一种诱导剂、巨噬细胞及其应用

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1.本发明涉及免疫学、细胞生物学和再生医学交叉领域，具体而言，涉及一种诱导剂、巨噬细胞及其应用。

背景技术：

2.糖尿病及其并发症严重危害全球人类健康。其中，俗称“糖尿病足”的下肢溃疡，是一种难愈合甚至不愈合的皮肤创伤，已成为下肢截肢的首要原因。然而，对于糖尿病足目前尚无针对性策略或药物，以常规护理和清创为主，效果不佳，复发率高。
3.在创伤修复过程中，作为固有免疫系统核心成员的巨噬细胞(及其前体单核细胞)，发挥着关键作用。例如，在创伤早期，这类细胞发挥吞噬病原体、招募细胞、促进血管新生等作用；在修复后期，这类细胞促进成纤维细胞增殖、血管成熟、基质重塑。大量病理学研究表明，在糖尿病创伤局部，巨噬细胞功能的紊乱直接导致该类创伤愈合受阻。在体外对自体来源单核/巨噬细胞的功能进行塑造后移植至创面部位，有望成为促进创面修复的策略。
4.目前，国际国内尚无能够有效修复床上的巨噬细胞，鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种诱导剂、巨噬细胞及其应用。
6.本发明是这样实现的：
7.第一方面，本发明实施例提供了一种诱导剂，其包括：骨桥素和细胞因子，所述细胞因子选自mip-2、ccl8、vegf-b和m-csf中的至少一种。
8.第二方面，本发明实施例提供了一种培养基，其包括如前述实施例所述的诱导剂。
9.第三方面，本发明实施例提供了一种巨噬细胞的制备方法，其包括：采用如前述实施例所述的诱导剂对单核细胞进行诱导分化或采用如前述实施例所述的培养基对单核细胞进行分化培养，以获得用于组织创伤修复的巨噬细胞。
10.第四方面，本发明实施例提供了一种巨噬细胞，其由前述实施例所述的巨噬细胞的制备方法制备获得。
11.第五方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的诱导剂、或如前述实施例所述的培养基，或如前述实施例所述的巨噬细胞在制备用于组织创伤修复的药物中的应用。
12.第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的诱导剂、或如前述实施例所述的培养基，或如前述实施例所述的巨噬细胞在制备用于促血管新生的药物中的应用。
13.第七方面，本发明实施例提供了一种用于组织创伤修复的药物，其包括如前述实施例所述的巨噬细胞。
14.本发明具有以下有益效果：
15.本发明使用骨桥素opn及其他细胞因子组成的组合物对单核细胞进行培养诱导，能够形成具有较强修复功能的巨噬细胞，这些局势细胞能够应用于组织创面修复，促进慢
性难愈合创伤的愈合和组织再生，具有较好的修复效果，适用于推广应用。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
17.图1为opn及其他细胞因子的浓度配比；
18.图2为试验例1中通过实施例12-14步骤诱导人外周血单核细胞所得的11种修复型巨噬细胞的形态图(与未诱导m0对比)；
19.图3为试验例1中的主要基因表达；
20.图4为试验例2中可体外促进血管新生；
21.图5为试验例3中促进成纤维细胞活化；
22.图6为试验例4中在体内促进糖尿病小鼠皮肤创面愈合；
23.图7为试验例4中可促进糖尿病小鼠伤口处成纤维细胞的胶原分泌；
24.图8为试验例4中可促进糖尿病小鼠伤口处血管新生及成熟。
具体实施方式
25.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
26.本发明提供了一种诱导剂，其包括：骨桥素和细胞因子，所述细胞因子选自mip-2、ccl8、vegf-b和m-csf中的至少一种。
27.骨桥素，(又称骨桥蛋白，英文osteopontin，英文为opn)是一种糖基化蛋白，作为一种“非胶原”的细胞外基质成分，广泛存在与多种细胞外基质中。
