨基酸、约100个氨基酸至约160个氨基酸、约100个氨基酸至约140个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约250个氨基酸、约120个氨基酸至约200个氨基酸、约120个氨基酸至约180个氨基酸、约120个氨基酸至约160个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约250个氨基酸、约140个氨基酸至约200个氨基酸、约140个氨基酸至约180个氨基酸、约140个氨基酸至约160个氨基酸、约160个氨基酸至约250个氨基酸、约160个氨基酸至约200个氨基酸、约160个氨基酸至约180个氨基酸、约180个氨基酸至约250个氨基酸、约180个氨基酸至约200个氨基酸或约200个氨基酸至约250个氨基酸。在一些实施方案中，dd1和dd2各自是包含铰链区的一部分的fc结构域，所述铰链区包括两个半胱氨酸残基、ch2结构域和ch3结构域。在一些实施方案中，dd1和dd2各自是其n端是铰链区中在n方向至c方向上读取的第一个半胱氨酸残基(例如人类igg1或igg4的半胱氨酸226，使用eu编号)的fc结构域。
130.在一些方面，直接或间接(例如通过接头)位于cp与dd组分之间的是包含蛋白酶底物的可裂解部分。在一些实施方案中，cm1和cm2可各自独立地包含选自由以下组成的组的蛋白酶的底物：adam8、adam9、adam10、adam12、adam15、adam17/tace、ademdec1、adamts1、adamts4、adamts5、bace、肾素、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶14、组织蛋白酶a、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶g、组织蛋白酶k、组织蛋白酶l、组织蛋白酶s、组织蛋白酶v/l2、组织蛋白酶x/z/p、糜酶、cruzipain、desc1、dpp-4、fap、天冬酰胺内肽酶、otuba in-2、弹性蛋白酶、fvi ia、fixa、fxa、fxia、fxi ia、颗粒酶b、胍基苯甲酸酯酶、肝素、htra1、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk10、klk11、klk13、klk14、乳铁蛋白、maraps in、matriptase-2、穿膜肽酶、mt-sp1/matriptase、脑啡肽酶、ns3/4a、pace4、纤溶酶、psma、psa、bmp-1、mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、mmp15、mmp16、mmp17、mmp19、mmp20、mmp23、mmp24、mmp26、mmp27、tmprss2、tmprss3、tmprss4、tpa、凝血酶、类胰蛋白酶和upa。
131.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，裂解本文所描述的cm中的任一种的蛋白酶可以是adam8、adam9、adam10、adam12、adam15、adam17/tace、adamdec1、adamts1、adamts4、adamts5、bace、肾素、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶14、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶k、组织蛋白酶l、组织蛋白酶s、组织蛋白酶v/l2、组织蛋白酶x/z/p、cruzipain、天冬酰胺内肽酶、otubain-2、klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk10、klk11、klk13、klk14、穿膜肽酶、脑啡肽酶、psma、bmp-1、mmp-1、mmp-2、mmp-3、mmp-7、mmp-9、mmp-10、mmp-11、mmp-12、mmp-13、mmp-14、mmp-15、mmp-16、mmp-17、mmp-19、mmp-20、mmp-23、mmp-24、mmp-26、mmp-27、活化蛋白c、组织蛋白酶a、组织蛋白酶g、糜酶、fvi ia、fixa、fxa、fxia、fxi ia、弹性蛋白酶、颗粒酶b、胍基苯甲酸酯酶、htra1、人类中性粒细胞裂解酶、乳铁蛋白、maraps in、ns3/4a、pace4、纤溶酶、psa、tpa、凝血酶、类胰蛋白酶、upa、desc1、dpp-4、fap、肝素、matriptase-2、mt-sp1/matriptase、tmprss2、tmprss3和tmprss4。
132.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，蛋白酶选自由下组：upa、天冬酰胺内肽酶、mt-sp1、adam17、bmp-1、tmprss3、tmprss4、mmp-2、mmp-9、mmp-12、mmp-13和mmp-14。
133.已报道在许多癌症中，具有已知底物的蛋白酶水平升高。参见例如la roca等人,british j.cancer 90(7):1414-1421,2004。适用于本文所用的cm1和/或cm2组分中的底物包括在癌细胞和组织中更普遍存在的那些。因此，在某些实施方案中，cm1和/或cm2各自独立地包含在与癌症相关的患病组织中更普遍存在的蛋白酶的底物。在一些实施方案中，癌症选自由下组：胃癌、乳腺癌、骨肉瘤和食管癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是her2阳性癌症。在一些实施方案中，癌症是卡波西肉瘤、毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病(cml)、滤泡性淋巴瘤、肾细胞癌(rcc)、黑素瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、皮肤t细胞淋巴瘤、鼻咽腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、bcg耐药非肌层浸润性膀胱癌(nmibc)、子宫内膜癌、胰腺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、结直肠癌、食管癌、胆囊癌、胶质瘤、头颈癌、子宫癌、宫颈癌或睾丸癌等。在一些上述实施方案中，cm组分包含在肿瘤组织中更普遍的蛋白酶的底物。
134.在一些实施方案中，cm1和/或cm2各自独立地包括选自由seq id no:5至seq id no:100组成的组的序列，以及其c端和n端截短变体。
135.在一些实施方案中，cm包括选自由下组的序列：issgllsgrsdnh(seq id no:28)、lsgrsddh(seq id no:33)、issgllsgrsdqh(seq id no:54)和issgllsgrsdni(seq id no:68)。
136.在某些实施方案中，cm1和/或cm2包括选自由下组的序列：aprsalahglf(seq id no:263)、aqnllgmy(seq id no:264)、lsgrsdnhggavgllapp(seq id no:265)、vhmplgflgpgglsgrsdnh(seq id no:266)、lsgrsdnhggvhmplgflgp(seq id no:267)、lsgrsdnhggsggsissgllss(seq id no:268)、issgllssggsggslsgrsgnh(seq id no:269)、lsgrsdnhggsggsqnqalrma(seq id no:270)、qnqalrmaggsggslsgrsdnh(seq id no:271)、lsgrsgnhggsggsqnqalrma(seq id no:272)、qnqalrmaggsggslsgrsgnh(seq id no:273)、issgllsgrsgnh(seq id no:274)，以及其c端和n端截短变体。cm的实例还包括在美国专利
申请公开号2016/0289324、2019/0284283和公开号wo 2010/081173、wo 2015/048329、wo 2015/116933、wo 2016/118629和wo 2020/118109中描述的那些，所述公开以引用的方式整体并入本文。
137.适用于cm1和/或cm2中的上述氨基酸序列的截短变体是保留相应蛋白酶识别位点的任何变体。这些变体包括c端和/或n端截短变体，所述c端和/或n端截短变体包含保留蛋白酶识别位点的上述氨基酸序列的至少3个连续氨基酸，或上述氨基酸序列的至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个氨基酸。在某些实施方案中，上述氨基酸序列的截短变体是这样的氨基酸序列，其对应于任何上述氨基酸序列中的任一种，但c端和/或n端截短1至约10个氨基酸、1至约9个氨基酸、1至约8个氨基酸、1至约7个氨基酸、1至约6个氨基酸、1至约5个氨基酸、1至约4个氨基酸或1至约3个氨基酸，并且：(1)具有至少三个氨基酸残基；并且(2)保留蛋白酶识别位点。在一些前述实施方案中，截短的cm是n端截短的cm。在一些实施方案中，截短的cm是c端截短的cm。在一些实施方案中，截短的c是c端和n端截短的cm。
138.在本文所描述的可活化细胞因子构建体中的任一种的一些实施方案中，cm1和/或cm2包含总计约3个氨基酸至约25个氨基酸。在一些实施方案中，cm1和/或cm2包含总计约3个氨基酸至约25个氨基酸、约3个氨基酸至约20个氨基酸、约3个氨基酸至约15个氨基酸、约3个氨基酸至约10个氨基酸、约3个氨基酸至约5个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约25个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸或约20个氨基酸至约25个氨基酸。
139.在一些实施方案中，acc可包含多个包含不同蛋白酶的底物的cm。在一些实施方案中，cm1和cm2包含不同蛋白酶的底物。在一些实施方案中，cm1和cm2包含相同蛋白酶的底物。
140.第一单体构建体和第二单体构建体可包含一种或多种包括一个或多个接头等的额外组分。在一些实施方案中，第一单体可包括设置在cp1与cm1之间的接头。在一些实施方案中，cp1和cm1在第一单体中彼此直接邻接。在一些实施方案中，第一单体包含设置在cm1与dd1之间的接头。在一些实施方案中，接头具有1个氨基酸至约15个氨基酸的总长度。在一些实施方案中，cm1和dd1在第一单体中彼此直接邻接。在一些实施方案中，cm和设置在cp1与dd1之间的任何接头具有3至15个氨基酸、或3至10个氨基酸、或3至7个氨基酸的组合总长度。
141.在一些实施方案中，第二单体包含设置在cp2与cm2之间的接头。在一些实施方案中，cp2和cm2在第二单体中彼此直接邻接。在一些实施方案中，第二单体包含设置在cm2与dd2之间的接头。在一些实施方案中，接头具有1个氨基酸至约15个氨基酸的总长度。在一些实施方案中，接头包含序列gggs(seq id no:2)。在一些实施方案中，cm2(例如本文所描述的可裂解部分中的任一个)和dd2(例如本文所描述的dd中的任一个)在第二单体中彼此直接邻接。在一些实施方案中，cm和设置在cp2与dd2之间的任何接头具有3至15个氨基酸、或3至10个氨基酸、或3至7个氨基酸的组合总长度。
142.在一些实施方案中，第一单体和/或第二单体可包括总计约50个氨基酸至约800个氨基酸、约50个氨基酸至约750个氨基酸、约50个氨基酸至约700个氨基酸、约50个氨基酸至
约650个氨基酸、约50个氨基酸至约600个氨基酸、约50个氨基酸至约550个氨基酸、约50个氨基酸至约500个氨基酸、约50个氨基酸至约450个氨基酸、约50个氨基酸至约400个氨基酸、约50个氨基酸至约350个氨基酸、约50个氨基酸至约300个氨基酸、约50个氨基酸至约250个氨基酸、约50个氨基酸至约200个氨基酸、约50个氨基酸至约150个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约800个氨基酸、约100个氨基酸至约750个氨基酸、约100个氨基酸至约700个氨基酸、约100个氨基酸至约650个氨基酸、约100个氨基酸至约600个氨基酸、约100个氨基酸至约550个氨基酸、约100个氨基酸至约500个氨基酸、约100个氨基酸至约450个氨基酸、约100个氨基酸至约400个氨基酸、约100个氨基酸至约350个氨基酸、约100个氨基酸至约300个氨基酸、约100个氨基酸至约250个氨基酸、约100个氨基酸至约200个氨基酸、约100个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约800个氨基酸、约150个氨基酸至约750个氨基酸、约150个氨基酸至约700个氨基酸、约150个氨基酸至约650个氨基酸、约150个氨基酸至约600个氨基酸、约150个氨基酸至约550个氨基酸、约150个氨基酸至约500个氨基酸、约150个氨基酸至约450个氨基酸、约150个氨基酸至约400个氨基酸、约150个氨基酸至约350个氨基酸、约150个氨基酸至约300个氨基酸、约150个氨基酸至约250个氨基酸、约150个氨基酸至约200个氨基酸、约200个氨基酸至约800个氨基酸、约200个氨基酸至约750个氨基酸、约200个氨基酸至约700个氨基酸、约200个氨基酸至约650个氨基酸、约200个氨基酸至约600个氨基酸、约200个氨基酸至约550个氨基酸、约200个氨基酸至约500个氨基酸、约200个氨基酸至约450个氨基酸、约200个氨基酸至约400个氨基酸、约200个氨基酸至约350个氨基酸、约200个氨基酸至约300个氨基酸、约200个氨基酸至约250个氨基酸、约250个氨基酸至约800个氨基酸、约250个氨基酸至约750个氨基酸、约250个氨基酸至约700个氨基酸、约250个氨基酸至约650个氨基酸、约250个氨基酸至约600个氨基酸、约250个氨基酸至约550个氨基酸、约250个氨基酸至约500个氨基酸、约250个氨基酸至约450个氨基酸、约250个氨基酸至约400个氨基酸、约250个氨基酸至约350个氨基酸、约250个氨基酸至约300个氨基酸、约300个氨基酸至约800个氨基酸、约300个氨基酸至约750个氨基酸、约300个氨基酸至约700个氨基酸、约300个氨基酸至约650个氨基酸、约300个氨基酸至约600个氨基酸、约300个氨基酸至约550个氨基酸、约300个氨基酸至约500个氨基酸、约300个氨基酸至约450个氨基酸、约300个氨基酸至约400个氨基酸、约300个氨基酸至约350个氨基酸、约350个氨基酸至约800个氨基酸、约350个氨基酸至约750个氨基酸、约350个氨基酸至约700个氨基酸、约350个氨基酸至约650个氨基酸、约350个氨基酸至约600个氨基酸、约350个氨基酸至约550个氨基酸、约350个氨基酸至约500个氨基酸、约350个氨基酸至约450个氨基酸、约350个氨基酸至约400个氨基酸、约400个氨基酸至约800个氨基酸、约400个氨基酸至约750个氨基酸、约400个氨基酸至约700个氨基酸、约400个氨基酸至约650个氨基酸、约400个氨基酸至约600个氨基酸、约400个氨基酸至约550个氨基酸、约400个氨基酸至约500个氨基酸、约400个氨基酸至约450个氨基酸、约450个氨基酸至约800个氨基酸、约450个氨基酸至约750个氨基酸、约450个氨基酸至约700个氨基酸、约450个氨基酸至约650个氨基酸、约450个氨基酸至约600个氨基酸、约450个氨基酸至约550个氨基酸、约450个氨基酸至约500个氨基酸、约500个氨基酸至约800个氨基酸、约500个氨基酸至约750个氨基酸、约500个氨基酸至约700个氨基酸、约500个氨基酸至约650个氨基酸、约500个氨基酸至约600个氨基酸、约500个氨基酸至约550个氨基酸、约550个氨基酸至约800个氨基酸、约550
个氨基酸至约750个氨基酸、约550个氨基酸至约700个氨基酸、约550个氨基酸至约650个氨基酸、约550个氨基酸至约600个氨基酸、约600个氨基酸至约800个氨基酸、约600个氨基酸至约750个氨基酸、约600个氨基酸至约700个氨基酸、约600个氨基酸至约650个氨基酸、约650个氨基酸至约800个氨基酸、约650个氨基酸至约750个氨基酸、约650个氨基酸至约700个氨基酸、约700个氨基酸至约800个氨基酸、约700个氨基酸至约750个氨基酸或约750个氨基酸至约800个氨基酸。
143.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，可将一个或多个接头(例如柔性接头)引入可活化细胞因子构建体中，以在结构域之间、部分之间、部分与结构域之间的一或多个接合处，或在接头有益的任何其他接合处提供柔性。在一些实施方案中，在acc作为构象受限的构建体提供的情况下，可插入柔性接头以促进未裂解的可活化细胞因子构建体中结构的形成和维持。本文所描述的接头中的任一个可提供所需的柔性以促进对靶标(例如细胞因子的受体)的结合的抑制，或促进cm被蛋白酶裂解。在一些实施方案中，接头包括在全部或部分柔性的acc中，使得接头可包括柔性接头以及赋予较少柔性结构的一个或多个部分以提供所需acc。一些接头可包括半胱氨酸残基，其可能形成二硫键并降低构建体的柔性。在一些实施方案中，减少接头或连接区的长度会降低acc中成熟细胞因子蛋白的活性(参见例如图8a至图8b和图10a至图10b)。在大多数情况下，接头长度是通过在n方向至c方向上计数从与前一个组分的c端氨基酸相邻的接头的n端至与下一个组分的n端氨基酸邻接的接头的c端的氨基酸的数量来确定(即接头长度不包括前一个组分的c端氨基酸或后一个组分的n端氨基酸)。在其中在包含fc结构域的dd的n端使用接头的实施方案中，接头长度是通过计数从与前一个组分的c端氨基酸邻接的接头的n端至与fc铰链区的第一个半胱氨酸邻接的接头的c端的氨基酸的数量来确定(即接头长度不包括前一个组分的c端氨基酸或fc铰链区的第一个半胱氨酸)。
144.从本公开和图25可以明显看出，本公开的acc包括在cp与二聚结构域之间相互作用的近点之间的一段氨基酸。所述段氨基酸可称为连接区(lr)。如本文所用，术语“连接区”或“lr”是指在细胞因子的c端与n端邻接二聚化结构域之间相互作用的近点的氨基酸残基之间的一段氨基酸残基(即连接区不包括细胞因子的c端氨基酸或dd的n端氨基酸，所述dd与相应第二单体的dd形成相互作用的近点)。例如，当dd是一对fc结构域时，连接区是细胞因子的c端与参与fc的二硫键联的第一个n端半胱氨酸残基之间的一段氨基酸残基(例如igg1或igg4 fc结构域的半胱氨酸226，根据eu编号)。当二聚化结构域不是肽时，则连接区是从细胞因子的c端至最后一个氨基酸的一段氨基酸残基。例如，当dd是生物素-链霉抗生物素蛋白对时，含生物素单体的连接区是细胞因子的c端与生物素分子之间的一段氨基酸残基，而含链霉抗生物素蛋白单体的连接区是细胞因子的c端与链霉抗生物素蛋白分子之间的一段氨基酸残基。在一些方面，连接区可包含不超过24、18、14、12、11、10、9、8、7、6、5或4个氨基酸，例如5至14、7至12或8至11个氨基酸。
145.在一些实施方案中，额外氨基酸序列可位于acc中的任一者的任何结构域的n端或c端。实例包括但不限于靶向部分(例如靶组织中存在的细胞受体的配体)和延长血清半衰期部分(例如结合血清蛋白的多肽，诸如免疫球蛋白(例如igg)或血清白蛋白(例如人类血清白蛋白(hsa))。
146.在本文所描述的可活化细胞因子构建体中的任一种的一些实施方案中，接头可包
