一种协同化疗药物肝癌的牡丹籽粕提取物及其制备方法与应用

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1.本发明涉及一种协同化疗药物肝癌的牡丹籽粕提取物及其制备方法与应用。

背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的一些理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.原发性肝癌在我国是一种常见的恶性肿瘤，具有发展快，易转移和复发率高的特点，现已成为全球第二大恶性肿瘤疾病，在我国以40-49岁的发病率最高。因缺乏早期症状，肝癌诊断时多为晚期。目前以手术切除为主要手段，但肝癌手术后会存在较高的复发率。化学是肝癌非手术的主要方法，有效率在10％-20％，其效果良好，但长期使用会增加肿瘤的耐药性，且具有严重的毒副作用，因此，探索一种有效的策略以及新的药物组合物的应用，对肝癌的具有突破性意义。
4.环磷酰胺(ctx)属于氮芥类抗肿瘤药物，体外无活性，其体内代谢产物与细胞dna发生烷化作用，从而抑制肿瘤细胞的生长繁殖。环磷酰胺是广谱抗肿瘤药物是目前应用最为广泛的抗癌药物之一。然而环磷酰胺发挥抗肿瘤作用的同时也会对正常组织细胞造成一定的损害作用，如骨髓抑制、胃肠道反应、免疫力低下等。
5.牡丹籽粕是油用牡丹籽经脱壳压榨制取牡丹籽油后的副产物，含有蛋白质、维生素、多糖、氨基酸等营养成分。目前牡丹籽粕仅作为肥料或者饲料被直接使用造成了资源的严重浪费。现有研究表明牡丹籽油具有抗氧化、保肝、降血脂等多种保健功能，但是关于牡丹籽粕抗癌效果的研究甚少。
6.中国专利公开了“一种牡丹籽提取物及其作为抗肿瘤药物的应用”(201710658187.8)，从细胞层面研究了牡丹籽提取物的抗癌效果但仅限于体外研究，但体外评价较为局限，化合物在体外具有较好活性，但其进入体内代谢之后活性可能消失。
7.目前尚没有应用牡丹籽粕提取物和环磷酰胺组成药物组合物肝癌的相关报道，也没有使用牡丹籽粕提取物与环磷酰胺联用用来降低抗肝癌的环磷酰胺一些副作用的相关报道。

技术实现要素：

8.针对以上背景技术，本发明的目的是提供一种能够协同环磷酰胺抗肿瘤活性的牡丹籽粕提取物，并防治环磷酰胺化疗过程中所致的白细胞减少症和胸腺、脾脏指数降低现象，该发明涉及协同化疗药物荷瘤小鼠的牡丹籽粕提取物制备方法及用途。
9.具体的，本发明采用以下技术方案：
10.在本发明的第一个方面，提供牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺在制备抗肝癌药物组合中的应用。
11.在本发明的一个或一些实施方式中，所述牡丹籽粕提取物是以醇提的方式制备获得。
12.在本发明的一个或一些实施方式中，所述牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺联合应用时，牡丹籽粕提取物与环磷酰胺的浓度配比为1～4:1。
13.在本发明的一个或一些实施方式中，所述牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺联合应用时，牡丹籽粕提取物浓度为5～20mg/ml，环磷酰胺浓度为5mg/ml。
14.在本发明的一个或一些实施方式中，所述牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺联合应用时，所述的环磷酰胺药物采用腹腔注射的方式进行给药。
15.在本发明的一个或一些实施方式中，所述牡丹籽粕提取物是以除环磷酰胺外所述牡丹籽粕提取物作为唯一活性成分。
16.在本发明的第二个方面，提供一种牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺在制备防治肝癌中环磷酰胺化疗过程中所致的白细胞减少和/或者提高由环磷酰胺引起的胸腺以及脾脏指数降低和/或者降低肝癌患者谷丙转氨酶(alt)水平药物中的应用。
17.其中，所述肝癌患者为包括但不限于人和哺乳动物等。
18.在本发明的第三个方面，提供一种具有协同作用的抗肝癌药物组合物，包括环磷酰胺和牡丹籽粕提取物。