28.经一系列创造性劳动，发明人发现将opn和细胞因子组合后用于单核细胞的诱导分化，能获得巨噬细胞相对于通常的巨噬细胞而言，具有较强的修复功能，能够促进创面愈合和组织修复再生。
29.当所述诱导剂包括mip-2时，骨桥素与mip-2的质量比为(80～120)：(27～47)；
30.当所述诱导剂包括ccl8时，骨桥素与ccl8的质量比为(80～120)：(9～29)；
31.当所述诱导剂包括vegf-b时，骨桥素与vegf-b的质量比为(80～120)：(5～20)；
32.当所述诱导剂包括m-csf时，骨桥素与m-csf的质量比为(80～120)：(1～18)。
33.优选地，按重量份数计，所述诱导剂包括以下组分：80～120份骨桥素，27～47份mip-2，9～29份ccl8，5～20份vegf-b以及1～18份m-csf。在该限定下，诱导剂诱导分化的具有更好的修复功效。
34.在一些实施例中，骨桥素的份数可以为80份、85份、90份、95份、100份、105份、110
份、115份或120份；mip-2的份数可以为27份、30份、35份、40份、45份或47份；ccl8的份数可以为9份、10份、15份、20份、25份或29份；vegf-b的份数可以为5份、10份、15份或20份；m-csf的份数可以为1份、5份、10份、15份或18份。
35.优选地，所述诱导剂还包括：il-31、il-10、tgf-β2和bfgf中的至少一种组分。
36.优选地，当所述诱导剂包括il-31时，il-31与骨桥素的重量比为(0.06～0.10)：1。在一些实施例中，il-31与骨桥素的重量比可以为0.06：1、0.08：1或0.10：1。
37.优选地，当所述诱导剂包括il-10时，il-10与骨桥素的重量比为(0.04～0.08)：1。在一些实施例中，il-10与骨桥素的重量比可以为0.04：1、0.06：1或0.08：1。
38.优选地，当所述诱导剂包括tgf-β2时，tgf-β2与骨桥素的重量比为(0.02～0.06)：1。在一些实施例中，tgf-β2与骨桥素的重量比可以为0.02：1、0.03：1、0.04：1、0.05：1或0.06：1。
39.优选地，当所述诱导剂包括bfgf时，bfgf与骨桥素的重量比为(0.01～0.05)：1。在一些实施例中，bfgf与骨桥素的重量比可以为0.01：1、0.02：1、0.03：1、0.04：1、0.05：1或0.06：1。
40.当诱导剂包含由这些细胞因子且按照上述配比进行添加时，能够诱导分化出修复能力更好的
41.本发明实施例提供了一种培养基，其包括如前述任意实施例所述的诱导剂。
42.可选地，所述培养基包括培养基基质以及诱导剂。培养基基质可以选自现有已知用于培养细胞的培养基。
43.优选地，所述培养基基质为rpmi-1640培养液。
44.本发明实施例提供了一种修复型巨噬细胞的制备方法，其包括：采用如前述实施例所述的诱导剂对待诱导的巨噬细胞进行诱导分化或采用如前述实施例所述的培养基对待诱导的巨噬细胞进行分化培养，以获得修复型巨噬细胞。
45.本文中的“待诱导的巨噬细胞”可以为由单核细胞分化的外周血巨噬细胞。单核细胞来源于骨髓中的前体细胞。
46.优选地，当采用所述培养基对待诱导的巨噬细胞进行分化培养时，所述诱导剂中骨桥素在所述培养基中的终浓度为100～150ng/ml。该浓度范围内，诱导的修复型巨噬细胞具有更好的修复功效。
47.具体地，骨桥素在所述培养基中的终浓度可以为100ng/ml、105ng/ml、110ng/ml、115ng/ml、120ng/ml、125ng/ml、130ng/ml、135ng/ml、140ng/ml、145ng/ml或150ng/ml。
48.当所述诱导剂包括mip-2时，mip-2在所述培养基中的终浓度为32～52ng/ml。具体地，mip-2在所述培养基中的终浓度可以为32ng/ml、34ng/ml、36ng/ml、38ng/ml、40ng/ml、42ng/ml、44ng/ml、46ng/ml、48ng/ml、50ng/ml或52ng/ml。