括总计约1个氨基酸至约25个氨基酸(例如约1个氨基酸至约24个氨基酸、约1个氨基酸至约22个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约18个氨基酸、约1个氨基酸至约16个氨基酸、约1个氨基酸至约15个氨基酸、约1个氨基酸至约14个氨基酸、约1个氨基酸至约12个氨基酸、约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约8个氨基酸、约1个氨基酸至约6个氨基酸、约1个氨基酸至约5个氨基酸、约1个氨基酸至约4个氨基酸、约1个氨基酸至约3个氨基酸、约1个氨基酸至约2个氨基酸、约2个氨基酸至约25个氨基酸、约2个氨基酸至约24个氨基酸、约2个氨基酸至约22个氨基酸、约2个氨基酸至约20个氨基酸、约2个氨基酸至约18个氨基酸、约2个氨基酸至约16个氨基酸、约2个氨基酸至约15个氨基酸、约2个氨基酸至约14个氨基酸、约2个氨基酸至约12个氨基酸、约2个氨基酸至约10个氨基酸、约2个氨基酸至约8个氨基酸、约2个氨基酸至约6个氨基酸、约2个氨基酸至约5个氨基酸、约2个氨基酸至约4个氨基酸、约2个氨基酸至约3个氨基酸、约4个氨基酸至约25个氨基酸、约4个氨基酸至约24个氨基酸、约4个氨基酸至约22个氨基酸、约4个氨基酸至约20个氨基酸、约4个氨基酸至约18个氨基酸、约4个氨基酸至约16个氨基酸、约4个氨基酸至约15个氨基酸、约4个氨基酸至约14个氨基酸、约4个氨基酸至约12个氨基酸、约4个氨基酸至约10个氨基酸、约4个氨基酸至约8个氨基酸、约4个氨基酸至约6个氨基酸、约4个氨基酸至约5个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约24个氨基酸、约5个氨基酸至约22个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约18个氨基酸、约5个氨基酸至约16个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约14个氨基酸、约5个氨基酸至约12个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约8个氨基酸、约5个氨基酸至约6个氨基酸、约6个氨基酸至约25个氨基酸、约6个氨基酸至约24个氨基酸、约6个氨基酸至约22个氨基酸、约6个氨基酸至约20个氨基酸、约6个氨基酸至约18个氨基酸、约6个氨基酸至约16个氨基酸、约6个氨基酸至约15个氨基酸、约6个氨基酸至约14个氨基酸、约6个氨基酸至约12个氨基酸、约6个氨基酸至约10个氨基酸、约6个氨基酸至约8个氨基酸、约8个氨基酸至约25个氨基酸、约8个氨基酸至约24个氨基酸、约8个氨基酸至约22个氨基酸、约8个氨基酸至约20个氨基酸、约8个氨基酸至约18个氨基酸、约8个氨基酸至约16个氨基酸、约8个氨基酸至约15个氨基酸、约8个氨基酸至约14个氨基酸、约8个氨基酸至约12个氨基酸、约8个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约24个氨基酸、约10个氨基酸至约22个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约18个氨基酸、约10个氨基酸至约16个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约14个氨基酸、约10个氨基酸至约12个氨基酸、约12个氨基酸至约25个氨基酸、约12个氨基酸至约24个氨基酸、约12个氨基酸至约22个氨基酸、约12个氨基酸至约20个氨基酸、约12个氨基酸至约18个氨基酸、约12个氨基酸至约16个氨基酸、约12个氨基酸至约15个氨基酸、约12个氨基酸至约14个氨基酸、约14个氨基酸至约25个氨基酸、约14个氨基酸至约24个氨基酸、约14个氨基酸至约22个氨基酸、约14个氨基酸至约20个氨基酸、约14个氨基酸至约18个氨基酸、约14个氨基酸至约16个氨基酸、约14个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约25个氨基酸、约15个氨基酸至约24个氨基酸、约15个氨基酸至约22个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约15个氨基酸至约18个氨基酸、约15个氨基酸至约16个氨基酸、约16个氨基酸至约25个氨基酸、约16个氨基酸至约24个氨基酸、约16个氨基酸至约22个氨基酸、约16个氨基酸至约20个氨基酸、约16个氨基酸至约18个氨基酸、约18个氨基酸至约25个氨基酸、约18个氨基酸至
约24个氨基酸、约18个氨基酸至约22个氨基酸、约18个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约20个氨基酸至约24个氨基酸、约20个氨基酸至约22个氨基酸、约22个氨基酸至约25个氨基酸、约22个氨基酸至约24个氨基酸或约24个氨基酸至约25个氨基酸)。
147.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，接头包括总计约1个氨基酸、约2个氨基酸、约3个氨基酸、约4个氨基酸、约5个氨基酸、约6个氨基酸、约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约19个氨基酸、约20个氨基酸、约21个氨基酸、约22个氨基酸、约23个氨基酸、约24个氨基酸或约25个氨基酸。
148.出人意料地，本发明人发现在cp与dd之间不包含任何接头的acc展现出相对于野生型成熟细胞因子，最明显的细胞因子活性降低。参见图8a和图10a。此外，cp与dd之间不存在接头的构型仍然允许有效裂解位于cp与dd之间的cm。参见图12至图14。因此，在一些实施方案中，acc在cp与dd之间不包含任何接头，并且cp与dd之间的cm包含不超过10、9、8、7、6、5、4或3个氨基酸。在一些实施方案中，lr中的氨基酸总数包含不超过25个氨基酸，例如不超过25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个氨基酸，或3至10个氨基酸或5至15个氨基酸，或7至12个氨基酸，或从由3至25个氨基酸涵盖的范围内选择的任何范围或指定数目个氨基酸。
149.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，接头可富含甘氨酸(gly或g)残基。在一些实施方案中，接头可富含丝氨酸(ser或s)残基。在一些实施方案中，接头可富含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施方案中，接头具有一个或多个甘氨酸-丝氨酸残基对(gs)(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个gs对)。在一些实施方案中，接头具有一个或多个gly-gly-gly-ser(gggs)序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个gggs序列)。在一些实施方案中，接头具有一个或多个gly-gly-gly-gly-ser(ggggs)序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个ggggs序列)。在一些实施方案中，接头具有一个或多个gly-gly-ser-gly(ggsg)序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个ggsg序列)。
150.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，接头包括以下中的任一种或一种或多种的组合：gssggsggsgg(seq id no:210)、gggs(seq id no:2)、gggsgggs(seq id no:211)、gggsgggsgggs(seq id no:212)、ggggsggggsggggs(seq id no:213)、ggggsggggsggggsggggsggggs(seq id no:214)、ggggsggggs(seq id no:215)、ggggs(seq id no:216)、gs、ggggsgs(seq id no:217)、ggggsggggsggggsgs(seq id no:218)、ggsldpkggggs(seq id no:219)、pkscdkthtcppcpapellg(seq id no:220)、skygppcppcpapeflg(seq id no:221)、gkssgsgsesks(seq id no:222)、gstsgsgkssegkg(seq id no:223)、gstsgsgkssegsgstkg(seq id no:224)和gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no:225)。
151.接头的非限制性实例可包括与gggs(seq id no:2)、gssggsggsgg(seq id no:210)、ggggsggggsggggs(seq id no:213)、ggggsgs(seq id no:217)、ggggsggggsggggsgs(seq id no:218)、ggggsggggsggggsggggs(seq id no:214)、ggsldpkggggs(seq id no:215)和gstsgsgkpgssegst(seq id no:226)具有至少70％同一性(例如至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％或100％同一性)的序列。
152.在一些实施方案中，接头包括选自下组的序列：ggsldpkggggs(seq id no:219)、ggggsggggsggggsgs(seq id no:218)、ggggsgs(seq id no:217)、gs、(gs)n、(ggs)n、(gsggs)n(seq id no:227)and(gggs)n(seq id no:228)、ggsg(seq id no:229)、ggsgg(seq id no:230)、gsgsg(seq id no:231)、gsggg(seq id no:232)、gggsg(seq id no:233)、gsssg(seq id no:234)、ggggsggggsggggs(seq id no:213)、ggggsggggsggggsggggs(seq id no:214)、gstsgsgkpgssegst(seq id no:226)、(ggggs)n(seq id no:216)，其中n是至少一的整数。在一些实施方案中，接头包括选自由以下组成的组的序列：ggsldpkggggs(seq id no:219)、ggggsggggsggggsgs(seq id no:218)、ggggsgs(seq id no:217)和gs。在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，接头包括选自下组的序列：ggggsggggsggggs(seq id no:213)、ggggsggggsggggsggggs(seq id no:214)和gstsgsgkpgssegst(seq id no:226)。在本文所描述的可活化细胞因子构建体中的任一种的一些实施方案中，接头包括选自下组的序列：ggggsggggsggggs(seq id no:213)或ggggs(seq id no:216)。在一些实施方案中，接头包含序列gggs(seq id no:2)。
153.在一些实施方案中，acc可包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如，与本文所描述的或本领域已知的示例性接头序列中的任一种相同或不同的接头序列)。在一些实施方案中，接头包含磺基-siab、smpb和磺基-smpb，其中接头与伯胺巯基反应。
154.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方式中，acc的特征在于与cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平相比，cp1和/或cp2的至少一种活性降低。在一些实施方案中，对照水平可以是重组cp1和/或cp2(例如可商购获得的重组cp1和/或cp2、重组野生型cp1和/或cp2等)的活性水平。在一些实施方案中，对照水平可以是裂解(活化)形式的acc的活性水平。在某些实施方案中，对照水平可以是聚乙二醇化cp1和/或cp2的活性水平。
155.在一些实施方案中，至少一种活性是cp1和/或cp2对其同源受体的结合亲和力(kd)，如使用(例如在25℃的磷酸盐缓冲盐水中进行的)表面等离子体共振所测定的。在某些实施方案中，至少一种活性是淋巴瘤细胞的增殖水平。在其他实施方案中，至少一种活性是淋巴瘤细胞中jak/stat/isgf3通路活化的水平。在一些实施方案中，至少一种活性是淋巴瘤细胞中seap产生的水平。在其他实施方案中，cp1和/或cp2的至少一种活性是使用例如rnaseq方法的细胞因子刺激的基因诱导的水平(参见例如zimmerer等人,clin.cancer res.14(18):5900-5906,2008；hi lkens等人,j.immunol.171:5255-5263,2003)。
156.在一些实施方案中，acc的特征在于与至少一种cp1和/或cp2活性的对照水平相比，至少一种cp1和/或cp2活性降低至少2倍。在一些实施方案中，acc的特征在于与cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平相比，cp1和/或cp2的至少一种活性降低至少5倍。在一些实施方案中，acc的特征在于与cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平相比，cp1和/或cp2的至少一种活性降低至少10倍。在一些实施方案中，acc的特征在于与cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平相比，cp1和/或cp2的至少一种活性降低至少20倍。在一些实施方案中，acc的特征在于与cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平相比，cp1和/或cp2的至少一种活性降低至少30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方案中，acc的特征在于与cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平相比，cp1和/或cp2的
至少一种活性降低至少1倍至20倍、降低200倍至500倍、降低300倍至500倍、降低400倍至500倍、降低500倍至600倍、降低600倍至700倍、降低150倍至1000倍、降低100倍至1500倍、降低200倍至1500倍、降低300倍至1500倍、降低400倍至1500倍、降低500倍至1500倍、降低1000倍至1500倍、降低100倍至1000倍、降低200倍至1000倍、降低300倍至1000倍、降低400倍至1000倍、降低500倍至1000倍、降低100倍至500倍、降低20倍至50倍、降低30倍至50倍、降低40倍至50倍、降低100倍至400倍、降低200倍至400倍或降低300倍至400倍、降低100倍至300倍、降低200倍至300倍或降低100倍至200倍。
157.在一些实施方案中，cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平是在蛋白酶裂解cm1和cm2(“裂解产物”)之后从acc中释放的cp1和/或cp2的活性。在一些实施方案中，cp1和/或cp2的至少一种活性的对照水平是相应野生型成熟细胞因子(例如重组野生型成熟细胞因子)的活性。
158.在一些实施方案中，acc与蛋白酶一起孵育产生活化的细胞因子产物，其中活化的细胞因子产物的cp1和/或cp2的一种或多种活性大于完整acc的cp1和/或cp2的一种或多种活性。在一些实施方案中，活化的细胞因子产物的cp1和/或cp2的一种或多种活性是acc的cp1和/或cp2的一种或多种活性的至少1倍。在一些实施方案中，活化的细胞因子产物的cp1和/或cp2的一种或多种活性是acc的cp1和/或cp2的一种或多种活性的至少2倍。在一些实施方案中，活化的细胞因子产物的cp1和/或cp2的一种或多种活性是acc的cp1和/或cp2的一种或多种活性的至少5倍。在一些实施方案中，活化的细胞因子产物的cp1和/或cp2的一种或多种活性是acc的cp1和/或cp2的一种或多种活性的至少10倍。在一些实施方案中，活化的细胞因子产物的cp1和/或cp2的一种或多种活性是acc的cp1和/或cp2的一种或多种活性的至少20倍。在一些实施方案中，活化的细胞因子产物的cp1和/或cp2的一种或多种活性是acc的cp1和/或cp2的一种或多种活性的至少1倍至20倍、2倍至20倍、3倍至20倍、4倍至20倍、5倍至20倍、10倍至20倍、15倍至20倍、1倍至15倍、2倍至15倍、3倍至15倍、4倍至15倍、5倍至15倍、10倍至15倍、1倍至10倍、2倍至10倍、3倍至10倍、4倍至10倍、5倍至10倍、1倍至5倍、2倍至5倍、3倍至5倍、4倍至5倍、1倍至4倍、2倍至4倍、3倍至4倍、1倍至3倍、2倍至3倍或1倍至2倍。
159.在一些实施方案中，acc可包括与seq id no:309或311具有至少80％(例如至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)同一性的序列。在一些实施方案中，acc可由包括与seq id no:310或312具有至少80％(例如至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)同一性的序列的核酸编码。在一些方面，acc可包括这样的序列，但不包括那些序列的信号序列。没有特别限制信号序列。信号序列的一些非限制性实例包括例如seq id no:309的残基1-20和其他序列中的相应残基和核苷酸，或被来自其他物种或细胞系的信号序列取代。信号序列的其他实例包括mrawiffllclagrala(seq id no:343)和maltfallvallvlscksscsvg(seq id no:344)。
160.这些可活化细胞因子构建体的各种示例性方面在下文描述并且可以在本文提供的方法中以任何组合使用而不受限制。下文描述了可活化细胞因子构建体和制备可活化细胞因子构建体的方法的示例性方面。
161.在一些实施方案中，选择cm以用于与特定蛋白酶一起使用。蛋白酶可以是由肿瘤
细胞产生的蛋白酶(例如肿瘤细胞可以比健康组织表达更多量的蛋白酶)。在一些实施方案中，cm是至少一种选自下组的蛋白酶的底物：adam 17、bmp-1、半胱氨酸蛋白酶(诸如组织蛋白酶)、htra1、天冬酰胺内肽酶、matriptase(mt-sp1)、基质金属蛋白酶(mmp)、中性粒细胞弹性蛋白酶、tmprss(诸如tmprss3或tmprss4)、凝血酶和u型纤溶酶原活化因子(upa，也称为尿激酶)。
162.在一些实施方案中，cm为至少一种基质金属蛋白酶(mmp)的底物。mmp的实例包括mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、mmp15、mmp16、mmp17、mmp19、mmp20、mmp23、mmp24、mmp26和mmp27。在一些实施方案中，cm为mmp9、mmp14、mmp1、mmp3、mmp13、mmp17、mmp11和mmp19的底物。在一些实施方案中，cm是mmp7的底物。在一些实施方案中，cm是mmp9的底物。在一些实施方案中，cm是mmp14的底物。在一些实施方案中，cm是两种或更多种mmp的底物。在一些实施方案中，cm是至少mmp9和mmp14的底物。在一些实施方案中，cm包括同一种mmp的两种或更多种底物。在一些实施方案中，cm包括至少两种或更多种mmp9底物。在一些实施方案中，cm包括至少两种或更多种mmp14底物。
163.在一些实施方案中，cm是mmp的底物并且包括序列issgllss(seq id no:19)；qnqalrma(seq id no:16)；aqnllgmv(seq id no:15)；stfpfgmf(seq id no:18)；pvgytssl(seq id no:74)；dwlywpgi(seq id no:75)；miapvayr(seq id no:42)；rpspmway(seq id no:43)；watprpmr(seq id no:44)；frlldwqw(seq id no:45)；lkaaprwa(seq id no:76)；gpshlvlt(seq id no:77)；lpgglspw(seq id no:78)；mglfseag(seq id no:79)；splplrvp(seq id no:80)；rmhlrslg(seq id no:81)；laaplgll(seq id no:17)；avgllapp(seq id no:14)；llapshra(seq id no:82)；paglwldp(seq id no:20)；和/或issglss(seq id no:73)。
