化合物及其制备方法和应用、近红外-IIa荧光成像造影剂的制备方法与流程

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化合物及其制备方法和应用、近红外-iia荧光成像造影剂的制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种化合物及其制备方法和应用、近红外-iia荧光成像造影剂的制备方法，属于纳米生物医学成像技术领域。

背景技术：

2.近红外二区(1000-1700纳米)荧光成像技术，尤其是由近红外二区光源激发的近红外-iia(1300-1400纳米)荧光成像，相对于传统的荧光成像技术(波长小于900纳米)，由于其具有更深的组织穿透、更高的成像分辨率和更大的最大允许曝光密度而逐渐成为纳米生物医学成像技术领域一颗冉冉升起的新星。目前，已经开发了几种经典的近红外二区光源激发的无机/有机造影剂用于近红外-iia荧光成像造影。其中，无重金属毒性的有机分子，包括共轭聚合物和一些小分子，在临床转化中更有希望。然而，共轭聚合物通常会遇到生物降解性差、合成重现性低和荧光性能欠佳等问题。对于传统的小分子，如聚甲炔花菁染料来说，光稳定性差、光热效率低是制约其进一步应用的主要因素。因此，非常需要开发具有优异光学特性的，可被近红外二区光激发的理想近红外-iia有机染料。
3.凭借明确的化学结构、可靠的生物降解性/生物相容性和灵活的光学特性，供体-受体-供体(d-a-d)型共轭小分子极具潜力构建近红外二区光激发的近红外-iia荧光造影剂。迄今为止，已经提出了几种有效的策略，包括杂原子置换、增强电子d/a强度和延长共轭骨架长度，以将吸收波长转移到近红外二区窗口中，从而实现近红外二区光激发。然而，由于分子内电荷转移(ict)受限，荧光分子的吸收和发射波长偏短，这些化合物如花菁类、bodipy类以及部分共轭聚合物类的分子的发射波长集中在1000-1100纳米，容易受到活体组织光谱吸收以及背景荧光的影响，穿透能力较差，荧光成像效果难以满足需求。

技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种能够实现近红外二区光激发且具有较长发射波长的化合物。
5.本发明还提供了一种上述化合物的制备方法和应用，同时还提供了一种近红外ii-a荧光成像造影剂的制备方法。
6.为了实现以上目的，本发明的化合物所采用的技术方案是：
7.一种如式i所示的化合物：
8.9.式i中，r1为氢或c1～c30烷基；r2为式ii或式iii所示基团；
[0010][0011]
式ii中，n为1或2或3，r3、r4独立选自氢或c1～c10烷基；
[0012]
式iii中，r4为氢或c1～c10烷基。
[0013]
本发明的如式i所示的化合物，是一种以双噻吩苯并噻二唑基团作为电子受体，噻吩基团作为电子供体的d-a-d型有机小分子，具有扭曲构型的电子受体双噻吩苯并噻二唑基团有利于tict态的形成，使得该化合物具有扭曲分子内电荷转移特性(tict)，可被近红外-iia(1064nm)光源激发，发射波长为950-1400nm的荧光，实现更好的荧光成像效果。通过改变r2基团中电子给体噻吩基团个数、修饰端基钢性烷基链或引入大位阻乙撑二氧噻吩基团，可以对该类近红外ii-a荧光小分子的tict强度的调控。
[0014]
进一步地，r1为氢或c15～c25烷基，例如为c20烷基。在噻吩基团上连接烷基可以有效解决偶联聚合之后共轭高分子的溶解性，同时能够提高噻吩锡试剂的反应活性。进一步地，式i中，r1为氢或-ch2ch(r5)r6，r5为c8～c13烷基，r6为c6～c11烷基，例如r5为c10烷基，r6为c8烷基。式ii中，r3为氢或c4～c8烷基，例如为c6烷基。式iii中，r4为c4～c8烷基，例如为c6烷基。
[0015]
式i中，r1为-ch2ch(r5)r6，r5为c10直链烷基(即-(ch2)9ch3直链烷基)，r6为c8直链烷基(即-(ch2)7ch3直链烷基)；式ii中，r3为氢或c6直链烷基(即-(ch2)5ch3直链烷基)；式iii中，r4为c6直链烷基(即-(ch2)5ch3直链烷基)。
[0016]
本发明的式i所示的化合物的制备方法所采用的技术方案为：
[0017]
一种上述式i所示化合物的制备方法，包括以下步骤：将式iv所示的化合物与式v或式vi所示的化合物在有机溶剂中进行stille偶联反应生成如式i所示的化合物；