49.当所述诱导剂包括ccl8时，ccl8在所述培养基中的终浓度为11～31ng/ml。具体地，ccl8在所述培养基中的终浓度可以为11ng/ml、13ng/ml、15ng/ml、17ng/ml、19ng/ml、21ng/ml、23ng/ml、25ng/ml、27ng/ml、29ng/ml或31ng/ml。
50.当所述诱导剂包括vegf-b时，vegf-b在所述培养基中的终浓度为1～21ng/ml。具体地，ccl8在所述培养基中的终浓度可以为1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、7ng/ml、9ng/ml、11ng/ml、13ng/ml、15ng/ml、17ng/ml、19ng/ml或21ng/ml。
51.当所述诱导剂包括m-csf时，m-csf在所述培养基中的终浓度为1～20ng/ml。具体地，m-csf在所述培养基中的终浓度可以为1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、7ng/ml、9ng/ml、11ng/ml、13ng/ml、15ng/ml、17ng/ml、19ng/ml或20ng/ml。
52.当所述诱导剂包括il-31时，il-31在所述培养基中的终浓度为1～20ng/ml。具体地，il-31在所述培养基中的终浓度可以为1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、7ng/ml、9ng/ml、11ng/ml、13ng/ml、15ng/ml、17ng/ml、19ng/ml或20ng/ml。
53.当所述诱导剂包括il-10时，il-10在所述培养基中的终浓度为1～15ng/ml。具体地，il-10在所述培养基中的终浓度可以为1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、7ng/ml、9ng/ml、11ng/ml、13ng/ml或15ng/ml。
54.当所述诱导剂包括tgf-β2时，tgf-β2在所述培养基中的终浓度为1～10ng/ml。具体地，tgf-β2在所述培养基中的终浓度可以为1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、7ng/ml、9ng/ml或10ng/ml。
55.当所述诱导剂包括bfgf时，bfgf在所述培养基中的终浓度为1～6ng/ml。具体地，bfgf在所述培养基中的终浓度可以为1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml或6ng/ml。
56.优选地，所述诱导分化的培养时间为1～3天，优选为2天。
57.本发明实施例还提供了一种巨噬细胞，其由前述任意实施例所述的巨噬细胞的制备方法制备获得。
58.由上述制备方法制备获的修复型巨噬细胞来源于人外周血单核细胞，经诱导后高表达cd86，cd163,cd206等表面生物标志物，高分泌il-10，il-16，tgf-β等促进免疫抑制的细胞因子，高分泌amphiregulin，igfbp-3，ang等促进血管新生的细胞因子，高分泌vegf-a，pdgf-b，bfgf等促进细胞增殖和基质分泌的细胞因子，体外培养具有增殖能力(ki67阳性)；且表型较为稳定，偏抑炎型。
59.可选地，所述制备方法还包括：对单核细胞进行诱导培养，以获得巨噬细胞(待诱导的巨噬细胞)。
60.本发明实施例还提供如前述任意实施例所述的诱导剂、或如前述任意实施例所述的培养基，或如前述任意实施例所述的巨噬细胞在制备用于组织创伤修复的药物中的应用。
61.优选地，所述用于组织创伤修复包括：糖尿病患者组织创伤的修复。
62.糖尿病患者由于体内胰岛素分泌调节功能不正常，影响了机体的糖代谢，使糖的利用率降低，组织的再生修复功能受累，从而造成伤口延迟愈合。本发明提供的巨噬细胞能够有效促进糖尿病患者组织创伤的修复，为难修复的创伤提供了一种新的途径。