164.在一些实施方案中，cm是凝血酶的底物。在一些实施方案中，cm是凝血酶的底物并且包括序列gprsfgl(seq id no:83)或gprsfg(seq id no:84)。
165.在一些实施方案中，cm包括选自下组的氨基酸序列：ntlsgrsenhsg(seq id no:9)；ntlsgrsgnhgs(seq id no:10)；tstsgrsanprg(seq id no:11)；tsgrsanp(seq id no:12)；vagrsmrp(seq id no:21)；vvpegrrs(seq id no:22)；ilprspaf(seq id no:23)；mvlgrsll(seq id no:24)；qgraitfi(seq id no:25)；sprsimla(seq id no:26)；和smlrsmpl(seq id no:27)。
166.在一些实施方案中，cm是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的底物。在一些实施方案中，cm是丝氨酸蛋白酶的底物。在一些实施方案中，cm是upa的底物。在一些实施方案中，cm是天冬酰胺内肽酶的底物。在一些实施方案中，cm是matr iptase的底物。在一些实施方案中，cm是半胱氨酸蛋白酶的底物。在一些实施方案中，cm是半胱氨酸蛋白酶(诸如组织蛋白酶)的底物。
167.在一些实施方案中，cm包括序列issgllsgrsdnh(seq id no:28)；issgllssggsggslsgrsdnh(seq id no:30)；avgllappggtstsgrsanprg(seq id no:275)；tstsgrsanprgggavgllapp(seq id no:276)；vhmplgflgpggtstsgrsanprg(seq id no:277)；tstsgrsanprgggvhmplgflgp(seq id no:278)；avgllappgglsgrsdnh(seq id no:29)；lsgrsdnhggavgllapp(seq id no:70)；vhmplgflgpgglsgrsdnh(seq id no:266)；lsgrsdnhggvhmplgflgp(seq id no:267)；lsgrsdnhggsggsissgllss(seq id no:268)；
lsgrsgnhggsggsissgllss(seq id no:279)；issgllssggsggslsgrsgnh(seq id no:269)；lsgrsdnhggsggsqnqalrma(seq id no:270)；qnqalrmaggsggslsgrsdnh(seq id no:271)；lsgrsgnhggsggsqnqalrma(seq id no:272)；qnqalrmaggsggslsgrsgnh(seq id no:273)和/或issgllsgrsgnh(seq id no:274)。
168.在一些实施方案中，cm1和/或cm2包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:5至seq id no:100。在一些实施方案中，cm包含选自下组的序列：issgllsgrsdnh(seq id no:28)、lsgrsddh(seq id no:33)、issgllsgrsdqh(seq id no:54)、sgrsdni(seq id no:100)和issgllsgrsdni(seq id no:68)。
169.在一些方面，acc包括选自seq id no:1和101-209的cp1、选自seq id no:5-100和263-308的cm1和dd1，它们与选自seq id no:1和101-209的cp2、选自seq id no:5-100和263-308的cm2和dd2二聚化。在一些方面，acc可包括在cp1与cm1之间和/或在cm1与dd1之间的选自seq id no:2和210-234、245或250的接头，和在cp2与cm2之间和/或在cm2与dd2之间的选自seq id no:2和210-234、245或250的接头。在一些实施方案中，acc包括具有与seq id no:3或seq id no:4具有至少80％同一性(例如至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列的dd1和/或dd2。在一些实施方案中，acc包括具有与seq id no:315或seq id no:316具有至少80％同一性(例如至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列的dd1。在一些实施方案中，acc包括具有与seq id no:315或seq id no:316具有至少80％同一性(例如至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列的dd2。
170.与剂缀合
171.本公开还提供了用于在本文所描述的acc中的任一种中包括额外元件的方法和材料，包括例如促进向感兴趣的细胞或组织递送的靶向部分、剂(例如剂、抗肿瘤剂)、毒素或其片段。
172.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，acc可以与细胞毒性剂(包括但不限于毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段))或放射性同位素缀合。在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，可活化细胞因子构建体可以与细胞毒性剂(包括但不限于毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段))或放射性同位素缀合。
173.可与本文所描述的acc中的任一种缀合的非限制性示例性细胞毒性剂包括：尾海兔素(dolastatin)和其衍生物(例如澳瑞他汀(auristatin)e、afp、单甲基澳瑞他汀d(mmad)、单甲基澳瑞他汀f(mmaf)、单甲基澳瑞他汀e(mmae)、去甲基澳瑞他汀e(dmae)、澳瑞他汀f、去甲基澳瑞他汀f(dmaf)、尾海兔素16(dmj)、尾海兔素16(dpv)、澳瑞他汀衍生物(例如澳瑞他汀酪胺、澳瑞他汀喹诺酮)、美登素(maytansinoid)(例如dm-1、dm-4)、美登素衍生物、倍癌霉素(duocarmycin)、α-鹅膏蕈碱、涡轮他汀(turbostatin)、非那他汀(phenstatin)、羟非那他汀、海绵抑制素(spongistatin)5、海绵抑制素7、哈司他汀(halistatin)1、哈司他汀2、哈司他汀3、卤代康司他汀(halocomstatin)、吡咯苯并咪唑
(pbi)、西布罗他汀(cibrostatin)6、多沙利式(doxaliform)、西马多丁(cemadotin)类似物(cemch2-sh)、假单胞菌毒素a(pes8)变体、假单胞菌毒素a(zz-pe38)变体、zj-101、蒽环素、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、苔藓虫素(bryostatin)、喜树碱(camptothecin)、7-取代的喜树碱、10,11-二氟亚甲基二氧喜树碱、考布他汀(combretastatin)、脱溴海兔毒素(debromoaplysiatoxin)、kahamide-f、圆皮海绵内酯(discodermolide)和海鞘素(ecteinascidin)。
174.可与本文所描述的acc中的任一种缀合的非限制性示例性酶活性毒素包括：白喉毒素(diphtheria toxin)、来自铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的外毒素a链、蓖麻毒(ricin)a链、相思豆毒素(abrin)a链、蒴莲根毒素(modeccin)a链、α-八叠球菌素(alpha-sarcin)、油桐(aleuriies fordii)蛋白、香石竹毒(dianthin)蛋白、美洲商陆(phytoiaca americana)蛋白(例如papi、papii和pap-8)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、米托菌素(mitogellin)、局限曲霉素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族毒素(tricothecene)。
175.可与本文所描述的acc中的任一种缀合的非限制性示例性抗肿瘤剂包括：阿霉素(adriamycin)、盐酸正定霉素(cerubidine)、博来霉素(bleomycin)、爱克兰(alkeran)、长春花碱(velban)、硫酸长春新碱(oncovin)、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、噻替派(thiotepa)、比生(bisantrene)、米托蒽醌(novantrone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、丙卡比嗪(procarabizine)和阿糖胞苷。
176.可与本文所描述的acc中的任一种缀合的非限制性示例性抗病毒剂包括：阿昔洛韦、阿糖腺苷(vira a)和金刚烷胺(symmetrel)。
177.可与本文所描述的acc中的任一种缀合的非限制性示例性抗真菌剂包括：制霉菌素(nystatin)。
178.可与本文所描述的acc中的任一种缀合的非限制性示例性可缀合检测试剂包括：荧光素和其衍生物，异硫氰酸荧光素(fitc)。
179.可与本文所描述的可活化细胞因子构建体中的任一种缀合的非限制性示例性抗细菌剂包括：氨基糖苷、链霉素、新霉素、卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素。
180.可与本文所描述的可活化细胞因子构建体中的任一种缀合的非限制性示例性3β,16β,17α-三羟基胆甾-5-烯-22-酮16-o-(2-o-4-甲氧基苯甲酰-β-d-木吡喃糖)-(1
‑‑
》3)-(2-o-乙酰基-α-l-阿拉伯吡喃糖苷)(osw-1)包括：o6-苄基鸟嘌呤的s-硝基苄氧羰基衍生物、拓扑异构酶抑制剂、哈米特林(hemiasterlin)、三尖杉碱(cephalotaxine)、高三尖杉酯碱(homoharringionine)、吡咯并苯二氮二聚体(pbd)、官能化吡咯并苯二氮卡奇霉素(calcicheamicin)、鬼臼毒素(podophyiitoxin)、紫杉烷和长春碱。
181.可与本文所描述的可活化细胞因子构建体中的任一种缀合的非限制性示例性放射物包括：
123
i、
89
zr、
125
i、
131
i、
99
mtc、
201
t1、
62
cu、
18
f、
68
ga、
13
n、
15
o、
38
k、
82
rb、
111
in、
133
xe、
11
c和
99
mtc(锝)。
182.可与本文所描述的acc中的任一种缀合的非限制性示例性重金属包括：钡、金和铂。
183.可与本文所描述的acc中的任一种缀合的非限制性示例性抗支原体包括：泰乐菌
素(tylosine)、大观霉素(spectinomycin)、链霉素b、氨苄青霉素、磺胺、多粘菌素(polymyxin)和氯霉素(chloramphenicol)。
184.本领域普通技术人员将认识到，多种可能的部分可与本文所描述的可活化细胞因子构建体中的任一种缀合。缀合可包括将结合两个分子的任何化学反应，只要acc和其他部分保持它们各自的活性即可。缀合可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、嵌插、配位结合和络合。在一些实施方案中，优选的结合是共价结合。可通过现有侧链的直接缩合或通过掺入外部桥接分子来实现共价结合。许多二价或多价连接剂可用于缀合本文所描述的可活化细胞因子构建体中的任一种。例如，缀合物可包括有机化合物，诸如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。在一些实施方案中，可活化细胞因子构建体可包括或以其他方式引入一个或多个非天然氨基酸残基以提供合适的缀合位点。
185.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，剂和/或缀合物通过二硫键(例如，半胱氨酸分子上的二硫键)连接到抗原结合结构域。由于许多癌症会自然释放高水平的还原剂谷胱甘肽，因此存在于癌组织微环境中的谷胱甘肽可以还原二硫键，且随后释放递送位点处的剂和/或缀合物。
186.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，当缀合物在靶部位(例如患病组织(例如癌组织))内存在补体的情况下与其靶标结合时，将缀合物和/或剂连接到接头的酰胺键或酯键被裂解，导致活性形式的缀合物和/或剂释放。当施用至受试者时，这些缀合物和/或剂将完成缀合物和/或剂在靶部位(例如患病组织(例如癌组织))处的递送和释放。这些缀合物和/或剂对于本文所描述的缀合物和/或剂中的任一种的体内递送特别有效。
187.在一些实施方案中，接头不可被补体系统的酶裂解。例如，由于补体活化最终会裂解靶细胞，因此缀合物和/或剂在不存在补体活化的情况下释放。在此类实施方案中，缀合物和/或剂将被递送至靶细胞(例如激素、酶、皮质类固醇、神经递质或基因)。此外，接头对血清蛋白酶的裂解有轻微的敏感性，并且缀合物和/或剂在靶部位处缓慢释放。
188.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，设计缀合物和/或剂，使得缀合物和/或剂被递送至靶部位(例如患病组织(例如癌组织))，但不释放缀合物和/或剂。
189.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，将缀合物和/或剂直接或通过不可裂解的接头连接至抗原结合结构域。示例性不可裂解的接头包括氨基酸(例如d-氨基酸)、肽或可被修饰以包含随后可通过本文所描述的方法用于连接至抗原结合结构域的官能团的其他有机化合物。
190.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，acc包括剂的至少一个缀合点。在一些实施方案中，所有可能的缀合点都可用于与剂缀合。在一些实施方案中，一个或多个缀合点包括但不限于涉及二硫键的硫原子、涉及链间二硫键的硫原子、涉及链间硫键但不涉及链内二硫键的硫原子和/或半胱氨酸或其他含有硫原子的氨基酸残基的硫原子。在此类情况下，残基可天然存在于蛋白质构建体结构中，或使用包括但不限于定点诱变、化学转化或错误掺入非天然氨基酸的方法而掺入蛋白质构建体中。
191.本公开还提供了用于制备用于缀合的acc的方法和材料。在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，acc被修饰以包括一个或多个链间二硫键。例如，acc中的二硫键可以在暴露于还原剂(诸如但不限于tcep、dtt或β-巯基乙醇)后经历还原。在一些情况下，二硫键的还原只是部分的。如本文所用，术语部分还原是指acc与还原剂接触并且所有可能
的缀合位点的一部分经历还原(例如不是所有二硫键都被还原)的情况。在一些实施方案中，如果少于99％(例如少于98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或少于5％)的所有可能的缀合位点被还原，那么与还原剂接触后，可活化细胞因子构建体被部分还原。在一些实施方案中，将具有一个或多个链间二硫键还原的acc缀合至与游离硫醇具有反应性的药物。
192.本公开还提供用于将剂缀合至acc上的特定位置的方法和材料。在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，修饰acc使得剂可在acc上的特定位置处缀合至acc。例如，可以以促进与acc缀合的方式部分还原acc。在此类情况下，acc的部分还原以acc中的缀合位点不被还原的方式发生。在一些实施方案中，选择acc上的缀合位点以促进剂在蛋白质构建体上的特定位置处的缀合。在用还原剂处理后，各种因素可影响acc的“还原水平”。例如但不限于，可能需要优化还原剂与acc的比率、孵育时间、孵育温度和/或还原反应溶液的ph，以便用本文所描述的方法和材料实现acc的部分还原。可使用任何适当的因素组合(例如还原剂与acc的比率、用还原剂孵育的时间和温度和/或还原剂的ph)以实现acc的部分还原(例如可能的缀合位点的普遍还原或特定缀合位点的还原)。
193.还原剂与acc的有效比率可以是以允许与剂缀合的方式至少部分地还原acc(例如可能的缀合位点的普遍还原或特定缀合位点的还原)的任何比率。在一些实施方案中，还原剂与acc的比率在约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.5、约9:1至1:1.5、约8:1至1:1.5、约7:1至1:1.5、约6:1至1:1.5、约5:1至1:1.5、约4:1至1:1.5、约3:1至1:1.5、约2:1至1:1.5、约1.5:1至1:1.5或约1:1至1:1.5范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1:1范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1.5:1范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1:1范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1.5:1范围内。在一些实施方案中，比率在约8:1至约1:1范围内。在一些实施方案中，比率在约2.5:1至1:1范围内。
194.用于用还原剂处理acc的有效孵育时间和温度可以是以允许剂与acc缀合的方式至少部分地还原acc(例如可能的缀合位点的普遍还原或特定缀合位点的还原)的任何时间和温度。在一些实施方案中，用于处理acc的温育时间和温度将在37℃下约1小时至37℃约12小时的范围内(或其中的任何子范围)。
195.用于用还原剂处理acc的还原反应的有效ph可以是以允许acc与剂缀合的方式至少部分地还原acc(例如可能的缀合位点的普遍还原或特定缀合位点的还原)的任何ph。
196.当部分还原的acc与含有硫醇的剂接触时，剂可以与acc中的链间硫醇缀合。可以使用含硫醇试剂(例如半胱氨酸或n-乙酰半胱氨酸)以包括硫醇的方式修饰剂。例如，在与还原剂(例如tepc)一起以所需的还原剂与acc的比率在约37℃下孵育约1小时后，acc可以被部分还原。还原剂与acc的有效比率可以是以允许缀合含硫醇剂的方式部分还原至少两个位于acc中的链间二硫键(例如可能的缀合位点的普遍还原或特定缀合位点的还原)的任何比率。
197.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，acc被还原剂以避免还原任何链内二硫键的方式还原。在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，acc被还原剂以避免还原任何链内二硫键并且还原至少一个链间二硫键的方式还原。
198.在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，acc还可以包括与acc缀合的剂。在一些实施方案中，缀合的剂是剂。
199.在一些实施方案中，剂(例如与可活化细胞因子构建体缀合的剂)是可检测的部分，诸如标记或其他标志物。例如，剂是或包括放射性标记的氨基酸、可通过标志抗生物素蛋白(例如，含有可通过光学或量热法检测的荧光标志物或酶活性的链霉抗生物素蛋白)检测的一个或多个生物素部分、一种或多种放射性同位素或放射性核素、一种或多种荧光标记、一种或多种酶标记和/或一种或多种化学发光剂。在一些实施方案中，可检测的部分通过间隔分子连接。
200.在一些实施方案中，剂(例如与可活化细胞因子构建体缀合的细胞毒性剂)使用碳水化合物部分、巯基、氨基或羧酸酯基团连接至acc。
201.在本文所描述的与剂缀合的acc中的任一种的一些实施方案中，剂(例如与可活化的细胞因子构建体缀合的细胞毒性剂)通过接头和/或cm(也称为可裂解序列)与acc缀合。在一些实施方案中，剂(例如与可活化细胞因子构建体缀合的细胞毒性剂)与acc中的半胱氨酸或赖氨酸缀合。在一些实施方案中，剂(例如与可活化细胞因子构建体缀合的细胞毒性剂)与acc的另一个残基缀合，诸如本文公开的那些残基。在一些实施方案中，接头是含硫醇接头。在一些实施方案中，接头为不可裂解的接头。表1提供了可裂解部分和接头的一些非限制性实例。
202.表1.