19.在本发明的第四个方面，提供一种具有协同环磷酰胺抗肝癌作用的牡丹籽粕提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：油用牡丹籽经脱壳、压饼处理或液压后的牡丹籽粕，经粉碎、造粒处理后，以丁烷为萃取剂，在压强0.3mpa-0.8mpa，萃取温度为20℃-50℃的条件下，萃取1-4次，得油脂含量≤1.5％的脱脂油用牡丹籽粕；以甲醇或乙醇为溶剂，醇浓度为50v/v％-95v/v％，料液比1：5-1：20，提取温度30℃-50℃，提取时间1h-4h的条件下，提取1-3次，提取液经喷雾干燥得牡丹籽粕提取物。
20.与本发明人知晓的相关技术相比，本发明其中的一个技术方案具有如下有益效果：
21.1.本发明的牡丹籽粕提取物，不仅能够协同环磷酰胺增强其抗肝癌肿瘤活性，而且还升高环磷酰胺化疗所致的白细胞减少，为临床化疗提供新方向。
22.2.本发明的牡丹籽粕提取物，可以显著提高由环磷酰胺引起的胸腺和脾脏指数降低现象，对胸腺和脾脏具有保护作用。
23.3.本发明原料牡丹籽粕为牡丹籽油压榨废弃物，通过研究牡丹籽粕提取物协同环磷酰胺对肝癌细胞具有抗肿瘤作用，探索牡丹籽粕开发利用价值，发掘其潜在医学价值。为扩大牡丹产业链，提高牡丹籽粕的综合利用率提供理论依据。
24.4.本发明构建了肝癌小鼠模型，该提取物经灌胃给药后能够协同环磷酰胺对肝癌细胞具有抗肿瘤作用，并能够防治环磷酰胺所致的白细胞减少症，应用前景广阔；为肿瘤化疗药物的协同药物筛选提供了依据。
附图说明
25.构成本发明一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
26.图1.各组小鼠肿瘤重量及抑瘤率结果a.各组小鼠肿瘤剥离后重量结果；b.各给药
组小鼠抑瘤率结果；注：与模型组相比，#p＜0.05，##p＜0.01；与环磷酰胺组相比，*p《0.05,**p＜0.01。
27.图2.各组小鼠血清中血细胞细胞计数比较a.各组小鼠血清中白细胞计数比较；b.小鼠血清中红细胞计数比较注:与正常对照组相比，
△
p＜0.05，
△△
p＜0.01；与模型组相比，#p＜0.05，##p＜0.01；与环磷酰胺组相比，*p《0.05,**p＜0.01。
28.图3.各组小鼠胸腺和脾脏指数计算结果a.各组小鼠胸腺指数比较；b.各组小鼠脾脏指数比较注:与正常对照组相比，
△
p＜0.05，
△△
p＜0.01；与环磷酰胺组相比，*p《0.05,**p＜0.01。
29.图4.各组小鼠血清中谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)的水平比较a.各组小鼠血清中alt水平的比较b.各组小鼠血清中ast水平的比较注:与正常对照组相比，
△
p＜0.05，
△△
p＜0.01；与模型组相比，#p＜0.05，##p＜0.01；与环磷酰胺组相比，*p《0.05,**p＜0.01。
30.图5.各组小鼠肿瘤组织he染病理学结果(100x)。
31.注：k组：正常对照组；m组：模型组；c组：环磷酰胺给药组；l组：牡丹籽粕提取物低剂量给药组；h组：牡丹籽粕提取物高剂量给药组；cl组：低剂量牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺给药组；ch组：高剂量牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺给药组。
具体实施方式
32.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
33.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
34.油用牡丹籽经脱壳、压饼处理或液压后的牡丹籽粕，经粉碎、造粒处理后，以丁烷为萃取剂，在压强0.3mpa-0.8mpa，萃取温度为20℃-50℃的条件下，萃取1-4次，得油脂含量≤1.5％的脱脂油用牡丹籽粕；以甲醇或乙醇为溶剂，醇浓度为50％-95％，料液比1：5-1：20，提取温度30℃-50℃，提取时间1h-4h的条件下，提取1-3次，提取液经喷雾干燥得牡丹籽粕提取物。
35.1实验试剂
36.环磷酰胺，200mg/支，购自江苏恒瑞医药股份有限公司；小鼠肝癌细胞h22，实验室保存；fbs、rpmi1640细胞培养液，索莱宝，购自苏州中化药品工业有限公司；苏木精染液，购自无锡市江原实业技贸总公司；伊红染液(醇溶性)，购自珠海贝索生物技术有限公司；谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)生化试剂盒，购自北京豪迈生物工程有限公司；兽用血细胞分析用试剂包，购自深圳迈瑞生物医疗电子股份公司；甲醛、乙醇、二甲苯，购自天津市凯通化学试剂有限公司