[0018][0019]
式iv中，r1为氢或c1～c30烷基，x为卤代基；
[0020]
式v中，n为1或2或3，r3为氢或c1-c10烷基；
[0021]
式vi中，r4为氢或c1-c10烷基。
[0022]
本发明的式i所示的化合物的制备方法，工艺简单，一步反应即可得到式i所示的化合物。
[0023]
进一步地，所述stille偶联反应的温度为90～110℃，例如为100℃，时间为12～24h，例如为24h；所述stille偶联反应在钯催化剂的作用下进行。所述钯催化剂为四(三苯
基膦)钯催化剂。所述stille偶联反应在无氧、无水环境中进行。有机溶剂在使用前经过除水和/或除氧处理，例如在有机溶剂中通入氮气或氩气进行鼓泡处理以脱除氧气。所述有机溶剂为无水甲苯。无水甲苯在使用前进行除氧处理。进一步地，式iv中，x优选为-cl、-br或-i。式iv所示的化合物与式v或式vi所示的化合物的摩尔比≤1:2，例如为1:3。
[0024]
进一步地，式iv中，r1为氢或-ch2ch(r5)r6，r5为c8～c13烷基，r6为c6～c11烷基，例如r5为c10烷基，r6为c8烷基。式v中，r3为氢或c4～c8烷基，例如为c6烷基。式vi中，r4为c4～c8烷基，例如为c6烷基。
[0025]
式iv中，r1为-ch2ch(r5)r6，r5为c10直链烷基(即-(ch2)9ch3直链烷基)，r6为c8直链烷基(即-(ch2)7ch3直链烷基)；式v中，r3为氢或c6直链烷基(即-(ch2)5ch3直链烷基)；式vi中，r4为c6直链烷基(即-(ch2)5ch3直链烷基)。
[0026]
进一步地，上述式i所示化合物的制备方法，还包括以下步骤：在将stille偶联反应结束后体系中加入有机溶剂溶解反应产物，固液分离，在所得液体中加入硅胶粉吸附反应产物后，将硅胶粉装柱后采用硅胶柱层析分离法以洗脱剂进行洗脱，收集反应产物溶液，除去溶剂。硅胶粉的粒径为200目，在体系中加入的有机溶剂为二氯甲烷，所述洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合液。
[0027]
本发明的式i所示的化合物的应用所采用的技术方案为：
[0028]
一种式i所示的化合物在荧光成像或制备荧光成像造影剂中的应用。利用本发明的式i化合物延伸至近红外二区的吸收以及独特的近红外-iia发射峰(tict发射峰红移至几乎零背景噪音的近红外-iia窗口)，将其用于非疾病的诊断和目的荧光成像时，能够在近红外二区激发的高分辨近红外-iia荧光成像。如本发明的式i所示的化合物可以作为细胞造影剂以及细胞内物质探针进行使用，如用于细胞器定位、细胞内环境检测等。
[0029]
本发明的近红外-iia荧光成像造影剂的制备方法所采用的技术方案为：
[0030]
一种近红外-iia荧光成像造影剂的制备方法，包括以下步骤：将所述的式i所示的化合物的有机溶液和两亲性嵌段共聚物水溶液在超声条件下进行混合，完成所述化合物与两亲性嵌段聚合物的自组装后除去来自于有机溶液的有机溶剂。
[0031]
本发明的近红外-iia荧光成像造影剂的制备方法，通过将具有可控tict特性的近红外-iia小分子与两亲性嵌段聚合物在溶液中自组装，制得tict型水溶性近红外-iia荧光成像造影剂。本发明的近红外-iia荧光成像造影剂的制备方法简单，制得的近红外ii-a荧光成像造影剂可被近红外二区光源激发，并实现在近红外-iia窗口的荧光成像，从而极大地提高了活体血管和肿瘤的成像质量。实验表明，本发明制得的近红外-iia荧光成像造影剂能够实现对小鼠活体血管和肿瘤的近红外二区激发的高分辨nir-iia荧光成像。
[0032]
进一步地，式i所示的化合物与两亲性嵌段共聚物的质量之比为1:5～100，例如为1:20。通过将两亲性嵌段共聚物与式i化合物进行自组装，可以实现式i化合物的水溶性，自组装形成的纳米结构具有良好的生物相容性。进一步地，所述两亲性嵌段共聚物为两亲性三嵌段共聚物。进一步地，所述两亲性嵌段共聚物为两亲性三嵌段聚合物f-127。将本发明的式i所示化合物(荧光成像小分子)与两亲性三嵌段聚合物f-127在溶液中自组装，得到的水溶性近红外-iia荧光成像造影剂具有显著的tict特性。
[0033]
可以理解的式i所示的化合物的有机良溶剂均可以作为有机溶剂的溶剂使用。进一步地，所述有机溶液采用的有机溶剂为四氢呋喃。所述有机溶液中式i所示的化合物的浓