203.[0204][0205]
本领域普通技术人员将认识到，可将多种可能的部分与本公开的acc偶合。(参见例如“conjugate vaccines”,contributions to microbiology and immunology,j.m.cruse和r.e.lewis,jr(编),carger press,new york,(1989)，其全部内容以引用的方式并入本文)。一般而言，剂(例如细胞毒性剂)与acc的有效缀合可通过将剂与acc结合同时还允许剂和acc保留官能度的任何化学反应来实现。
[0206]
在与剂缀合的acc中的任一种的一些实施方案中，可以使用多种双官能蛋白偶合剂将剂与acc缀合，所述双官能蛋白偶合剂包括但不限于3-(2-吡啶基二巯基)丙酸n-琥珀酰亚胺酯(spdp)、亚氨基硫烷(iminothiolane，it)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如己二酸二甲酯hcl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二
异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒免疫毒素可如vitetta等人,science 238:1098(1987)中所描述来制备。在一些实施方案中，碳-14标记的1-异硫氰酰苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)螯合剂可用于将放射性核苷酸缀合至acc。(参见例如wo94/11026)。
[0207]
在文献中描述了合适的接头和cm。参见例如ramakrishnan,s.等人,cancer res.44:201-208(1984)，其描述mbs(m-马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯)的使用。还参见美国专利号5,030,719，其描述借助于寡肽接头与acc偶合的卤代乙酰肼衍生物的使用。在一些实施方案中，合适的接头包括：(i)edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)smpt(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(pierce chem.co.,目录(21558g)；(iii)spdp(琥珀酰亚胺-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(pierce chem.co.,目录号21651g)；(iv)磺基-lc-spdp(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸酯(pierce chem.co.目录号2165-g)；和(v)缀合至edc的磺基-nhs(n-羟基磺基-琥珀酰亚胺：pierce chem.co.,目录号24510)。额外接头包括但不限于smcc、磺基-smcc、spdb或磺基-spdb。
[0208]
上文所描述的cm和接头含有具有不同属性的组分，因此导致具有不同物理化学性质的缀合物。例如，羧酸烷基酯的磺基-nhs酯比羧酸芳基酯的磺基-nhs酯稳定。含有nhs酯的接头比磺基nhs酯的溶解度低。此外，接头smpt含有空间位阻二硫键，并且可形成具有增加的稳定性的缀合物。一般来说，二硫键联的稳定性低于其他键联，因为二硫键联在体外被裂解，从而导致可用的缀合物较少。磺基-nhs尤其可以提高碳二亚胺偶合的稳定性。与单独的碳二亚胺偶合反应相比，当与磺基-nhs结合使用时，碳二亚胺偶合(诸如edc)形成对水解的抵抗力更大的酯。
[0209]
在acc中的任一种的一些实施方案中，可以使用包括在acc的氨基酸序列中的修饰的氨基酸序列将剂缀合至acc。通过在acc的氨基酸序列内的特定位置处插入可缀合的氨基酸，可以设计蛋白质构建体以实现缀合剂(例如细胞毒性剂)的受控放置和/或剂量。例如，acc可以被修饰以在第一单体、第二单体、第三单体和/或第四单体上的提供反应性硫醇基团并且不会对蛋白质折叠和/或组装产生负面影响并且不改变抗原结合特性的位置处包括半胱氨酸残基。在一些实施方案中，acc可以被修饰以在acc的氨基酸序列内包括一个或多个非天然氨基酸残基以提供合适的缀合位点。在一些实施方案中，acc可以被修饰以在acc的氨基酸序列中包括可酶促活化的肽序列。
[0210]
核酸
[0211]
本文提供了包括编码本文所描述的acc中的任一种的第一单体构建体(或第一单体构建体的蛋白质部分)(例如本文所描述的第一单体构建体中的任一种)和第二单体构建体(或第二单体构建体的蛋白质部分)(例如本文所描述的第二单体构建体中的任一种)的序列的核酸。在一些实施方案中，一对核酸一起编码第一单体构建体(或第一单体构建体的蛋白质部分)和第二单体构建体(或第二单体构建体的蛋白质部分)。在一些实施方案中，编码第一单体构建体(或第一单体构建体的蛋白质部分)的核酸序列与编码第二单体构建体(或第二单体构建体的蛋白质部分)的核酸序列具有至少70％同一性(例如至少72％同一性、至少74％同一性、至少76％同一性、至少78％同一性、至少80％同一性、至少82％同一性、至少84％同一性、至少86％同一性、至少88％同一性、至少90％同一性、至少92％同一
性、至少94％同一性、至少96％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性)。
[0212]
在一些实施方案中，编码第一单体构建体的蛋白质部分的核酸编码包含cp1和cm1部分的多肽。在一些实施方案中，编码第二单体的蛋白质部分的核酸编码包含cp2和cm2部分的多肽。在一些实施方案中，一对核酸一起编码第一单体构建体的蛋白质部分和第二单体构建体的蛋白质部分，其中蛋白质部分然后分别与dd1和dd2部分缀合(在随后的缀合步骤中)。
[0213]
在一些实施方案中，编码第一单体构建体的核酸编码包含dd1部分的多肽。在一些实施方案中，编码第二单体构建体的核酸编码包含dd2部分的多肽。
[0214]
载体
[0215]
本文提供了包括本文所描述的核酸中的任一种的载体和载体组。本领域技术人员将能够选择合适的载体或载体组(例如表达载体)以制备本文所描述的acc中的任一种，并使用载体或载体组来表达本文所描述的acc中的任一种。例如，在选择载体或载体组时，必须考虑细胞，因为载体可能需要能够整合到细胞的染体中和/或在其中复制。下文还描述了可用于产生acc的示例性载体。
[0216]
如本文所用，术语“载体”是指能够在细胞(例如本文所描述的细胞中的任一种)中诱导重组蛋白(例如第一或第二单体)表达的多核苷酸。“载体”能够将核酸和其片段递送到宿主细胞中，并且包括调节序列(例如启动子、增强子、poly(a)信号)。可以将外源多核苷酸插入到表达载体中以进行表达。术语“载体”还包括人工染体、质粒、逆转录病毒和杆状病毒载体。
[0217]
用于构建包括本文所描述的核酸中的任一种并且适合于转化细胞(例如哺乳动物细胞)的合适的载体的方法在本领域中是众所周知的。例如参见sambrook等人编,“molecular cloning:a laboratory manual”,第2版,cold spring harbor press,1989和ausubel等人编,“current protocols in molecular biology”,current protocols,1993。
[0218]
载体的非限制性实例包括质粒、转座子、粘粒和病毒载体(例如任何腺病毒载体(例如psv或pcmv载体)、腺相关病毒(aav)载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体)，以及任何载体。例如，载体可以包括足够的顺式作用表达元件；其他表达元件可以由宿主哺乳动物细胞或在体外表达系统中提供。熟练的从业者将能够选择合适的载体和哺乳动物细胞来制备本文所描述的acc中的任一种。
[0219]
在本文所描述的acc中的任一种的一些实施方案中，可以使用重组dna技术以及在真核或原核物种中的表达来以生物合成方式制备acc。
[0220]
在一些实施方案中，载体包括编码本文所描述的acc中的任一种的第一单体和第二单体的核酸。在一些实施方案中，载体是表达载体。
[0221]
在一些实施方案中，一对载体一起包括一对核酸，所述核酸一起编码本文所描述的acc中的任一种的第一单体和第二单体。在一些实施方案中，所述载体对是一对表达载体。
[0222]
细胞
[0223]
本文还提供了包括本文所描述的载体或载体组中的任一种的宿主细胞，所述载体或载体组包括本文所描述的核酸中的任一种。
[0224]
本文所描述的acc中的任一种可由任何细胞(例如哺乳动物细胞)产生。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如人类细胞)、啮齿动物细胞(例如小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或豚鼠细胞)或非人类灵长类动物细胞。
[0225]
将核酸和载体(例如本文所描述的载体中的任一种或载体组中的任一种)引入细胞的方法是本领域已知的。可用于将核酸引入细胞的方法的非限制性实例包括：脂质转染、转染、磷酸钙转染、阳离子聚合物转染、病毒转导(例如腺病毒转导、慢病毒转导)、纳米颗粒转染和电穿孔。
[0226]
在一些实施方案中，引入步骤包括将载体(例如本文所描述的载体或载体组中的任一种)引入细胞，所述载体包括编码构成本文所描述的acc中的任一种的单体的核酸。
[0227]
在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，细胞可以是真核细胞。如本文所用，术语“真核细胞”是指具有独特的膜结合核的细胞。此类细胞可包括例如哺乳动物(例如啮齿动物、非类人灵长类动物或人类)、昆虫、真菌或植物细胞。在一些实施方案中，真核细胞是酵母细胞，诸如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方案中，真核细胞是高等真核细胞，诸如哺乳动物、禽类、植物或昆虫细胞。哺乳动物细胞的非限制性实例包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞和人类胚肾细胞(例如hek293细胞)。
[0228]
在一些实施方案中，细胞含有编码本文所描述的acc中的任一种的第一单体和第二单体的核酸。在一些实施方案中，细胞含有一起编码本文所描述的acc中的任一种的第一单体和第二单体的核酸对。
[0229]
产生可活化细胞因子构建体的方法
[0230]
本文提供了产生本文所描述的acc中的任一种的方法，所述方法包括：(a)在液体培养基中在足以产生acc的条件下培养本文所描述的重组宿主细胞中的任一种；以及(b)从宿主细胞和/或液体培养基回收acc。
[0231]
培养细胞的方法是本领域众所周知的。细胞可以在有利于细胞增殖、细胞分化和细胞生长的条件下体外维持。例如，细胞可以通过使细胞(例如本文所描述的细胞中的任一种)与细胞培养基接触来培养，所述细胞培养基包含足以支持细胞活力和生长的必需生长因子和补充剂。
[0232]
在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，所述方法还包括分离回收的acc。分离方法的非限制性实例包括：硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀、尺寸排阻谱、配体亲和谱、离子交换谱(例如阴离子或阳离子)和疏水相互作用谱。
[0233]
在一些实施方案中，细胞可以产生包含cp1和cm1的第一单体构建体的蛋白质部分，以及包含cp2和cm2的第二单体构建体的蛋白质部分，然后蛋白质部分随后分别与dd1和dd2部分缀合。
[0234]
本文所描述的组合物和方法可涉及使用允许二硫键在二聚化结构域之间形成的非还原或部分还原条件以形成和维持acc的二聚化。
[0235]
在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，所述方法还包括将分离的acc配制成药物组合物。各种制剂在本领域中是已知的并且在本文中进行了描述。本文所描述的分离的acc中的任一种可以被配制用于任何施用途径(例如静脉内、瘤内、皮下、皮内、口服(例如吸入)、经皮(例如局部)、经粘膜或肌肉内)。
[0236]
本文还提供了通过本文所描述的方法中的任一种产生的acc。还提供了包含通过
本文所描述的方法中的任一种产生的acc中的任一种的组合物(例如药物组合物)。本文还提供了包括至少一剂本文所描述的组合物(例如药物组合物)中的任一种的药盒。
[0237]
方法
[0238]
本文提供了受试者的疾病(例如癌症(例如本文所描述的癌症中的任一种))的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所描述的acc中的任一种。
[0239]
如本文所用，术语“受试者”是指任何哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是猫科动物(例如猫)、犬科动物(例如狗)、马科动物(例如马)、兔子、猪、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠或豚鼠)、非人类灵长类动物(例如猿猴(例如猴子(例如狒狒、狨猴)或猿(例如黑猩猩、大猩猩、猩猩或长臂猿))或人类。在一些实施方案中，受试者是人类。
[0240]
在一些实施方案中，受试者先前已被鉴别或诊断为患有疾病(例如癌症(例如本文所描述的癌症中的任一种))。
[0241]
如本文所用，术语“”包括降低受试者(例如本文所描述的受试者中的任一个)的疾病(例如癌症(例如本文所描述的癌症中的任一种))的一种或多种(例如，1、2、3、4或5种)症状或病征的严重性、频率或数量。在疾病是癌症的一些实施方案中，导致减少患有癌症的受试者的癌症生长、抑制其癌症进展、抑制其癌症转移或降低其癌症复发的风险。
[0242]
在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，疾病是癌症。本文还提供了有需要的受试者(例如本文所描述或本领域已知的示例性受试者中的任一个)的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所描述的acc中的任一种或本文所描述的组合物(例如药物组合物)中的任一种。
[0243]
在这些方法的一些实施方案中，受试者已被鉴别或诊断为患有癌症。癌症的非限制性实例包括：实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、横纹肌肉瘤、尤因肉瘤(ewing sarcoma)、骨肉瘤、b细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤(例如b细胞淋巴瘤、b细胞非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma)、霍奇金淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤)、白血病(例如毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all))、骨髓增生异常综合征(mds)、卡波西肉瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌、尿路上皮癌、肺癌、肾细胞癌、胃和食管癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌、结肠癌、骨癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、鼻咽腺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、鳞状细胞头颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，淋巴瘤是伯基特淋巴瘤。在一些方面，受试者已被鉴别或诊断为患有家族性癌症综合征，诸如利-弗劳梅尼综合征(li fraumeni syndrome)、家族性乳腺癌-卵巢癌(brca1或brac2突变)综合征等。所公开的方法还可用于非实体癌。示例性实体瘤包括各种器官系统的恶性肿瘤(例如肉瘤、腺癌和癌)，诸如肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如结肠)和泌尿生殖(例如肾、尿路上皮或睾丸肿瘤)道、咽、前列腺和卵巢的那些。示例性腺癌包括结肠直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺的非小细胞癌和小肠癌。
[0244]
美国国家癌症研究所(national cancer institute)描述的示例性癌症包括：成人急性淋巴母细胞白血病；儿童急性淋巴母细胞白血病；成人急性骨髓性白血病；肾上腺皮质癌；儿童肾上腺皮质癌；aids相关淋巴瘤；aids相关恶性肿瘤；肛门癌；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤；肝外胆管癌；膀胱癌；儿童膀胱癌；骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；儿童脑干胶质瘤；成人脑瘤；儿童脑瘤脑干胶质瘤；儿童脑瘤小脑星形细胞瘤；儿童脑