37.1.2实验仪器
38.酶标仪，biotek synergy h1；co2培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；电子
天平，上海佑科仪器仪表有限公司；生物显微镜，上海佑科仪器仪表有限公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；台式低速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；全自动组织脱水仪，天津爱华医疗器械有限公司；包埋仪，天津爱华医疗器械有限公司；切片机，德国slee；光学显微镜，上海佑科仪器仪表有限公司；human star 600自动生化分析仪，德国胡曼生化诊断有限责任公司；bc-5130五分类血液分析仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份公司
39.1.3细胞株
40.小鼠肝癌细胞株h22
41.1.4实验动物
42.6-8周龄体重18-22g的昆明(km)小鼠70只，雌雄各半，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号scxk(鲁)20140007。
43.所有km小鼠在正式实验前进行检疫，检疫期间观察动物行为是否正常，主要在活动、饮食等方面检查是否合格无异常，检疫合格的动物才可用于正式动物实验。km小鼠饲养在室温20～26℃，日温差≤4℃，相对湿度40～70％，明暗交替时间为12/12h的环境条件下。km小鼠按组进行分笼，动物饲养期间于标准小鼠盒中自由摄食、饮水。饲料为spf级大小鼠生长繁育饲料，由江苏省协同医药生物工程有限公司生产。饮用水是经过高温消毒的城市自来水。
44.2动物模型构建
45.2.1小鼠肝癌细胞h
22
复苏、传代与收集
46.细胞复苏：从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置于37℃水浴锅中，反复摇动使其融化，用75％消毒乙醇消毒冻存管表面，将其转移至超净工作台中。将冻存管中的细胞悬液转移至无菌离心管中，加入rpmi1640细胞培养液，1000rpm离心5min，弃上清。用10％fbs-rpmi1640细胞培养液重悬细胞，反复吹打后，转移至细胞培养瓶中，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
47.细胞传代：细胞生长至对数生长期时，半悬浮生长的h22细胞达到80-90％，1000rpm离心5min，弃上清，加入含10％fbs-rpmi1640细胞培养液重悬细胞，吹打均匀，按1：3的比例稀释细胞悬液，分装于3个细胞培养瓶，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
48.细胞收集：1000rpm离心5min，弃上清，加入rpmi1640细胞培养液吹打均匀，细胞计数器计数，调整细胞浓度至2
×
10 7
个/ml。
49.2.2动物分组及模型建立
50.所有km小鼠适应性喂养3d观察动物行为正常后，除正常对照组(给与等体积生理盐水)外每只小鼠右腋皮下接种注射肝癌细胞悬液0.1ml/10g，次日将小鼠随机分成7组，每组10只，分别正常对照组，模型组，环磷酰胺(ctx)组，牡丹籽粕提取物低剂量(50mg/kg)组，牡丹籽粕提取物高剂量组(200mg/kg)，环磷酰胺+牡丹籽粕提取物低剂量(50mg/kg)组，环磷酰胺+牡丹籽粕提取物高剂量组(200mg/kg)。正常对照组和模型组给于等体积的生理盐水灌胃，ctx组腹腔注射50mg/kgctx，牡丹籽粕提取物组每日灌胃牡丹籽粕提取物0.1ml/10g.bw，ctx+牡丹籽粕提取物组每日腹腔注射50mg/kgctx和灌胃牡丹籽粕提取物，给药体积为0.1ml/10g.bw，连续14天。肿瘤细胞注射入小鼠体内后每周测2次肿瘤大小，每周测2次小鼠体重，并记录。末次给药后第2天摘眼球取血，留取约50μl血浆，其余离心取血清。脱臼处死肝癌小鼠，剥离瘤体、胸腺、肝、脾并称重。
51.每天观察小鼠进食、饮水、活动、背毛(倒竖、光泽)、体重、精神状态、存活动物数、死亡动物数及死亡原因等。计算肿瘤的抑制率及脏器指数。
52.肿瘤抑制率＝(1-各给药组肿瘤质量/模型组肿瘤质量)
×
100％。
53.脏器指数＝脏器重/小鼠体重
54.3实验方法
55.3.1组织病理学he染检查