度为0.1～1mg/ml，例如为0.1～0.5mg/ml，所述两亲性嵌段聚合物水溶液的浓度为1～20mg/ml，例如为1～2mg/ml。所述有机溶液与两亲性前段聚合物水溶液的体积比≤1:5。除去来自有机溶液的有机溶剂可以采用吹起挥发法。
附图说明
[0034]
图1为本发明实施例8～10中制得的化合物的核磁共振氢谱图；
[0035]
图2为本发明实施例8～10中制得的化合物的时间飞行质谱图；
[0036]
图3为本发明实施例11～13中制得的化合物的核磁共振氢谱图；
[0037]
图4为本发明实施例11～13中制得的化合物的时间飞行质谱图；
[0038]
图5为本发明实施例14中制得的化合物的核磁共振氢谱图；
[0039]
图6为本发明实施例14中制得的化合物的时间飞行质谱图；
[0040]
图7为本发明实验例1中由实施例16制得的近红外-iia荧光成像造影剂配制的造影剂溶液的透射电镜照片；
[0041]
图8为本发明实验例1中由实施例19制得的近红外-iia荧光成像造影剂配制的造影剂溶液的透射电镜照片；
[0042]
图9为本发明实验例1中由实施例21制得的近红外ii-a荧光成像造影剂配制的造影剂溶液的透射电镜照片；
[0043]
图10为本发明实施例16中制得的近红外-iia荧光成像造影剂的动态光散射测得的流体力学直径示意图；
[0044]
图11为本发明实施例19中制得的近红外-iia荧光成像造影剂的动态光散射测得的流体力学直径示意图；
[0045]
图12为本发明实施例21制得的近红外-iia荧光成像造影剂的动态光散射测得的流体力学直径示意图；
[0046]
图13为本发明实施例16、实施例19、实施例21中制备的近红外-iia荧光成像造影剂配制的造影剂水溶液的吸收光谱图谱；
[0047]
图14为本发明实施例16、实施例19、实施例21中制备的近红外-iia荧光成像造影剂配制的造影剂水溶液的荧光发射光谱图谱；
[0048]
图15为本发明实施例16、实施例19和实施例21中制备的近红外-iia荧光成像造影剂的1064纳米激光激发的发射光谱；
[0049]
图16为实验例2中造影剂水溶液的小鼠血管成像图；
[0050]
图17为实验例2中造影剂水溶液的小鼠肿瘤成像图。
具体实施方式
[0051]
以下结合具体实施方式本发明的技术方案作进一步的说明。
[0052]
实施例1
[0053]
本实施例的如式i所示的化合物为：
[0054][0055]
实施例2
[0056]
本实施例的如式i所示的化合物为：
[0057][0058]
实施例3
[0059]
本实施例的如式i所示的化合物为：
[0060][0061]
实施例4
[0062]
本实施例的如式i所示的化合物为：
[0063][0064]
实施例5
[0065]
本实施例的如式i所示的化合物为：
[0066][0067]
实施例6
[0068]
本实施例的如式i所示的化合物为：
[0069][0070]
实施例7
[0071]
本实施例的如式i所示的化合物为：
[0072][0073]
实施例8
[0074]
本实施例为实施例1中如式i所示化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0075]
在50ml的烧瓶中加入如式vii所示的双噻吩苯并噻二唑类化合物0.1mmol、如式viii所示化合物0.3mmol和催化剂四(三苯基膦)钯0.0006mmol，接上回流管，在避光条件下对整个体系进行抽真空充氮气，然后将经过鼓泡处理(通入的气体为氮气)的无水甲苯加入烧瓶中，在100℃下搅拌24h。反应结束后，加入二氯甲烷溶解反应产物，过滤除去不溶物质得粗产物溶液，加入50g硅胶粉(200目)，旋蒸除去所有溶剂使硅胶粉充分吸附粗产物，将吸附粗产物的硅胶粉装柱后采用硅胶柱层析分离法，用二氯甲烷/甲醇混合溶液洗脱，得到纯产物溶液。旋蒸除去溶剂后，经真空干燥，得到tict型近红外-iia荧光小分子终产物。合成路线为：
[0076][0077]
本实施例式vii所示的双噻吩苯并噻二唑类化合物中，烷基-c
10h21
和-c8h
17
均为直链烷基，烷基-c
10h21
的结构为-(ch2)9ch3，烷基-c8h
17
的结构为-(ch2)7ch3。
[0078]
本实施例制得的化合物的核磁共振氢谱图如图1(a)，飞行时间质谱图如图2(a)所示。
[0079]
实施例9
[0080]