瘤大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；儿童脑瘤室管膜瘤；儿童脑瘤髓母细胞瘤；儿童脑瘤幕上原始神经外胚叶肿瘤；儿童脑瘤、视路和下丘脑胶质瘤；儿童脑瘤(其他)；乳腺癌；乳腺癌与妊娠；儿童乳腺癌；男性乳腺癌；儿童支气管腺瘤/类癌瘤；儿童类癌瘤；胃肠道类癌瘤；肾上腺皮质癌；小岛细胞癌；原发灶不明的转移癌(carcinoma of unknown primary)；原发性中枢神经系统淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；慢性骨髓增殖性疾病；腱鞘透明细胞肉瘤；结肠癌；儿童结直肠癌；皮肤t细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；儿童室管膜瘤；卵巢上皮癌；食管癌；儿童食管癌；尤因氏家族肿瘤；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌、眼内黑素瘤；眼癌、视网膜母细胞瘤；胆癌；胃(gastric/stomach)癌；儿童胃癌；胃肠道类癌；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；卵巢生殖细胞肿瘤；滋养细胞肿瘤；儿童脑干胶质瘤；视路和下丘脑胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；成人(原发性)肝细胞(肝)癌；儿童(原发性)肝细胞(肝)癌；成人霍奇金淋巴瘤；儿童霍奇金淋巴瘤；妊娠期霍奇金淋巴瘤；下咽癌；儿童下丘脑和视路胶质瘤；眼内黑素瘤；小岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤；肾癌；喉癌；儿童喉癌；成人急性淋巴母细胞白血病；儿童急性淋巴母细胞白血病；成人急性骨髓性白血病；儿童急性骨髓性白血病；慢性淋巴细胞性白血病；慢性髓细胞性白血病；毛细胞白血病；唇癌和口腔癌；成人(原发性)肝癌；儿童(原发性)肝癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；成人急性淋巴母细胞白血病；儿童急性淋巴母细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病；aids相关的淋巴瘤；中枢神经系统(原发性)淋巴瘤；皮肤t细胞淋巴瘤；成人霍奇金淋巴瘤；儿童霍奇金淋巴瘤；妊娠期霍奇金淋巴瘤；成人非霍奇金淋巴瘤；儿童非霍奇金淋巴瘤；妊娠期非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症；男性乳腺癌；成人恶性间皮瘤；儿童恶性间皮瘤；恶性胸腺瘤；儿童髓母细胞瘤；黑素瘤；眼内黑素瘤；梅克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)；恶性间皮瘤；隐匿性原发性转移性鳞状颈癌；儿童多发性内分泌瘤综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿病；骨髓增生异常综合征；慢性髓细胞性白血病；儿童急性骨髓性白血病；多发性骨髓瘤；慢性骨髓增生性综合征；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；儿童鼻咽癌；神经母细胞瘤；成人非霍奇金淋巴瘤；儿童非霍奇金淋巴瘤；妊娠期非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；儿童口癌；口腔和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/恶性骨纤维组织细胞瘤；儿童卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜能肿瘤；胰腺癌；儿童胰腺癌；小岛细胞胰腺癌；鼻窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；儿童松果体和幕上原始神经外胚叶肿瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠和乳腺癌；妊娠和霍奇金淋巴瘤；妊娠和非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；成人原发性肝癌；儿童原发性肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；儿童肾细胞癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；视网膜母细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤；唾液腺癌；儿童唾液腺癌；尤因家族肿瘤肉瘤；卡波西肉瘤；肉瘤(骨肉瘤)/骨恶性纤维组织细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤肉瘤；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；塞扎里综合征(sezary syndrome)；皮肤癌；儿童皮肤癌；皮肤癌(黑素瘤)；梅克尔细胞皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；转移性隐匿性原发性鳞状颈癌；胃(stomach/gastric)癌；儿童胃癌；儿童幕上原始神经外胚叶肿瘤；皮肤t细胞淋巴瘤；睾丸癌；儿童胸腺瘤；恶性胸腺瘤；甲状腺癌；儿童甲状腺癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；妊娠滋养细胞肿瘤；儿童未知原发部位癌症；不寻常的儿童癌症；输尿管和肾盂移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；儿童视路和
下丘脑胶质瘤；外阴癌；华氏巨球蛋白血症；和维尔姆斯瘤(wilms'tumor)。
[0245]
其他示例性癌症包括弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)和套细胞淋巴瘤(mcl)。
[0246]
上述癌症的转移也可以根据本文所描述的方法进行或预防。
[0247]
在一些实施方案中，这些方法可以导致受试者的癌症的一种或多种症状的数量、严重性或频率降低(例如与前受试者的癌症的一种或多种症状的数量、严重性或频率相比)。
[0248]
在本文所描述的方法中的任一种的一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用额外的剂(例如，表2中列出的一种或多种剂)。
[0249]
表2.额外的剂
[0250]
[0251]
[0252]
[0253][0254]
组合物/药盒
[0255]
本文还提供了包含本文所描述的acc中的任一种和一种或多种(例如1、2、3、4或5种)药学上可接受的载剂(例如本文所描述的药学上可接受的载剂中的任一种)、稀释剂或赋形剂的组合物(例如药物组合物)。
[0256]
在一些实施方案中，包含本文所描述的acc中的任一种的组合物(例如药物组合物)可置于无菌小瓶或预填装注射器中。
[0257]
在一些实施方案中，包含本文所描述的acc中的任一种的组合物(例如药物组合物)可以配制用于不同的施用途径(例如静脉内、皮下、肌内、腹膜内或肿瘤内)。
[0258]
在一些实施方案中，本文所描述的药物组合物中的任一种可包含一种或多种缓冲液(例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、氨基酸(例如甘氨酸)、一种或多种碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖或甘露醇)、一种或多种抗氧化剂、一种或多种螯合剂
(例如edta或谷胱甘肽)、一种或多种防腐剂和/或药学上可接受的载剂(例如抑菌水、pbs或盐水)。
[0259]
如本文所用，短语“药学上可接受的载剂”是指与医药施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗微生物剂、等张剂和吸收延迟剂等。合适的载剂包括但不限于：水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和约5％人类血清白蛋白。
[0260]
在本文所描述的药物组合物中的任一种的一些实施方案中，本文所描述的acc中的任一种是用防止从身体快速消除的载剂制备，例如缓释和控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酯和聚乳酸。制备此类药物组合物和制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易知的。
[0261]
本文还提供了包括本文所描述的acc中的任一种、包含本文所描述的acc中的任一种的组合物中的任一种或包含本文所描述的acc中的任一种的药物组合物中的任一种的药盒。除了本文所描述的acc之外，还提供了包括一种或多种选自表2的第二剂的药盒。第二剂可以与acc分开的剂量施用形式提供。替代地，第二剂可以与acc一起配制。
[0262]
本文所描述的药盒中的任一种可包括使用本文所描述的组合物(例如药物组合物)中的任一种和/或acc中的任一种的说明书。在一些实施方案中，药盒可包括执行本文所描述的方法中的任一种的说明书。在一些实施方案中，药盒可包括至少一剂本文所描述的组合物(例如药物组合物)中的任一种。在一些实施方案中，药盒可提供用于施用本文所描述的任何药物组合物的注射器。
[0263]
实施例
[0264]
本发明将在以下实施例中进行进一步描述，这些实施例不限制权利要求中所描述的本发明的范围。
[0265]
实施例1：可活化细胞因子构建体的产生
[0266]
通过重组方法制备可活化细胞因子构建体ifn-α2b-1204dnidl-higg4。所述acc的第1单体构建体和第2单体构建体是相同的，每个都是具有图3中所示氨基酸序列(seq id no:309)的多肽。第1单体构建体和第2单体构建体中的每一个从n端至c端包含来自小鼠iggκ信号序列的信号序列(seq id no:309的残基1-20)、对应于人类干扰素α-2b(seq id no:1)的成熟细胞因子蛋白、具有氨基酸序列seq id no:99的可裂解部分、具有氨基酸序列gggs(seq id no:2)的接头和对应于人类igg fc(seq id no:4)的dd。通过用具有序列seq id no:310的多核苷酸转化宿主细胞，接着培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得表达多肽的二聚化产生可活化细胞因子构建体ifn-α2b 1204dnidl higg4。
[0267]
还通过重组方法制备了可活化细胞因子构建体ifn-α-2b1490dni-higg4。所述acc的第1单体构建体和第2单体构建体也是相同的，每个都是具有图4中所示氨基酸序列(seq id no:311)的多肽。所述acc的第1单体构建体和第2单体构建体中的每一个从n端至c端包含来自小鼠iggκ信号序列的信号序列(seq id no:309的残基1-20)、对应于人类干扰素α-2b(seq id no:1)的成熟细胞因子蛋白、具有氨基酸序列seq id no:68的可裂解部分、具有氨基酸序列gggs(seq id no:2)的接头和对应于人类igg fc(seq id no:4)的dd。通过用具有序列seq id no:312的多核苷酸转化宿主细胞，接着培养所得重组宿主细胞来制备多肽。所得表达多肽的二聚化产生可活化细胞因子构建体ifn-α2b 1204dl higg4。
[0268]
制备了额外的可活化细胞因子构建体，其在接头中包含额外的五个氨基酸残基。
[0269]
对可活化细胞因子构建体和蛋白酶处理的可活化细胞因子构建体进行电泳。图6描绘了凝胶，其展示了以下的结果(从左到右)：(1)acc ifn-α2b-1204dnidl-higg4(“1204”)；(2)mt-sp1处理的ifn-α2b-1204dnidl-higg4(“1204mt-sp1”)；(3)upa处理的ifn-α2b-1204dnidl-higg4(“1204upa”)；(4)具有添加到接头的五个氨基酸残基的ifn-α2b-1204dnidl-higg4(“1204+1”)；(5)mt-sp1处理的ifn-α2b-1204dnidl-higg4(“1204+1mt-sp1”)；(6)upa处理的ifn-α2b-1204dnidl-higg4(“1204+1upa”)；(7)ifn-α-2b 1490dni-higg4(“1490”)；(8)mt-sp1处理的ifn-α-2b1490dni-higg4(“1490mt-sp1”)；和(9)upa处理的ifn-α-2b1490dni-higg4(“1490upa”)。结果表明蛋白酶有效地裂解可活化细胞因子构建体中的可裂解部分。
[0270]
实施例2.可活化细胞因子构建体的ifn-α-2b活性
[0271]
人类i型干扰素的基于细胞的报道基因测定用于测试实施例1中所描述的acc的活性。
[0272]
通过用人类stat2和irf9基因稳定转染以获得完全活跃的i型ifn信号传导通路来产生ifn反应性hek293细胞。这些细胞还具有受ifnα/β诱导型isg54启动子控制的诱导型seap(分泌胚胎碱性磷酸酶)报道基因。为了维持转基因表达，将细胞在补充有10％ fbs、pen/strep、30μg/ml杀稻瘟菌素、100μg/ml zeocin和100μg/ml normocin的dmem glutamax培养基中培养。向这些细胞中添加i型ifn活化jak/stat/isgf3通路并随后诱导seap的产生，seap可以使用碱性磷酸酶活性的比检测quant i-blue溶液在上清液中容易地评估。使用所述报道基因测定，将含有ifnα-2b的acc的活性与(聚乙二醇干扰素α-2b)的活性进行比较。图7中的数据表明，与(聚乙二醇干扰素α-2b)的ifnα-2b活性相比，acc的ifnα-2b活性明显降低。
[0273]
此外，图8a和图8b中的数据表明，(未裂解的)acc的活性可以通过改变接头或连接区的长度来调节。图8a至图8b中的数据展示了如在hek293报道基因测定中测试的具有不同的接头长度或在ifna-2b与higg4 fc之间不具有接头的ifna-2b-higg4 fc融合构建体的结果。本实验中测试的融合蛋白在n端至c端方向上包含成熟ifnα-2b细胞因子序列、任选接头和/或可裂解部分，以及seq id no:4的人类igg4的fc结构域(包括完整的铰链区，使得fc序列的n端以氨基酸序列eskygppcppc
……
开始)。第一个构建体(连接区＝7)不具有接头或可裂解部分；其在n端至c端方向上的序列由seq id no:4-seq id no:1融合物组成。第二构建体(连接区＝12)具有5个氨基酸的接头sgggg(seq id no:335)；其在n端至c端方向上的序列由seq id no:1-seq id no:335-seq id no:4融合物组成。第三构建体(连接区＝18)包括7个氨基酸的cm(sgrsdni)和4个氨基酸的接头gggs；其在n端至c端方向上的序列由seq id no:1-seq id no:100-seq id no:2-seq id no:4融合物组成。第四构建体(连接区＝23)包括5个氨基酸的接头、7个氨基酸的cm和4个氨基酸的接头；其在n端至c端方向上的序列由seq id no:1-seq id no:335-seq id no:100-seq id no:2-seq id no:4融合物组成。第五构建体(连接区＝24)包括13个氨基酸的cm(issgllsgrsdni)和4个氨基酸的接头；其在n端至c端方向上的序列由seq id no:1-seq id no:68-seq id no:2-seq id no:4融合物组成。
[0274]
实施例3：acc对癌细胞的体外抗增殖作用
[0275]
使用人类b细胞淋巴母细胞来源的细胞系daudi细胞在体外测试了ifnα-2b和含有ifnα-2b的acc的抗增殖作用。在补充有10％fbs的rpmi-1640培养基中以2
×
105个细胞/ml的浓度制备daudi细胞并且将50μl等分试样移液到白平底96孔板的孔中(10k/孔)。将测试的acc或对照在补充有10％fbs的rpmi 1640培养基中稀释。产生重复的五倍连续稀释液，从中将50μl添加到每个孔中。在37℃下孵育3天后，使用生存力试剂盒测量细胞内atp的水平，以间接估计剩余活细胞的数量。将100μl cell-titer go直接添加到板中，然后将其置于轨道振荡器上10分钟。所述孵育后，使用envision读板器直接测量发光信号。生成剂量反应曲线，并使用graph pad prism软件通过s形拟合非线性回归获得ec50值。通过比较ec50值与重组ifnα2b或药物级(聚乙二醇干扰素α-2b)确定比活性。
[0276]
含有ifnα-2b的acc在daudi淋巴瘤细胞中的抗增殖活性表明，与(聚乙二醇干扰素α-2b)相比，未裂解的acc的ifnα-2b活性降低(图9)。
[0277]
图10a至图10b中的数据也表明(未裂解的)acc的活性可以通过改变接头的长度来调节。使用daudi细胞体外测试了具有不同接头长度或在ifna-2b与higg4 fc之间不具有接头的ifna-2b-higg4 fc融合蛋白构建体的抗增殖作用。数据表明，柔性接头的长度和细胞因子与fc结构域之间的连接区(lr)的长度对(未裂解的)acc的活性有影响。具有零接头或短接头和相应短lr的构建体显示细胞因子活性降低，而具有较长接头和因此较长lr的构建体具有更高水平的细胞因子活性。结果在图10a至图10b中示出。融合蛋白构建体与上文实施例2中关于图8a和图8b所描述的那些相同。
[0278]
实施例4：蛋白酶处理的acc的活性
[0279]
在daudi淋巴细胞和基于细胞的报道基因测定中测试了蛋白酶处理的含有ifnα-2b的acc的抗增殖反应，以确定是否可以恢复活性。
[0280]
为了裂解二聚化结构域，将含有ifnα-2b的acc在37℃下用重组人类蛋白酶，诸如尿激酶型纤溶酶原活化剂(upa)或matriptase(mt-sp1)处理过夜。如实施例2和3中所描述，在测试活性之前添加蛋白酶抑制剂混合液以中和蛋白酶。来自这些测定的结果表明用蛋白酶处理含有ifnα-2b的acc可以将活性恢复到与重组细胞因子相当的水平。acc ifnα-2b-1204dnidl-higg4、acc ifnα-2b-1204dnidl-higg4+upa和干细胞ifnα-2b(人类重组ifn-α2b，从stemcell technologies获得，目录号78077.1)的ec50值是根据daudi细胞凋亡测定结果计算的，并且在下表3中提供。
[0281]