56.小鼠处死后解剖取小鼠组织，用4％多聚甲醛固定后，依次进行常规脱水、石蜡包埋、切片烤片(5μm)、he染。显微镜下(100x)观察组织病理变化并拍照。
57.3.2数据统计处理方法
58.所有实验数据以均数即x
±
标准差表示，graphpad统计软件处理，组内数据分析采用单样本t检验，组间数据分析采用独立样本t检验，组间差异以p《0.05判定为有显著性差异。
59.4实验结果
60.(注：k组：正常对照组；m组：模型组；c组：环磷酰胺给药组；l组：牡丹籽粕提取物低剂量给药组；h组：牡丹籽粕提取物高剂量给药组；cl组：低剂量牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺给药组；ch组：高剂量牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺给药组)
61.4.1牡丹籽粕提取物单独给药组以及联合给药组对肿瘤生长的影响
62.本实验通过将小鼠肝癌细胞注入昆明小鼠右腋下构建小鼠肝癌模型，建模成功后通过牡丹籽粕提取物灌胃给药、环磷酰胺腹腔注射给药评价牡丹籽粕提取物单独给药或环磷酰胺联合给药对肿瘤生长的影响。结果显示，与模型组相比，低、高牡丹籽粕提取物给药组具有显著的肿瘤抑制作用；与环磷酰胺单独给药组相比，低、高剂量牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺组肿瘤抑制作用显著增强；各组抑瘤率大小及各组瘤重结果见图1.a b。
63.4.2各组小鼠血常规检测结果
64.本发明末次给药后通过小鼠摘眼球取血并进行生化分析和血常规检测以探索不同给药情况对小鼠血细胞的影响。结果表明，对于白细胞而言，与正常对照组相比，环磷酰胺会显著降低小鼠白细胞数量(p＜0.01)。联合给药组相对于单独环磷酰胺给药组，牡丹籽粕提取物能提高环磷酰胺引起的白细胞降低现象(p＜0.05)，且白细胞水平随着牡丹籽粕提取物浓度的升高其作用增强，对于白细胞具有保护作用。见图2.a。
65.对于红细胞，肿瘤、环磷酰胺以及牡丹籽粕提取物对红细胞计数无明显影响(p》0.05)，图2.b。
66.4.3提取物对脾脏和胸腺指数的影响
67.本发明处死小鼠后快速剥离了小鼠的胸腺和脾脏，并计算了各组小鼠这两个器官的指数用以探索提取物对器官的影响。结果表明，对于胸腺而言，与正常对照组相比，肿瘤对胸腺指数无明显影响(p》0.05)，环磷酰胺能显著降低小鼠胸腺指数(p＜0.01)，单独高剂量组对胸腺指数无明显影响(p》0.05)。与给药环磷酰胺组相比，联合给药组中的牡丹籽粕提取物可以显著提高由环磷酰胺引起的胸腺指数降低现象(p＜0.01)，对小鼠胸腺具有保护作用。见图3.a。
68.对于脾脏而言，与正常对照组相比，肿瘤对脾脏指数无明显影响(p》0.05)，环磷酰胺能显著降低小鼠的脾脏指数(p《0.05)，单独牡丹籽粕提取物给药组对脾脏指数无显著影
响(p》0.05)，与给药环磷酰胺组相比，联合给药组中的牡丹籽粕提取物可以显著提高由环磷酰胺引起的脾脏指数降低现象(p＜0.01)，对小鼠脾脏具有保护作用。见图3.b。
69.4.4各组小鼠血生化检测结果
70.本发明利用了全自动生化分析仪检测了各组小鼠血清中谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)的水平。结果表明，对于alt而言，与正常对照组相比，肿瘤能显著提高小鼠血清中alt的含量(p＜0.01)，环磷酰胺不能显著降低由肿瘤引起的alt水平的提高(p》0.05)，但环磷酰胺组alt的水平与正常对照组还是具有显著性差异(p＜0.01)；此外，单独低、高剂量牡丹籽粕提取物也能显著降低由肿瘤引起的alt水平的提高(p＜0.01)，但单独牡丹籽粕提取物组与正常对照组还是具有显著性差异(p＜0.01)，与单独环磷酰胺相比，低、高剂量牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺给药组alt水平与正常对照组相比具有显著性差异(p＜0.01)。见图4.a。
71.对于ast而言，与正常对照组相比，肿瘤能显著提高小鼠血清中ast的含量(p＜0.01)，环磷酰胺不能显著降低由肿瘤引起的ast水平的提高(p》0.05)，但环磷酰胺组ast的水平与正常对照组相比还是具有显著性差异(p＜0.01)；此外，单独牡丹籽粕提取物也能显著降低由肿瘤引起的ast水平的提高(p＜0.01)，但低、高剂量牡丹籽粕提取物组与正常对照组还是具有显著性差异(p＜0.01)；与单独环磷酰胺组相比，低、高牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺给药组ast水平与正常对照组相比无明显差异(p》0.05)。见图4.b。