63.本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的诱导剂、或如前述任意实施例所述的培养基，或如前述任意实施例所述的巨噬细胞在制备用于促血管新生的药物中的应用。
64.本发明实施例还提供了一种用于组织创伤修复的药物，其包括如前述任意实施例所述的巨噬细胞。
65.可选地，所述药物还可以包括其他已知用于组织创伤修复的制剂。
66.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
67.实施例1
68.一种诱导剂的制备，其包括：opn(spp1)、mip-2、ccl8、vegf-b、m-csf、il-31、il-10、tgf-β2和bfgf。
69.其中，opn:mip-2:ccl8:vegf-b:m-csf＝1:0.37:0.19:0.1:0.08(质量比)。
70.opn：il-31：il-10：tgf-β2：bfgf＝1：0.08：0.06：0.04：0.03(质量比)。
71.实施例2
72.一种诱导剂的制备，大致与实施例1相同，区别在于，诱导剂不包含：il-31、il-10、tgf-β2和bfgf。
73.实施例3
74.一种诱导剂的制备，大致与实施例1相同，区别在于，诱导剂不包含：mip-2、ccl8、vegf-b、m-csf、il-31、il-10、tgf-β2和bfgf。
75.实施例4
76.一种诱导剂的制备，大致与实施例1相同，区别在于，诱导剂不包含：opn、ccl8、vegf-b、m-csf、il-31、il-10、tgf-β2和bfgf。
77.实施例5
78.一种诱导剂的制备，大致与实施例1相同，区别在于，诱导剂不包含：opn、mip-2、vegf-b、m-csf、il-31、il-10、tgf-β2和bfgf。
79.实施例6
80.一种诱导剂的制备，大致与实施例1相同，区别在于，诱导剂不包含：opn、mip-2、ccl8、m-csf、il-31、il-10、tgf-β2和bfgf。
81.实施例7
82.一种诱导剂的制备，大致与实施例1相同，区别在于，诱导剂不包含：opn、mip-2、ccl8、vegf-b、il-31、il-10、tgf-β2和bfgf。
83.实施例8
84.一种诱导剂的制备，大致与实施例1相同，区别在于，诱导剂不包含：opn、mip-2、ccl8、vegf-b、m-csf、il-10、tgf-β2和bfgf。
85.实施例9
86.一种诱导剂的制备，大致与实施例1相同，区别在于，诱导剂不包含：opn、mip-2、ccl8、vegf-b、m-csf、il-31、tgf-β2和bfgf。
87.实施例10
88.一种诱导剂的制备，大致与实施例1相同，区别在于，诱导剂不包含：opn、mip-2、ccl8、vegf-b、m-csf、il-31、il-10和bfgf。
89.实施例11
90.一种诱导剂的制备，大致与实施例1相同，区别在于，诱导剂不包含：opn、mip-2、ccl8、vegf-b、m-csf、il-31、il-10和tgf-β2。
91.实施例12
92.一种修复型巨噬细胞的制备方法，其包括以下步骤。
93.(1)外周血巨噬细胞的制备：
94.通过密度梯度离心的方法得到人外周血单个核细胞，之后通过磁珠分选方法，用cd14磁珠将人外周血单核细胞纯化出来。
95.用含有20ng/ml人m-csf的rpmi-1640培液体外诱导7天，单核细胞分化成人外周血巨噬细胞(待诱导的巨噬细胞)。
96.(2)修复型巨噬细胞的制备：
97.用含有实施例1提供诱导剂的rpmi-1640培养液体外培养人外周血巨噬细胞2天，培养时，诱导剂中各组分在rpmi-1640培养液中的终浓度如下(参照图1)：骨桥素的终浓度为113.215ng/ml，mip-2的终浓度为42.513ng/ml，ccl8的终浓度为21.894ng/ml，vegf-b的终浓度为11.799ng/ml，m-csf的终浓度为10.157ng/ml，il-31的终浓度为9.102ng/ml，il-10的终浓度为7.372ng/ml，tgf-β2的终浓度为5.211ng/ml，bfgf的终浓度为3.522ng/ml。