表3.ec50：daudi细胞凋亡测定
[0282][0283]
acc ifnα-2b-1204dnidl-higg4、acc ifnα-2b-1204dnidl-higg4+upa和干细胞ifnα-2b的ec50值是根据ifnα/β测定结果计算的，并且在下表4中提供。
[0284]
表4.ec50：ifnα/β报道基因测定
[0285][0286]
这些结果表明，在不存在活化蛋白酶的情况下，ifnα-2b-1204dnidl-higg4的活性相对于ifnα-2b对照明显降低。
[0287]
实施例5：通用proifn
[0288]
根据本公开的acc是通过重组方法制备的，所述acc具有对人类和小鼠细胞均具有活性的通用干扰素序列(proc859)(ifnaad 0aa 1204dnidl 0aa igg4)。所述acc的第1单体构建体和第2单体构建体是相同的，每个都是具有氨基酸序列(seq id no:323和其n端处的信号序列)的多肽。第1单体构建体和第2单体构建体中的每一个从n端至c端均包含信号序列、对应于作为ifnα1和ifnα2a的杂合体(seq id no:324)的通用干扰素分子的成熟细胞因子蛋白、具有氨基酸序列seq id no:100的可裂解部分和对应于人类igg fc(seq id no:3)的二聚化结构域。使用ifn反应性hek293细胞和b16小鼠黑素瘤细胞体外测试了通用proifn的活性。
[0289]
与小鼠ifna4相比，proc859的活性降低了至少150倍。用upa进行的蛋白酶活化将活性恢复到与小鼠ifna4相当的水平，如图19中所示。acc proc859、acc proc859+upa和小鼠ifnα4的ec50值是根据测定结果计算的，并在图19中提供。
[0290]
ec50：b16 ifnα/β报道基因测定
[0291][0292]
实施例6：先导acc proc440的体外表征：
[0293]
通过重组方法制备可活化细胞因子构建体proc 440(n ifna2b 0 1204dnidl 0aa fc)。所述acc的第1单体构建体和第2单体构建体是相同的，每个都是具有氨基酸序列seq id no:313和其n端处的信号序列的多肽。第1单体构建体和第2单体构建体中的每一个从n端至c端均包含信号序列、对应于人类干扰素α-2b(seq id no:1)的成熟细胞因子蛋白、具有氨基酸序列seq id no:100的可裂解部分和对应于人类igg fc(seq id no:3)的二聚化结构域。
[0294]
如先前所描述，proc440的活性是体外使用ifn反应性hek293细胞和daudi细胞测试的。在这两种测定中，与干细胞ifnα-2b相比，proc440的活性降低了至少1,000倍(图13)。用upa进行的蛋白酶活化将活性恢复到与重组细胞因子(如图13中所示的ifna2b)相当的水平。acc proc440、acc proc440+upa和干细胞ifnα-2b的ec50值是根据ifnα/β测定结果计算的，并且在下表5中提供。
[0295]
表5.ec50：ifnα/β报道基因测定
[0296] proc440(acc)proc440(acc)+upa干细胞ifnα-2bec5076434.33310.88
[0297]
acc proc440、acc proc440+upa和干细胞ifnα-2b的ec50值是根据daudi凋亡细胞
测定结果计算的，并且在下表6中提供。
[0298]
表6.ec50：daudi细胞凋亡测定
[0299] proc440(acc)proc440(acc)+upa干细胞ifnα-2bec50264.20.18420.3530
[0300]
通过质谱分析证实在cm中的预期位点用upa的裂解(图14a至图14b)。除了对upa活化敏感之外，proc440还被mmp4裂解(图14a至图14b)。质谱分析鉴别了在ifna的c末端，靠近可裂解部分的mmp14裂解位点(图14b)。用mmp14进行蛋白酶活化使活性恢复到与重组细胞因子相当的水平。总之，这表明acc proc440可以在至少upa和mmp14裂解内在和工程化可裂解部分后恢复全部活性。
[0301]
还通过重组方法制备了acc proc657(n ifna2b 0aa 1204dnidl0aa igg4 kihss)。所述acc的第1单体构建体是具有氨基酸序列seq id no:314和在其n端的信号序列的多肽。所述acc的第1单体构建体从n端至c端包含信号序列、对应于人类干扰素α-2b(seq id no:1)的成熟细胞因子蛋白、具有氨基酸序列seq id no:68的可裂解部分和对应于具有杵状突变的人类igg fc(seq id no:315)的二聚化结构域。所述acc的第2单体构建体是具有氨基酸序列seq id no:322和其n端处的信号序列的多肽。第2单体构建体从n端至c端具有信号序列、残端部分(seq id no:317)和对应于具有臼状突变的人类igg fc(seq id no:316)的二聚化结构域。
[0302]
如先前所描述，proc657的活性是体外使用ifn反应性hek293细胞测试的。与干细胞ifnα-2b或upa活化的proc440相比，proc657的活性降低，但与proc440相比，活性增加(图15)。因此，本公开提供了不同结构的acc，其使得调节acc中活性降低的水平成为可能。
[0303]
实施例7：acc的体内抗增殖活性：
[0304]
使用daudi异种移植肿瘤模型在体内测试了含ifnα-2b的acc proc440的抗增殖作用。在无血清培养基(1:1matrigel)中将10x106个daudi细胞皮下植入beige/scid小鼠中。当平均肿瘤体积达到约60-120mm3时，小鼠被随机分组并每周一次给药proc440，持续5周。在研究期间每周两次记录体重和肿瘤测量值。图16中的数据表明，含有ifnα-2b的acc proc440在低至0.1mg/kg的剂量下诱导肿瘤完全消退并在0.02mg/kg的剂量下减缓肿瘤生长(上图)，并且展示了的抗增殖作用以用于比较(下图)。
[0305]
实施例8：acc的体内耐受性活性
[0306]
人类ifnα-2b与仓鼠ifnα受体发生交叉反应，并且之前已显示在仓鼠中具有活性(altrock等人,journal of interferon research,1986)。为了评估含有ifnα-2b的acc proc440的耐受性，叙利亚金仓鼠以起始剂量0.4mg/kg给药。除非鉴别出非耐受毒性(dlt意指剂量限制性毒性)，否则动物接受一剂试验制品并在给药后继续研究7天。起始剂量(0.4mg/kg(“mpk”))表示infα-con(重组干扰素α，一种由amgen以名称制造的非天然存在的i型干扰素)的预计诱导仓鼠(125克)的体重减轻、食物消耗减少和骨髓抑制的等效剂量。在食蟹猴(cyno)中，0.1mg/kg/天的infα-con与体重减轻、食物消耗减少和骨髓抑制有关(对于125克仓鼠，等于1.25-2.5x10^7u)。如果起始剂量是耐受的，那么将动物移至2mg/kg的“中等剂量”并接受三剂测试制品，除非不耐受。如果耐受，那么将动物移至10mg/kg的“高剂量”并接受三剂测试制品，除非不耐受。如果耐受，那么将动物移至15mg/kg
的“高剂量”.在每个阶段，如果测试剂量不耐受，那么将动物移至下一个较低剂量。如果起始剂量不耐受，那么将动物移至0.08mg/kg的“较低剂量”。向动物给药具有dd-cm-cp二聚体的n端至c端结构的acc(proc286)。作为阴性对照，向动物给药人类igg4。正如预期的那样，阴性对照不在动物中诱导任何毒性。
[0307]
还通过重组方法制备了proc286(chigg4 5aa 1204dnidl ifna2b)。第1单体构建体和第2单体构建体是相同的，每个都是具有氨基酸序列seq id no:320和其n端处的信号序列的多肽。第1单体构建体和第2单体构建体中的每一个从n端至c端均包含信号序列、对应于人类igg fc(seq id no:3)的二聚化结构域、接头(seq id no:321)、具有氨基酸序列seq id no:100的可裂解部分、接头(seq id no:2)和对应于人类干扰素α-2b(seq id no:1)的成熟细胞因子蛋白。
[0308]
还通过重组方法制备了proc291(nhigg4 5aa 1204dnidl ifna2b)。第1单体构建体和第2单体构建体是相同的。第1单体构建体和第2单体构建体中的每一个从n端至c端均包含对应于人类干扰素α-2b(seq id no:1)的成熟细胞因子蛋白、接头(seq id no:321)、cm(seq id no:100)、接头(gggs)和包括全铰链序列(seq id no:4)的人类igg4 fc区。
[0309]
在daudi细胞凋亡测定中，将proc286和proc291的活性与(peg-ifn-α2b)的活性进行比较(图17a至图17b)。在所述测定中，proc286和展示出相似的活性水平，如图17a中所示。这表明proc286与可商购获得的聚乙二醇化ifn-α2b具有相似的活性，并可用作对照以评价ifnα-2b在仓鼠研究中的耐受性。与proc286和相比，proc291展示出降低的活性，这表明ifn n端与fc的结构取向对于降低活性很重要。也就是说，当dd是一对fc结构域时，将细胞因子定位在dd的n端(如在proc291中)与当将细胞因子定位在dd的c端(如在proc286中)时相比，可提供更大的细胞因子活性降低。
[0310]
在第1天以0.4mg/kg起始剂量向动物给药。除非达到非耐受剂量(dlt)，否则将动物继续研究一周。临床观察，在给药前以及给药后6小时、24小时、72小时和7天测量每只动物的体重和体温。在给药后72小时和7天收集每只动物的血样以用于血液学和化学分析。取样后立即进行血液学和化学分析。对于血液学分析，对血涂片、白细胞分类计数、红细胞比容、血红蛋白、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞体积、血小板计数、红细胞(red blood cell/erythrocyte)计数、红细胞分布宽度、网织红细胞计数和白细胞(white blood cell/leukocyte)计数进行评价。临床化学小组包括测量丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率、碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶、钙、氯化物、胆固醇、肌酸激酶、肌酸、γ谷氨酰胺转移酶、球蛋白、葡萄糖、无机磷、钾、钠、总胆红素、总蛋白、甘油三酯、脲、氮和c反应蛋白。耐受性研究中的毒性证据总结在图22至图24中。
[0311]
总体而言，给药未掩蔽的proc286构建体的动物表现出当以2mpk给药时，平均5％的体重减轻，并且当以10mpk和15mpk给药时，15％的体重减轻(图22)。以15mpk给药proc286的一只动物在给药后7天(研究结束)表现出20％的体重减轻。这被认为是非耐受剂量。相比之下，以2mpk和10mpk给药proc440的动物没有表现出体重减轻。
[0312]
以15mpk给药proc440的动物表现出平均5％的体重减轻(图22)。这表明具有从n端开始的cp-cm-dd的二聚化结构的本公开的acc出乎意料地限制了ifnα-2b介导的体重减轻。
不希望受理论束缚，据信将干扰素定位在dd的n端并使用相对短的lr在proc440的情况下抑制细胞因子活性，与聚乙二醇化的ifnα-2b或proc286相比降低了干扰素的毒性。
[0313]
在临床化学方面，给药proc286的动物在给药后7天(研究结束)展示在所有剂量(0.4mpk、2mpk、10mpk和15mpk)下的碱性磷酸酶(alp)的明显升高(图23)。当向动物给药10mpk或15mpk的proc440时，没有测量到alp的明显增加(图23)。alt升高是肝毒性的标志物。已展示ifnα-2b诱导肝毒性。这表明具有从n端开始的cp-cm-dd的二聚化结构的本公开的acc出乎意料地限制了ifna-2b介导的肝毒性。
[0314]
在血液学方面，给药后3天和给药后7天(研究结束)，以2mpk、10mpk和15mpk给药proc286的动物展示网织红细胞计数、中性粒细胞计数和白细胞(wbc)计数明显降低(图24)。这些降低使人联想到ifna-2b介导的骨髓毒性。给药后三天，给药proc440的动物展示网织红细胞计数、嗜中性粒细胞计数和白细胞(wbc)计数水平降低(图24)。总体而言，在给药proc440的动物中观察到的造血细胞水平的减少不如在给药proc286的动物中观察到的水平减少明显。在给药后7天(研究结束)，在给药proc440的动物中，网织红细胞计数、中性粒细胞计数和白细胞(wbc)计数的总体水平恢复到正常水平，或恢复到在给药阴性对照igg4的动物中观察到的相似的水平(图24)。在给药proc286的动物中，网织红细胞计数、中性粒细胞计数和白细胞(wbc)计数水平仍然很低。这表明具有从n端开始的cp-cm-dd的二聚化结构的本公开的acc出乎意料地限制了ifna-2b介导的骨髓毒性。
[0315]
实施例4.额外的细胞因子构建体的体外表征
[0316]
还通过重组方法制备了额外的可活化细胞因子构建体。这些acc的第1单体构建体和第2单体构建体是相同的。第1单体构建体和第2单体构建体中的每一个从n端至c端均包含来自小鼠iggκ信号序列的信号序列(seq id no:309的残基1-20)、对应于对人类干扰素α-2b(seq id no:1)的成熟细胞因子蛋白、具有氨基酸序列seq id no:100的可裂解部分(cm)和对应于人类igg4 s228p fc(包含seq id no:3)的二聚化结构域。此外，这些acc包括或不包括在cp和cm之间的具有氨基酸序列sgggg的接头。这些acc包括或不包括在cm与dd之间的具有氨基酸序列gggs的接头。这些acc还含有或不含有位于半胱氨酸226的n端的dd铰链部分。这些额外的可活化细胞因子构建体描述于表6中(参见seq id no:336至342和seq id no:313)。
[0317]
表6：人类igg的cp与半胱氨酸226之间的具有不同氨基酸序列长度的可活化细胞因子
[0318]
[0319][0320]
proc440(一种不具有柔性接头和截短至cys226的fc区的acc)的活性以及含有各种接头和fc区序列的额外acc的活性是在体外使用如先前所描述的ifn反应性hek293细胞和daudi细胞测试的。在这两种测定中，与在细胞因子与将dd结合至相应第二单体的第一氨基酸(即cys226)之间含有各种额外序列的所有其他acc相比，proc440的活性(例如抗增殖作用)降低。acc的ec50值是根据ifnα/β测定结果计算的，并在下表7中提供。
[0321]
表7.ec50：ifnα/β报道基因测定
[0322][0323]
acc的ec50值是根据daudi细胞凋亡测定结果计算的，并在下表8中提供。
[0324]
表8.ec50：daudi细胞凋亡测定
[0325][0326]
表7至表8中的数据还表明，(未裂解的)acc的活性可以通过改变细胞因子与dd的cys226之间的氨基酸序列的长度来调节。
[0327]
不希望受理论的束缚，基于本文呈现的结果，本发明人设想将细胞因子定位在dd的n端并使用相对短的lr抑制细胞因子的细胞因子活性，除了在前文具体实施例中例举的
干扰素-α细胞因子之外。如上文所描述，本文描述的发明涵盖包括本文所讨论的各种细胞因子蛋白的可活化细胞因子构建体。作为非限制性实例，本发明的acc中使用的cp可以是seq id no:101至209中所示的那些和其变体中的任一个。特别地，单体细胞因子适用于本文所描述的acc。基于本文所提供的结果，据信本发明的acc相对于相应野生型细胞因子将表现出降低的细胞因子活性，并且在相关蛋白酶裂解acc时，裂解产物将恢复与相应野生型细胞因子相似的细胞因子活性。
[0328]
实例序列
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[0357]
[0358][0359]
其他实施方案
[0360]
应理解，虽然已经结合本发明的详细描述来描述本发明，但前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

技术特征：

1.一种可活化细胞因子构建体(acc)，其包括第一单体构建体和第二单体构建体，其中：(a)所述第一单体构建体包含第一成熟细胞因子蛋白(cp1)、第一可裂解部分(cm1)和第一二聚化结构域(dd1)，其中所述cm1位于所述cp1与所述dd1之间；并且(b)所述第二单体构建体包含第二成熟细胞因子蛋白(cp2)、第二可裂解部分(cm2)和第二二聚化结构域(dd2)，其中所述cm2位于所述cp2与所述dd2之间；或(a)所述第一单体构建体包含第一成熟细胞因子蛋白(cp1)、第一二聚化结构域(dd1)，并且(b)所述第二单体构建体包含第二成熟细胞因子蛋白(cp2)、可裂解部分(cm)和第二二聚化结构域(dd2)，其中所述cm位于所述cp2与所述dd2之间，其中所述cm充当蛋白酶的底物；或(a)所述第一单体构建体包含第一成熟细胞因子蛋白(cp1)、可裂解部分(cm)和第一二聚化结构域(dd1)，其中所述cm位于所述cp1与所述dd1之间，并且(b)所述第二单体构建体包含第二成熟细胞因子蛋白(cp2)和第二二聚化结构域(dd2)，其中所述cm充当蛋白酶的底物；或(a)所述第一单体构建体包含第一成熟细胞因子蛋白(cp1)和第一二聚化结构域(dd1)，并且(b)所述第二单体构建体包含第二成熟细胞因子蛋白(cp2)和第二二聚化结构域(dd2)，其中所述cp1、所述cp2或cp1和cp2两者包括充当蛋白酶的底物的氨基酸序列；其中(c)所述dd1和所述dd2彼此结合，从而形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体；并且进一步其中(d)所述acc的特征在于具有与至少一种cp1和/或cp2活性的对照水平相比降低的所述至少一种cp1和/或cp2活性的水平。2.如权利要求1所述的acc，其中所述第一单体构建体包含第一多肽，所述第一多肽包含所述cp1、所述cm1和所述dd1。3.如权利要求1或2中任一项或组合所述的acc，其中所述第二单体构建体包含第二多肽，所述第二多肽包含所述cp2、所述cm2和所述dd2。4.如权利要求1至3中任一项或组合所述的acc，其中所述dd1和所述dd2是选自由以下组成的组的对：一对fc结构域，来自人类il-15受体α链(il15rα)的寿司结构域和可溶性il-15；barnase和barnstar；pka和akap；基于突变的rna酶i片段的衔接子/对接标签模块；表位和sdab；表位和scfv；以及基于蛋白质突触蛋白、突触结合蛋白、小突触小泡蛋白和snap25的相互作用的snare模块，抗原结合结构域和表位。5.如权利要求4所述的acc，其中所述dd1和所述dd2是一对fc结构域。6.如权利要求5所述的acc，其中所述一对fc结构域是一对人类fc结构域。7.如权利要求6所述的acc，其中所述人类fc结构域是人类igg1 fc结构域、人类igg2 fc结构域、人类igg3 fc结构域或人类igg4 fc结构域。