本实施例为实施例2的如式i所示的化合物的制备方法，与实施例8的制备方法的区别仅在于：将实施例8中式viii所示化合物替换为如式ix所示化合物。合成路线为：
[0081][0082]
本实施例制得的化合物的核磁共振氢谱图如图1(b)，飞行时间质谱图如图2(b)所示。
[0083]
实施例10
[0084]
本实施例为实施例3的如式i所示的化合物的制备方法，与实施例8的制备方法的区别仅在于：将实施例8中式viii所示化合物替换为如式x所示化合物。合成路线为：
[0085][0086]
本实施例制得的化合物的核磁共振氢谱图如图1(c)，飞行时间质谱图如图2(c)所示。
[0087]
实施例11
[0088]
本实施例为实施例4的如式i所示的化合物的制备方法，包括以下步骤：与实施例8的制备方法的区别仅在于：将实施例8中式viii所示化合物替换为如式xi所示化合物(式xi中的烷基-c6h
13
为直链烷基，结构为-(ch2)5ch3)，合成路线为：
[0089][0090]
本实施例制得的化合物的核磁共振氢谱图如图3(a)，飞行时间质谱图如图4(a)所示。
[0091]
实施例12
[0092]
本实施例为实施例5的如式i所示的化合物的制备方法，与实施例8的制备方法的区别仅在于：将实施例8中式viii所示化合物替换为如式xii所示化合物(式xii中的烷基-c6h
13
为直链烷基，结构为-(ch2)5ch3)，合成路线为：
[0093][0094]
本实施例制得的化合物的核磁共振氢谱图如图3(b)，飞行时间质谱图如图4(b)所示。
[0095]
实施例13
[0096]
本实施例为实施例6的如式i所示的化合物的制备方法，与实施例8的制备方法的区别仅在于：将实施例8中式viii所示化合物替换为如式xiii所示化合物(式xiii中的烷基-c6h
13
为直链烷基，结构为-(ch2)5ch3)，合成路线为：
[0097]
[0098]
本实施例制得的化合物的核磁共振氢谱图如图3(c)，飞行时间质谱图如图4(c)所示。
[0099]
实施例14
[0100]
本实施例为实施例7的如式i所示的化合物的制备方法，与实施例8的制备方法的区别仅在于：将实施例8中式viii所示化合物替换为如式xiv所示化合物(式xiv中的烷基-c6h
13
为直链烷基，结构为-(ch2)5ch3)，合成路线为：
[0101][0102]
本实施例制得的化合物的核磁共振氢谱图如图5，飞行时间质谱图如图6所示。
[0103]
实施例15～21
[0104]
实施例15～实施例21的近红外-iia荧光成像造影剂的制备方法，包括以下步骤：
[0105]
将式i所示化合物的四氢呋喃溶液(记为溶液a)在剧烈超声条件下直接加入到两亲性三嵌段聚合物f-127的水溶液(记为溶液b)中进行混合，在超声条件下完成自组装后将多余的四氢呋喃有机溶剂通过吹气挥发的方式除去，即可得到近红外-iia荧光成像造影剂；溶液a与溶液b的体积之比为1:5。实施例15～21的制备方法中所采用的式i所示化合物以及溶液a中式i所示化合物的浓度、溶液b中两亲性三前段聚合物f-127的浓度见表1。
[0106]
表1实施例15～21中所采用的式i所示化合物以及溶液a中式i所示化合物的浓度、溶液b中两亲性三前段聚合物f-127的浓度
[0107]
[0108]
实验例1
[0109]
分别将实施例16、实施例19和实施例21中制得的近红外-iia荧光成像造影剂配制成式i化合物浓度为0.01mg/ml的造影剂水溶液。
[0110]
1)采用透射电镜测试各造影剂水溶液，得到透射电镜图(见图7～9)以及各实施例的造影剂中纳米粒子的粒径，结果见表2。
[0111]
表2实施例16、实施例19和实施例21制得的造影剂中纳米粒子的粒径
[0112] 造影剂中纳米粒子的粒径(nm)实施例1630～80实施例1940～90实施例2140～100
[0113]
2)根据动态光散射分别测定各造影剂水溶液的流体力学半径，如图10～12所示，由图可知，实施例16、实施例19和实施例21中制得的近红外-iia荧光成像造影剂的流体力学半径依次为60nm、88nm、90nm。
[0114]
3)分别测定实各造影剂水溶液的吸收和荧光发射光谱，如图13和图14所示。
[0115]
由图13与14可以看出，它们的近红外吸收峰在900纳米波段左右，并在1064纳米处仍有较好的吸收，而发射谱图则表现出两个明显的主峰，分别在1100和1300纳米左右，明显是近红外-iia发射材料。
[0116]