98.2天后，得到的细胞形态如附图2所示，呈现出更长的细胞直径，于成纤维细胞有一定的相似。
99.实施例13
100.一种修复型巨噬细胞的制备方法，大致与实施例12相同，区别在于诱导剂的不同，区别如下。
101.用含有实施例2提供诱导剂的rpmi-1640培养液体外培养人外周血巨噬细胞2天。其中，骨桥素的终浓度为113.215ng/ml，mip-2的终浓度为42.513ng/ml，ccl8的终浓度为21.894ng/ml，vegf-b的终浓度为11.799ng/ml，m-csf的终浓度为10.157ng/ml。
102.诱导出的修复型巨噬细，记为的胞形态图如附图2所示，较未诱导的巨噬细胞相比，opn诱导的巨噬细胞直径稍长，且密度更多。
103.实施例14
104.其他修复型巨噬细胞的制备方法，大致与实施例12相同，区别在于诱导剂的不同，区别如下。
105.分别用含有实施例3-11提供诱导剂的rpmi-1640培养液体外培养人外周血巨噬细胞2天。其中，骨桥素的终浓度为113.215ng/ml，mip-2的终浓度为42.513ng/ml，ccl8的终浓度为21.894ng/ml，vegf-b的终浓度为11.799ng/ml，m-csf的终浓度为10.157ng/ml，il-31的终浓度为9.102ng/ml，il-10的终浓度为7.372ng/ml，tgf-β2的终浓度为5.211ng/ml，bfgf的终浓度为3.522ng/ml。用实施例3诱导的修复型巨噬细胞记为+opn，用实施例4诱导的修复型巨噬细胞记为+mip-2，用实施例5诱导的修复型巨噬细胞记为+ccl8，用实施例6诱导的修复型巨噬细胞记为+vegf-b，用实施例7诱导的修复型巨噬细胞记为+m-csf，用实施例8诱导的修复型巨噬细胞记为+il-31，用实施例9诱导的修复型巨噬细胞记为+il-10，用实施例10诱导的修复型巨噬细胞记为+tgf-β，用实施例11诱导的修复型巨噬细胞记为+bfgf。得到的所有的修复型巨噬细胞形态如图2所示。
106.试验例1
107.基于实施例12-14的制备方法，得到的11种修复型巨噬细胞，用显微镜拍照，结果如图2所示，与其他种类的巨噬细胞比，呈现出更长的细胞直径，于成纤维细胞有一定的相似。m0为未极化的巨噬细胞。所以接下俩是试验例主要研究
108.试验例2
109.检测的主要表达基因。
110.基于实施例12的制备方法，获取通过trizol法提取其mrna，通过rt-qpcr方法分析的主要基因表达，结果如附图4所示，同时表达m1和m2的表面标志物(附图3)。而且还高表达促血管新生和促基质细胞增殖的相关基因。
111.试验例3
112.在体外诱导血管新生的测试。
113.基于实施例12的制备方法，获取将基质胶matrigel铺在μ-slide板上。
114.之后将人血管内皮细胞(huvecs)种在基质胶上，分别加入m0-cm、m1-cm、m2-cm和培养，正常培液(normal medium)作为阴性对照，vegf为阳性对照，如附图4所示，相对于其他细胞，有很强的促血管新生的能力。
115.试验例4
116.在体外促进成纤维细胞活化的测试。
117.基于实施例12的制备方法，获取
118.用收集的四种细胞的培养上清(试验例2中的m0-cm、m1-cm、m2-cm和)分别去培养小鼠成纤维细胞(l929)，通过免疫荧光观察其平滑肌动蛋白(α-sma)和胶原的表达情况。
119.如附图5所示，与其他细胞相比，能更好地活化成纤维细胞。
120.试验例5
121.在体内促进糖尿病小鼠皮肤创面愈合。
122.为了验证的促再生能力，本试验例将其运用在免疫缺陷的糖尿病小鼠伤口模型中。
123.腹腔注射钠(50mg/kg)麻醉小鼠，在其背部造出一个直径为6mm大小的全层切除伤口。将3
×