8.如权利要求7所述的acc，其中所述人类fc结构域是人类igg4 fc结构域。9.如权利要求8所述的acc，其中所述人类fc结构域包含与seq id no:3、seq id no:315或seq id no:316具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。10.如权利要求9所述的acc，其中所述人类fc结构域包含与seq id no:3、seq id no:315或seq id no:316具有至少90％同一性的序列。11.如权利要求10所述的acc，其中所述人类fc结构域包含seq id no:3、seq id no:315或seq id no:316。12.如权利要求1至3和5至11中任一项或组合所述的acc，其中所述dd1和所述dd2相同。13.如权利要求4所述的acc，其中dd1包含抗原结合结构域并且dd2包含相应表位。14.如权利要求13所述的acc，其中所述抗原结合结构域是抗his标签抗原结合结构域并且其中所述dd2包含his标签。15.如权利要求13所述的acc，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scfv)。16.如权利要求13所述的acc，其中所述抗原结合结构域是单结构域抗体(sdab)。17.如权利要求1所述的acc，其中dd1和dd2中的至少一个包含选自由非多肽聚合物和小分子组成的组的二聚化结构域取代基。18.如权利要求17所述的acc，其中dd1和dd2包含彼此共价结合的非多肽聚合物。19.如权利要求18所述的acc，其中所述非多肽聚合物是含硫聚乙二醇，并且其中dd1和dd2通过一个或多个二硫键彼此共价结合。20.如权利要求17所述的acc，其中dd1和dd2中的至少一个包含小分子。21.如权利要求20所述的acc，其中所述小分子是生物素。22.如权利要求20所述的acc，其中dd1包含生物素并且dd2包含抗生物素蛋白。23.如权利要求1至22中任一项或组合所述的acc，其中所述cp1和/或所述cp2各自单独地选自由以下组成的组：干扰素、白介素、gm-csf、g-csf、lif、osm、cd154、lt-β、tnf-α、tnf-β、4-1bbl、april、cd70、cd153、cd178、gitrl、light、ox40l、tall-1、trail、tweak、trance、tgf-β1、tgf-β1、tgf-β3、epo、tpo、flt-3l、scf、m-csf和msp。24.如权利要求1至23中任一项或组合所述的acc，其中所述cp1和所述cp2相同。25.如权利要求1至23中任一项或组合所述的acc，其中所述cp1和所述cp2不同。26.如权利要求1至23中任一项或组合所述的acc，其中所述cp1和/或所述cp2是干扰素。27.如权利要求26所述的acc，其中所述cp1和所述cp2是干扰素。28.如权利要求26所述的acc，其中所述cp1和所述cp2是不同的干扰素。29.如权利要求26所述的acc，其中所述cp1和所述cp2是相同的干扰素。30.如权利要求26所述的acc，其中所述cp1或所述cp2是干扰素。31.如权利要求26至30中任一项或组合所述的acc，其中所述干扰素是人类野生型成熟干扰素。32.如权利要求26至31中任一项或组合所述的acc，其中所述干扰素选自由以下组成的组：干扰素-α、干扰素-β、干扰素-ω和干扰素-τ。33.如权利要求32所述的acc，其中所述干扰素是干扰素-α。
34.如权利要求33所述的acc，其中所述干扰素选自由以下组成的组：干扰素α-2a、干扰素α-2b和干扰素α-n3。35.如权利要求34所述的acc，其中所述干扰素是干扰素α-2b。36.如权利要求35所述的acc，其中所述cp1和/或cp2包含与seq id no:1具有至少80％同一性的序列。37.如权利要求36所述的acc，其中所述cp1和/或cp2包含与seq id no:1具有至少90％同一性的序列。38.如权利要求37所述的acc，其中所述cp1和/或cp2包含seq id no:1的序列。39.如权利要求32所述的acc，其中所述干扰素是干扰素β。40.如权利要求39所述的acc，其中所述干扰素β选自由干扰素β-1a和干扰素β-1b组成的组。41.如权利要求1至40中任一项所述的acc，其中所述cp1和/或所述cp2包含ifab结构域。42.如权利要求41所述的acc，其中所述cp1和/或所述cp2包含白介素。43.如权利要求42所述的acc，其中所述白介素选自由以下组成的组：il-1α、il-1β、il-1ra、il-18、il-2、il-4、il-7、il-9、il-13、il-15、il-3、il-5、il-6、il-11、il-12、il-10、il-20、il-14、il-16和il-17。44.如权利要求1至43中任一项或组合所述的acc，其中所述cm1和/或所述cm2包含总计约3个氨基酸至约15个氨基酸。45.如权利要求1至44中任一项或组合所述的acc，其中所述cm1和所述cm2包含不同蛋白酶的底物。46.如权利要求1至44中任一项或组合所述的acc，其中所述cm1和所述cm2包含相同蛋白酶的底物。47.如权利要求1至46中任一项或组合所述的acc，其中所述蛋白酶选自由以下组成的组：adam8、adam9、adam10、adam12、adam15、adam17/tace、adamdec1、adamts1、adamts4、adamts5、bace、肾素、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶14、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶k、组织蛋白酶l、组织蛋白酶s、组织蛋白酶v/l2、组织蛋白酶x/z/p、cruzipain、天冬酰胺内肽酶、otubain-2、klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk10、klk11、klk13、klk14、穿膜肽酶、脑啡肽酶、psma、bmp-1、mmp-1、mmp-2、mmp-3、mmp-7、mmp-9、mmp-10、mmp-11、mmp-12、mmp-13、mmp-14、mmp-15、mmp-16、mmp-17、mmp-19、mmp-20、mmp-23、mmp-24、mmp-26、mmp-27、活化蛋白c、组织蛋白酶a、组织蛋白酶g、糜酶、fviia、fixa、fxa、fxia、fxiia、弹性蛋白酶、颗粒酶b、胍基苯甲酸酯酶、htra1、人类中性粒细胞裂解酶、乳铁蛋白、marapsin、ns3/4a、pace4、纤溶酶、psa、tpa、凝血酶、类胰蛋白酶、upa、desc1、dpp-4、fap、肝素、matriptase-2、mt-sp1/matriptase、tmprss2、tmprss3和tmprss4。48.如权利要求47所述的acc，其中所述蛋白酶选自由以下组成的组：upa、天冬酰胺内肽酶、mt-sp1、adam17、bmp-1、tmprss3、tmprss4、mmp-2、mmp-9、mmp-12、mmp-13和mmp-14。49.如权利要求47所述的acc，其中所述cm1和/或所述cm2包含选自由以下组成的组的
序列：lsgrsdnh(seq id no:5)、tgrgpswv(seq id no:6)、pltgrsgg(seq id no:7)、targpsfk(seq id no:8)、ntlsgrsenhsg(seq id no:9)、ntlsgrsgnhgs(seq id no:10)、tstsgrsanprg(seq id no:11)、tsgrsanp(seq id no:12)、vhmplgflgp(seq id no:13)、avgllapp(seq id no:14)、aqnllgmv(seq id no:15)、qnqalrma(seq id no:16)、laaplgll(seq id no:17)、stfpfgmf(seq id no:18)、issgllss(seq id no:19)、paglwldp(seq id no:20)、vagrsmrp(seq id no:21)、vvpegrrs(seq id no:22)、ilprspaf(seq id no:23)、mvlgrsll(seq id no:24)、qgraitfi(seq id no:25)、sprsimla(seq id no:26)、smlrsmpl(seq id no:27)、issgllsgrsdnh(seq id no:28)、avgllappgglsgrsdnh(seq idno:29)、issgllssggsggslsgrsdnh(seq id no:30)、lsgrsgnh(seq id no:31)、sgrsanprg(seq id no:32)、lsgrsddh(seq id no:33)、lsgrsdih(seq id no:34)、lsgrsdqh(seq id no:35)、lsgrsdth(seq id no:36)、lsgrsdyh(seq id no:37)、lsgrsdnp(seq id no:38)、lsgrsanp(seq id no:39)、lsgrsani(seq id no:40)、lsgrsdni(seq id no:41)、miapvayr(seq id no:42)、rpspmway(seq id no:43)、watprpmr(seq id no:44)、frlldwqw(seq id no:45)、issgl(seq id no:46)、issglls(seq id no:47)、issgll(seq id no:48)、issgllsgrsanprg(seq id no:49)、avgllapptsgrsanprg(seq id no:50)、avgllappsgrsanprg(seq id no:51)、issgllsgrsddh(seq id no:52)、issgllsgrsdih(seq id no:53)、issgllsgrsdqh(seq id no:54)、issgllsgrsdth(seq id no:55)、issgllsgrsdyh(seq id no:56)、issgllsgrsdnp(seq id no:57)、issgllsgrsanp(seq id no:58)、issgllsgrsani(seq id no:59)、avgllappgglsgrsddh(seq id no:60)、avgllappgglsgrsdih(seq idno:61)、avgllappgglsgrsdqh(seq id no:62)、avgllappgglsgrsdth(seq id no:63)、avgllappgglsgrsdyh(seq id no:64)、avgllappgglsgrsdnp(seq id no:65)、avgllappgglsgrsanp(seq idno:66)、avgllappgglsgrsani(seq id no:67)、issgllsgrsdni(seq id no:68)、avgllappgglsgrsdni(seq id no:69)、glsgrsdnhggavgllapp(seq id no:70)、glsgrsdnhggvhmplgflgp(seq id no:71)、lsgrsdnhggvhmplgflgp(seq id no:72)、issglss(seq id no:73)、pvgytssl(seq id no:74)、dwlywpgi(seq id no:75)、lkaaprwa(seq id no:76)、gpshlvlt(seq id no:77)、lpgglspw(seq id no:78)、mglfseag(seq id no:79)、splplrvp(seq id no:80)、rmhlrslg(seq id no:81)、llapshra(seq id no:82)、gprsfgl(seq id no:83)、gprsfg(seq id no:84)、sargpsrw(seq id no:85)、ggwhtgrn(seq id no:86)、htgrsgal(seq id no:87)、aargpaih(seq id no:88)、rgpafnpm(seq id no:89)、ssrgpayl(seq id no:90)、rgpatpim(seq id no:91)、rgpa(seq id no:92)、ggqpsgmwgw(seq id no:93)、fprplgitgl(seq id no:94)、spltgrsg(seq idno:95)、sagfslpa(seq id no:96)、laplglqrr(seq id no:97)、sggplgvr(seq id no:98)、plgl(seq id no:99)和sgrsdni(seq id no:100)。50.如权利要求47所述的acc，其中所述cm1和/或所述cm2包含选自由以下组成的组的序列：issgllsgrsdnh(seq id no:28)、lsgrsddh(seq id no:33)、issgllsgrsdqh(seq id no:54)、sgrsdni(seq id no:100)和issgllsgrsdni(seq id no:68)。51.如权利要求1至50中任一项或组合所述的acc，其中所述cm1和/或所述cm2包含选自seq id no:5-100和263-308的序列。
52.如权利要求1至51中任一项或组合所述的acc，其中所述蛋白酶由受试者的肿瘤产生。53.如权利要求52所述的acc，其中所述受试者已诊断或鉴别为患有癌症。54.如权利要求1至53中任一项或组合所述的acc，其中所述cp1和所述cm1在所述第一单体构建体中彼此直接邻接。55.如权利要求1至54中任一项或组合所述的acc，其中所述cm1和所述dd1在所述第一单体构建体中彼此直接邻接。56.如权利要求1至55中任一项或组合所述的acc，其中所述cp2和所述cm2在所述第二单体构建体中彼此直接邻接。57.如权利要求1至56中任一项或组合所述的acc，其中所述cm2和所述dd2在所述第二单体构建体中彼此直接邻接。58.如权利要求1至57中任一项或组合所述的acc，其中所述第一单体构建体包含至少一个接头。59.如权利要求58所述的acc，其中所述至少一个接头是设置在所述cp1与所述cm1之间的接头l1和/或设置在所述cm1与所述dd1之间的接头l2。60.如权利要求59所述的acc，其中所述第二单体构建体包含至少一个接头。61.如权利要求60所述的acc，其中所述至少一个接头是设置在所述cp2与所述cm2之间的接头l3和/或设置在所述cm2与所述dd2之间的接头l4。62.如权利要求61所述的acc，其中所述第一单体构建体包含接头l1并且所述第二单体构建体包含接头l3。63.如权利要求62所述的acc，其中l1和l3相同。64.如权利要求63所述的acc，其中所述第二单体构建体包含接头l2并且所述第二单体构建体包含接头l4。65.如权利要求64所述的acc，其中l2和l4相同。66.如权利要求65所述的acc，其中每个接头具有1个氨基酸至约15个氨基酸的总长度。67.如权利要求66所述的acc，其中每个接头具有至少5个氨基酸的总长度。68.如权利要求1至67中任一项或组合所述的acc，其中所述第一单体构建体包含至少一个接头，其中每个接头独立地选自由以下组成的组：gssggsggsgg(seq id no:210)；gggs(seq id no:2)；gggsgggs(seq id no:211)；gggsgggsgggs(seq id no:212)；ggggsggggsggggs(seq id no:213)；ggggsggggsggggsggggsggggs(seq id no:214)；ggggsggggs(seq id no:215)；ggggs(seq idno:216)；gs；ggggsgs(seq id no:217)；ggggsggggsggggsgs(seq id no:218)；ggsldpkggggs(seq id no:219)；pkscdkthtcppcpapellg(seq id no:220)；skygppcppcpapeflg(seq id no:221)；gkssgsgsesks(seq id no:222)；gstsgsgkssegkg(seq id no:223)；gstsgsgkssegsgstkg(seq id no:224)；gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no:225)；gstsgsgkpgssegst(seq id no:226)；(gs)n、(ggs)n、(gsggs)n(seq id no:227)、(gggs)n(seq id no:228)、(ggggs)n(seq id no:216)，其中每个n是至少一的整数；ggsg(seq id no:229)；ggsgg(seq id no:230)；gsgsg(seq id no:231)；gsggg(seq id no:232)；gggsg(seq id no:233)；gsssg(seq id no:234)；ggggsggggsggggs(seq id no:213)；ggggsggggsggggsggggs(seq idno:214)；和