4)分别测定各造影剂水溶液的1064纳米激光激发的发射光谱，如图15所示。
[0117]
由图15可知，发射峰在1275纳米波段，发射波段延伸至近红外-iia窗口，明显是近红外二区光源可激发的材料。
[0118]
实验例2
[0119]
将实施例21中制得的近红外-iia荧光成像造影剂配制成式i化合物浓度为0.15mg/ml的造影剂水溶液。
[0120]
1)选用携带有小鼠乳腺癌细胞的荷瘤鼠，尾静脉注射150微升配制好的造影剂水溶液后，用近红外二区成像仪对小鼠进行局部(脑部，腹部和腿部)血管成像(光源为波长1064nm的激光)，血管成像图如图16所示，由图可知成像部位的主干血管和分支血管与周围的背景组织清晰区分，显示了使用小分子七造影剂高分辨率的近红外-iia荧光成像。
[0121]
2)选用携带有小鼠乳腺癌细胞的荷瘤鼠，尾静脉注射150微升配制好的造影剂水溶液后，在不同时间点用近红外二区成像仪对小鼠进行肿瘤处成像(光源为波长1064nm的激光)，肿瘤成像图如图17所示，由图可以看出，在尾静脉注射8-24小时后，该造影剂在肿瘤部位(虚线圈)有明显富集，二区荧光强度明显高于周围组织，证明其可对癌症病灶成像。

技术特征：

1.一种如式i所示的化合物：式i中，r1为氢或c1～c30的烷基，r2为式ii或式iii所示基团；式ii中，n为1或2或3，r3为氢或c1-c10烷基；式iii中，r4为氢或c1-c10烷基。2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：式i中，r1为-ch2ch(r5)r6，r5为c8～c13烷基，r6为c6～c11烷基；式ii中，r3为氢或c4～c8烷基；式iii中，r4为c4～c8烷基。3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：r1为-ch2ch(r5)r6，r5为c10直链烷基，r6为c8直链烷基；式ii中，r3为氢或c6直链烷基；式iii中，r4为c6直链烷基。4.一种如权利要求1～3中任意一项所述的化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将式iv所示的化合物与式v或式vi所示的化合物在有机溶剂中进行stille偶联反应生成如式i所示的化合物；式iv中，r1为氢或c1～c30的烷基，x为卤代基；式v中，n为1或2或3，r3为氢或c1-c10烷基；式vi中，r4为氢或c1-c10烷基。5.根据权利要求4所述的化合物的制备方法，其特征在于：所述stille偶联反应的温度为90-110℃，时间为12-24h；所述stille偶联反应在钯催化剂的作用下进行。6.根据权利要求4所述的化合物的制备方法，其特征在于：所述stille偶联反应在无氧环境中进行；式iv中，x为-cl、-br或-i；式iv所示的化合物与式v或式vi所示的化合物的摩尔比≤1:2。7.一种如权利要求1～3中任意一项所述的化合物在荧光成像或制备荧光成像造影剂中的应用。
8.一种近红外-iia荧光成像造影剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将如权利要求1～3中任意一项所述的式i所示的化合物的有机溶液和两亲性嵌段共聚物水溶液在超声条件下进行混合，完成所述化合物与两亲性嵌段聚合物的自组装后除去来自于有机溶液的有机溶剂。9.根据权利要求8所述的荧光成像造影剂的制备方法，其特征在于：式i所示的化合物与两亲性嵌段共聚物的质量之比为1:5～100；所述两亲性嵌段共聚物为两亲性三嵌段共聚物。10.根据权利要求8或9所述的荧光成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述有机溶液中式i所示的化合物的浓度为0.1～1mg/ml，所述两亲性嵌段聚合物水溶液的浓度为1～20mg/ml。

技术总结

本发明涉及一种化合物及其制备方法和应用、近红外-IIa荧光成像造影剂的制备方法，属于纳米生物医学成像技术领域。本发明的如式I所示的化合物，是一种以双噻吩苯并噻二唑基团作为电子受体，噻吩基团作为电子供体的D-A-D型有机小分子，具有扭曲构型的电子受体双噻吩苯并噻二唑有利于TICT态的形成，使得该化合物具有扭曲分子内电荷转移特性(TICT)，可被近红外-IIa(1064)光源激发，发射波长范围950-1400nm，实现更好的荧光成像效果。实现更好的荧光成像效果。实现更好的荧光成像效果。