105个(实施例12)种植在明胶纺织的静电纺丝上，之后移植在伤口处，用同样的方法移植其他对照巨噬细胞。分别在0，3，7，11，15，21天观察其伤口大小，结果如附图6所示，相较于其他巨噬细胞，在促伤口愈合方面，展现出更强的能力。附图7同时证明了可以促进伤口处成纤维细胞的胶原的沉积。以及附图8展示了促进伤口处血管的新生以及成熟。
124.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种诱导剂，其特征在于，其包括：骨桥素和细胞因子，所述细胞因子选自mip-2、ccl8、vegf-b和m-csf中的至少一种。2.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，按重量份数计，当所述诱导剂包括mip-2时，骨桥素与mip-2的质量比为(80～120)：(27～47)；当所述诱导剂包括ccl8时，骨桥素与ccl8的质量比为(80～120)：(9～29)；当所述诱导剂包括vegf-b时，骨桥素与vegf-b的质量比为(80～120)：(5～20)；当所述诱导剂包括m-csf时，骨桥素与m-csf的质量比为(80～120)：(1～18)。3.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述诱导剂还包括：il-31、il-10、tgf-β2和bfgf中的至少一种组分；优选地，当所述诱导剂包括il-31时，il-31与骨桥素的重量比为(0.06～0.10)：1；优选地，当所述诱导剂包括il-10时，il-10与骨桥素的重量比为(0.04～0.08)：1；优选地，当所述诱导剂包括tgf-β2时，tgf-β2与骨桥素的重量比为(0.02～0.06)：1；优选地，当所述诱导剂包括bfgf时，bfgf与骨桥素的重量比为(0.01～0.05)：1。4.一种培养基，其特征在于，其包括如权利要求1～3任一项所述的诱导剂。5.一种修复型巨噬细胞的制备方法，其特征在于，其包括：采用如权利要求1～3任一项所述的诱导剂对待诱导的巨噬细胞进行诱导分化或采用如权利要求4所述的培养基对待诱导的巨噬细胞进行培养，以获得修复型巨噬细胞。6.根据权利要求5所述的修复型巨噬细胞的制备方法，其特征在于，当采用所述培养基对单核细胞进行分化培养时，所述诱导剂中骨桥素在所述培养基中的终浓度为100～150ng/ml；当所述诱导剂包括mip-2时，mip-2在所述培养基中的终浓度为32～52ng/ml；当所述诱导剂包括ccl8时，ccl8在所述培养基中的终浓度为11～31ng/ml；当所述诱导剂包括vegf-b时，vegf-b在所述培养基中的终浓度为1～21ng/ml；当所述诱导剂包括m-csf时，m-csf在所述培养基中的终浓度为1～20ng/ml；当所述诱导剂包括il-31时，il-31在所述培养基中的终浓度为1～20ng/ml；当所述诱导剂包括il-10时，il-10在所述培养基中的终浓度为1～15ng/ml；当所述诱导剂包括tgf-β2时，tgf-β2在所述培养基中的终浓度为1～10ng/ml；当所述诱导剂包括bfgf时，bfgf在所述培养基中的终浓度为1～6ng/ml；优选地，所述诱导分化的培养时间为1～3天。7.一种修复型巨噬细胞，其特征在于，其由权利要求5或6所述的修复型巨噬细胞的制备方法制备获得。8.如权利要求1～3任一项所述的诱导剂、或如权利要求4所述的培养基，或如权利要求7所述的修复型巨噬细胞在制备用于组织创伤修复的药物中的应用；优选地，所述用于组织创伤修复包括：糖尿病患者组织创伤的修复。9.如权利要求1～3任一项所述的诱导剂、或如权利要求4所述的培养基，或如权利要求7所述的修复型巨噬细胞在制备用于促血管新生的药物中的应用。10.一种用于组织创伤修复的药物，其特征在于，其包括如权利要求7所述的巨噬细胞。

技术总结

本发明公开了一种诱导剂、巨噬细胞及其应用，涉及免疫学、细胞生物学和再生医学交叉领域。本发明使用骨桥素OPN及其他细胞因子组成的组合物对单核细胞进行培养诱导，能够形成具有较强修复功能的巨噬细胞，这些局势细胞能够应用于组织创面修复，促进慢性难愈合创伤的愈合和组织再生，具有较好的修复效果，适用于推广应用。广应用。广应用。