72.4.5组织病理学检测结果
73.肿瘤组织he染病理学结果：he染玻片上镜下观察可见，模型组瘤体组织主要由瘤细胞组成，间质极少见。组织内见瘤细胞坏死，坏死区域呈带状，并相互连接成网状；其间见残留瘤细胞也相互吻合成网状，见图5.m。牡丹籽粕提取物低剂量组和牡丹籽粕提取物高剂量组模型组情况基本相似，见图5.l、h。环磷酰胺组瘤组织与模型组比较，组织内瘤细胞坏死较广泛，其间见残留瘤细胞网的瘤细胞相对少，见图5.c。牡丹籽粕提取物低剂量与环磷酰胺联合给药组与模型组相比，肿瘤细胞坏死更加广泛，残留瘤细胞相对少，见图5.cl。牡丹籽粕提取物高剂量与环磷酰胺联合给药组瘤组织内见大片肿瘤细胞坏死，仅少部分区域见残留瘤细胞，见图5.ch。
74.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种协同化疗药物肝癌的牡丹籽粕提取物及其制备方法与应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述牡丹籽粕提取物是以醇提的方式制备获得。3.如权利要求2所述的应用，其特征是，该方式包括以下步骤：油用牡丹籽经脱壳、压饼处理或液压后的牡丹籽粕，经粉碎、造粒处理后，以丁烷为萃取剂，在压强0.3mpa-0.8mpa，萃取温度为20℃-50℃的条件下，萃取1-4次，得油脂含量≤1.5％的脱脂油用牡丹籽粕；以甲醇或乙醇为溶剂，醇浓度为50％-95％，料液比1：5-1：20，提取温度30℃-50℃，提取时间1h-4h的条件下，提取1-3次，提取液经喷雾干燥得牡丹籽粕提取物。4.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺联合应用时，牡丹籽粕提取物与环磷酰胺的浓度配比为1～4:1。5.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺联合应用时，牡丹籽粕提取物浓度为5～20mg/ml，环磷酰胺浓度为5mg/ml；所述牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺联合应用时，所述的环磷酰胺药物采用腹腔注射的方式进行给药。6.一种牡丹籽粕提取物联合环磷酰胺在制备防治肝癌中环磷酰胺化疗过程中所致的白细胞减少和/或者提高由环磷酰胺引起的胸腺以及脾脏指数降低和/或者降低肝癌患者谷丙转氨酶(alt)水平药物中的应用。7.一种具有协同作用的抗肝癌药物组合物，其特征是，包括环磷酰胺和牡丹籽粕提取物。8.如权利要求7所述的抗肝癌药物组合物，其特征是，所述牡丹籽粕提取物是通过以下方法制备获得的：油用牡丹籽经脱壳、压饼处理或液压后的牡丹籽粕，经粉碎、造粒处理后，以丁烷为萃取剂，在压强0.3mpa-0.8mpa，萃取温度为20℃-50℃的条件下，萃取1-4次，得油脂含量≤1.5％的脱脂油用牡丹籽粕；以甲醇或乙醇为溶剂，醇浓度为50％-95％，料液比1：5-1：20，提取温度30℃-50℃，提取时间1h-4h的条件下，提取1-3次，提取液经喷雾干燥得牡丹籽粕提取物。9.如权利要求7所述的抗肝癌药物组合物，其特征是，所述牡丹籽粕提取物与环磷酰胺的浓度配比为1～4:1。10.一种具有协同环磷酰胺抗肝癌作用的牡丹籽粕提取物的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤：油用牡丹籽经脱壳、压饼处理或液压后的牡丹籽粕，经粉碎、造粒处理后，以丁烷为萃取剂，在压强0.3mpa-0.8mpa，萃取温度为20℃-50℃的条件下，萃取1-4次，得油脂含量≤1.5％的脱脂油用牡丹籽粕；以甲醇或乙醇为溶剂，醇浓度为50％-95％，料液比1：5-1：20，提取温度30℃-50℃，提取时间1h-4h的条件下，提取1-3次，提取液经喷雾干燥得牡丹籽粕提取物。

技术总结

本发明涉及一种协同化疗药物肝癌的牡丹籽粕提取物及其制备方法与应用。本发明提供一种能够协同环磷酰胺抗肿瘤活性的牡丹籽粕提取物，并防治环磷酰胺化疗过程中所致的白细胞减少症，该发明涉及协同化疗药物荷瘤小鼠的牡丹籽粕提取物制备方法及用途。小鼠的牡丹籽粕提取物制备方法及用途。小鼠的牡丹籽粕提取物制备方法及用途。