gstsgsgkpgssegst(seq id no:226)。69.如权利要求68所述的acc，其中所述接头包含gggs(seq idno:2)的序列。70.如权利要求1至69中任一项或组合所述的acc，其中所述第一单体构建体在n端至c端方向上包含所述cp1、所述cm1和直接或间接连接至所述cm1的c端的所述dd1。71.如权利要求1至70中任一项或组合所述的acc，其中所述第一多肽在c端至n端方向上包含所述cp1、所述cm1和直接或间接连接至所述cm1的n端的所述dd1。72.如权利要求1至71中任一项或组合所述的acc，其中所述第二多肽在n端至c端方向上包含所述cp2、所述cm2和直接或间接连接至所述cm2的c端的所述dd2。73.如权利要求1至72中任一项或组合所述的acc，其中所述第二多肽在c端至n端方向上包含所述cp2、所述cm2和直接或间接连接至所述cm2的所述dd2。74.如权利要求70所述的acc，其中所述第一单体构建体在n端至c端方向上包含所述cp1、所述cm1和所述dd1，其中所述cp1和所述cm1彼此直接邻接，其中所述cm1和所述dd1彼此直接邻接，其中所述cm1是不超过10个氨基酸的肽，其中所述第二单体构建体与所述第一单体构建体相同，并且其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体通过至少两个二硫键彼此共价结合。75.如权利要求74所述的acc，其中cp1是干扰素。76.如权利要求75所述的acc，其中cp1是干扰素-α。77.如权利要求1至76中任一项或组合所述的acc，其中所述至少一种cp1和/或cp2活性是如使用表面等离子体共振所确定的所述cp1和/或所述cp2对其同源受体的结合亲和力(k
d
)。78.如权利要求1至76中任一项或组合所述的acc，其中所述至少一种cp1和/或cp2活性是淋巴瘤细胞的增殖水平。79.如权利要求1至6中任一项或组合所述的acc，其中所述至少一种cp1和/或cp2活性是淋巴瘤细胞中jak/stat/isgf3通路活化的水平。80.如权利要求1至76中任一项或组合所述的acc，其中所述至少一种活性是淋巴瘤细胞中seap产生的水平。81.如权利要求1至80中任一项或组合所述的acc，其中所述acc的特征在于与对照水平相比，至少一种cp1和/或cp2活性降低至少20倍。82.如权利要求81所述的acc，其中所述acc的特征在于与对照水平相比，至少一种cp1和/或cp2活性降低至少50倍。83.如权利要求82所述的acc，其中所述acc的特征在于与对照水平相比，所述cp1和/或cp2的至少一种活性降低至少100倍。84.如权利要求83所述的acc，其中所述acc的特征在于与对照水平相比，至少一种cp1和/或cp2活性降低至少500倍。85.如权利要求1至84中任一项或组合所述的acc，其中所述cp1和/或cp2的所述至少一种活性的对照水平是将所述acc暴露于所述蛋白酶之后所述cp1和/或cp2在所述acc中的活性。86.如权利要求1至84中任一项或组合所述的acc，其中所述至少一种cp1和/或cp2的对照水平是相应野生型成熟细胞因子的相应cp1和/或cp2活性。
87.如权利要求1至86中任一项或组合所述的acc，其中所述acc的特征在于在暴露于所述蛋白酶之后产生裂解产物，其中所述裂解产物包含所述cp1和/或cp2的所述至少一种活性。88.如权利要求87所述的acc，其中所述cp1和/或cp2的所述至少一种活性是抗增殖活性。89.如权利要求88所述的acc，其中所述对照水平是ec50值，并且其中ec50(裂解产物)与ec50(对照水平)的比率小于约10、或小于约9、或小于约8、或小于约7、或小于约6、或小于约5、或小于约4、或小于约3、或小于约2、或小于约1.5。90.一种组合物，其包含如权利要求1至89中任一项或组合所述的acc。91.如权利要求90所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。92.一种容器、小瓶、注射器、注射笔或药盒，其包括至少一剂如权利要求90或91所述的组合物。93.一种有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1至89中任一项或组合所述的acc或如权利要求90或91所述的组合物。94.如权利要求93所述的方法，其中所述受试者已被鉴别或诊断为患有癌症。95.如权利要求94所述的方法，其中所述癌症是淋巴瘤、实体瘤、血液肿瘤、肉瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、横纹肌肉瘤、尤因肉瘤、骨肉瘤、b细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、b细胞淋巴瘤、b细胞非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)、骨髓增生异常综合征(mds)、皮肤t细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、膀胱癌、胃癌、尿路上皮癌、肺癌、结肠癌、肾细胞癌、胃和食管癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞头颈癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌或肝细胞癌。96.如权利要求95所述的方法，其中所述淋巴瘤是伯基特淋巴瘤。97.一种核酸，其编码包含如权利要求1至89中任一项或组合所述的acc的所述cp1和cm1的多肽。98.如权利要求97所述的核酸，其中所述多肽还包含如权利要求1至16或权利要求23至88中任一项或组合所述的dd1。99.一种核酸，其编码包含如权利要求1至89中任一项或组合所述的acc的所述cp2和cm2的多肽。100.如权利要求99所述的核酸，其中所述多肽还包含如权利要求1至16或权利要求23至88中任一项或组合所述的dd2。101.一种载体，其包含如权利要求97至100中任一项或组合所述的核酸。102.如权利要求101所述的载体，其中所述载体是表达载体。103.一种细胞，其包含如权利要求96至99中任一项或组合所述的核酸或如权利要求101或102所述的载体。104.一种核酸对，所述核酸一起编码包含如权利要求1至89中任一项或组合所述的第一单体构建体的所述cp1和cm1的多肽和包含所述第二单体构建体的所述cp2和cm2的多肽。105.一种载体对，所述载体一起包含如权利要求104所述的核酸对。106.如权利要求105所述的载体对，其中所述载体对是表达载体对。
107.一种细胞，其包含如权利要求102所述的核酸对或如权利要求105或106所述的载体对。108.一种产生acc的方法，其包括：在液体培养基中在足以产生所述acc的条件下培养如权利要求103或107所述的细胞；以及从所述细胞或所述液体培养基回收所述acc。109.如权利要求108所述的方法，其还包括：分离从所述细胞或所述液体培养基回收的所述acc。110.如权利要求109所述的方法，其还包括：将分离的acc配制成药物组合物。111.一种acc，其通过如权利要求108所述的方法产生。112.一种组合物，其包含如权利要求111所述的acc。113.如权利要求112所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。114.一种容器、小瓶、注射器、注射笔或药盒，其包括至少一剂如权利要求112或113所述的组合物。115.一种可活化细胞因子构建体(acc)，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中：(a)所述第一单体构建体包含第一成熟细胞因子蛋白(cp1)、第一可裂解部分(cm1)和第一二聚化结构域(dd1)；(b)所述第二单体构建体包含第二成熟细胞因子蛋白(cp2)、第二可裂解部分(cm2)和第二二聚化结构域(dd2)；(c)所述第一单体构建体是在n端至c端方向上包含所述cp1、所述cm1和所述dd1的多肽，进一步其中：(i)所述第一单体构建体及所述第二单体构建体中的每一种包含有包含不超过18个氨基酸的连接区；并且(ii)所述cp1是成熟干扰素；(d)进一步其中：(i)所述第二单体构建体与所述第一单体构建体相同，(ii)所述第一单体构建体和所述第二单体构建体通过至少一个二硫键彼此共价结合，并且(iii)所述dd1和所述dd2是一对人类igg fc结构域；(e)所述dd1和所述dd2彼此结合，从而形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体；并且(f)所述acc的特征在于具有与相应对照干扰素相比降低的干扰素活性水平。116.如权利要求115所述的acc，其中所述cp1是成熟人类干扰素α。117.如权利要求115至116中任一项或组合所述的acc，其中所述成熟干扰素是成熟干扰素α-2b。118.如权利要求115至117中任一项或组合所述的acc，其中所述成熟干扰素是野生型成熟干扰素α-2b的截短形式。
119.如权利要求115至117中任一项或组合所述的acc，其中所述成熟干扰素包含与seq id no:1具有至少95％同一性的序列。120.如权利要求115至117中任一项或组合所述的acc，其中所述成熟干扰素α包含seq id no:1的序列。121.如权利要求115至120中任一项或组合所述的acc，其中所述cm1和所述cm2彼此直接邻接，所述cm1和所述dd1彼此直接邻接，并且所述cm1和所述cm2各自包含不超过710个氨基酸，任选不超过7个氨基酸。122.如权利要求115至121中任一项或组合所述的acc，其中所述cm1和所述cm2各自独立地充当尿激酶(upa)和/或基质金属蛋白酶(mmp)的底物。123.如权利要求115至122中任一项或组合所述的acc，其中所述cm1和所述cm2各自独立地充当尿激酶(upa)和/或mmp-14的底物。124.如权利要求115至123中任一项或组合所述的acc，其中所述cm1和所述cm2各自包含与seq id no:100具有至少85％同一性的序列。125.如权利要求115至124中任一项或组合所述的acc，其中所述cm1和所述cm2各自包含选自由seq id no:41、seq id no:68和seq id no:100组成的组的序列。126.如权利要求115至125中任一项或组合所述的acc，其中所述dd1和所述dd2是一对人类igg1 fc结构域或一对人类igg4 fc结构域。127.如权利要求126所述的acc，其中所述dd1和所述dd2是一对在n端截短至如eu编号所编号的半胱氨酸226的人类igg1 fc结构域或一对在n端截短至如eu编号所编号的半胱氨酸226的人类igg4 fc结构域。128.如权利要求126或127所述的acc，其中所述dd1和所述dd2是一对包含如eu编号所编号的s228p突变的人类igg4 fc结构域。129.如权利要求115至128中任一项或组合所述的acc，其中所述dd1和所述dd2各自包含与seq id no:3具有至少95％同一性的序列。130.如权利要求115至129中任一项或组合所述的acc，其中所述dd1和所述dd2各自包含seq id no:3的序列。131.如权利要求115至130中任一项或组合所述的acc，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体通过至少两个二硫键彼此共价结合。132.如权利要求115至131中任一项或组合所述的acc，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体通过至少三个二硫键彼此共价结合。133.如权利要求115至132中任一项或组合所述的acc，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体通过至少四个二硫键彼此共价结合。134.如权利要求115至133中任一项或组合所述的acc，其中所述第一单体构建体还包含直接邻接所述cm1的n端的信号序列。135.如权利要求134所述的acc，其中所述信号序列包含与seq id no:345具有至少95％同一性的序列。136.如权利要求134所述的acc，其中所述信号序列包含seq idno:345的序列。137.如权利要求115至136中任一项或组合所述的acc，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体中的每一种包含有包含不超过12个氨基酸的连接区。
138.如权利要求137所述的acc，其中所述连接区包含7至12个氨基酸。139.如权利要求137所述的acc，其中所述连接区包含7个氨基酸。140.如权利要求115至139中任一项或组合所述的acc，其中所述acc的特征在于与相应对照干扰素相比，干扰素活性降低至少500倍。141.如权利要求115至140中任一项或组合所述的acc，其中所述cp1是干扰素α并且所述对照干扰素是重组干扰素α。142.如权利要求115至140中任一项或组合所述的acc，其中所述cp1是干扰素α-2b并且所述对照干扰素是聚乙二醇化干扰素α-2b。143.如权利要求115至142中任一项或组合所述的acc，其中所述干扰素活性是淋巴瘤细胞中的抗增殖活性。144.如权利要求115至142中任一项或组合所述的acc，其中所述干扰素活性是在干扰素反应性hek293细胞中诱导分泌的胚胎碱性磷酸酶产生。145.如权利要求115至144中任一项所述的acc，其中所述acc的特征还在于在暴露于cm1充当底物的所述蛋白酶后产生裂解产物，其中所述对照干扰素的所述干扰素活性与所述裂解产物的比率小于约2，并且其中所述对照干扰素是相应重组野生型干扰素或相应聚乙二醇化干扰素。146.如权利要求145所述的acc，其中所述裂解产物的ec50与所述相应重组野生型干扰素的ec50大致相同。147.如权利要求115所述的acc，其中所述第一单体构建体和所述第二单体构建体各自包含与seq id no:313具有至少95％同一性的序列。148.如权利要求147所述的acc，其中所述acc的特征在于与野生型干扰素α-2b相比，干扰素活性降低至少500倍，并且其中所述acc的特征还在于在暴露于upa后产生裂解产物，其中所述裂解产物具有与野生型干扰素α-2b大致相同的干扰素活性，其中干扰素活性是在淋巴瘤细胞中的抗增殖测定或在干扰素反应性hek293细胞中诱导分泌的胚胎碱性磷酸酶产生的测定中测量的。149.如权利要求147所述的acc，其中与野生型干扰素α-2b或聚乙二醇化干扰素α-2b相比，所述acc在体内展现出更低的毒性。150.一种可活化细胞因子构建体(acc)，其包含第一单体构建体和第二单体构建体，其中：(a)所述第一单体构建体包含第一成熟细胞因子蛋白(cp1)、第一可裂解部分(cm1)和第一二聚化结构域(dd1)；(b)所述第二单体构建体包含第二成熟细胞因子蛋白(cp2)、第二可裂解部分(cm2)和第二二聚化结构域(dd2)；(c)所述第一单体构建体是在n端至c端方向上包含所述cp1、所述cm1和所述dd1的多肽，进一步其中：(i)所述cp1和所述cm1彼此直接邻接，(ii)所述cm1和所述dd1彼此直接邻接，(iii)所述cp1包含与seq id no:1具有至少85％同一性的序列，(iv)所述cm1包含与seq id:100具有至少85％同一性的序列，(d)进一步其中：
(i)所述第二单体构建体与所述第一单体构建体相同，(ii)所述第一单体构建体和所述第二单体构建体通过至少一个二硫键彼此共价结合，并且(iii)所述dd1和dd2是一对人类igg4 fc结构域；(e)所述dd1和所述dd2彼此结合，从而形成所述第一单体构建体和所述第二单体构建体的二聚体；并且(f)所述acc的特征在于具有与聚乙二醇化干扰素α-2b的干扰素α活性相比降低的所述干扰素α活性的水平。151.一种组合物，其包含如权利要求115至150中任一项或组合所述的acc。152.如权利要求151所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。153.一种容器、小瓶、注射器、注射笔或药盒，其包括至少一剂如权利要求151或152所述的组合物。154.一种有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求115至150中任一项或组合所述的acc或如权利要求151或152所述的组合物。155.如权利要求154所述的方法，其中所述受试者已被鉴别或诊断为患有癌症。156.一种核酸，其编码包含如权利要求115至150中任一项或组合所述的acc的所述第一单体的多肽。157.一种载体，其包含如权利要求156所述的核酸。158.如权利要求157所述的载体，其中所述载体是表达载体。159.一种哺乳动物细胞，其包含如权利要求156所述的核酸或如权利要求157或158所述的载体。160.如权利要求159所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是hek293细胞或cho细胞。161.一种制造acc的方法，所述方法包括：a.在如权利要求159或160所述的哺乳动物细胞中表达所述acc；以及b.纯化所表达的acc。162.如权利要求115至150中任一项或组合所述的acc，其中所述cm1充当在肿瘤组织中过表达的蛋白酶的底物。

技术总结

本文提供了可活化细胞因子构建体，其包括：(a)第一单体构建体，其包含第一成熟细胞因子蛋白(CP1)、第一可裂解部分(CM1)和第一二聚化结构域(DD1)，其中所述CM1位于所述CP1与所述DD1之间；和(b)第二单体构建体，其包含第二成熟细胞因子蛋白(CP2)、第二可裂解部分(CM2)和第二二聚化结构域(DD2)，其中所述CM2位于所述CP2与所述DD2之间，其中：所述CM1和所述CM2充当蛋白酶的底物；所述DD1与所述DD2彼此结合；并且其中所述ACC的特征在于与所述CP1和/或所述CP2的至少一种活性的对照水平相比，所述CP1和/或所述CP2的所述至少一种活性降低。述CP1和/或所述CP2的所述至少一种活性降低。述CP1和/或所述CP2的所述至少一种活性降低。

技术研发人员：

S

受保护的技术使用者：

西托姆克斯公司

技术研发日：

2021.04.09

技术公布日：

2023/1/31