二氢小檗碱或其衍生物用于抗衰老的制作方法

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1.本发明总体上属于保健食品和膳食补充剂技术领域，具体涉及在哺乳动物中抗衰老，尤其减轻或预防皮肤衰老、细胞衰老或光老化的组合物和方法，特别是通过抑制progerin而实现。

背景技术：

2.progerin，即早衰蛋白/早老蛋白/早衰素/早老素，是lamin a蛋白的截短形式。progerin最常由编码lamina的基因中的单核苷酸多态性(c1824t)产生。这种突变激活了一个隐蔽的剪接位点，并产生了一种在c末端附近缺失50个氨基酸的lamin a形式。lamin a构成了核纤层的主要结构成分，核纤层是一种在细胞核膜内发现的蛋白质支架。progerin蛋白异常积聚在核膜中，阻止lamin a的至少一些正常支架功能，进而干扰核中的多个过程，包括染质组织、异染质形成、dna损伤反应、细胞周期、基因转录和端粒维持。progerin与细胞环境相互作用，导致染质重塑因子、转录因子、dna修复因子、与核纤层相关的因子的位置和水平发生变化。所有这些变化都会影响细胞过度增殖并导致细胞停滞、细胞凋亡，从而导致细胞衰老、组织和器官功能障碍。
3.progerin依赖性机制在自然衰老中起作用(ashapkin,v.v.等人,哈钦森-吉尔福德早衰综合征与自然衰老之间有共同的机制吗(are there common mechanisms between the hutchinson-gilford progeria syndrome andnaturalaging)？《遗传学前沿》(frontiers in genetics),2019.10:第455页)。此外，紫外线辐射(uvr)诱导progerin表达，导致皮肤的光老化(takeuchi,h.和t.m.r
ü
nger,长波紫外线诱导衰老相关的progerin(longwave uv light induces the aging-associated progerin).《皮肤病学研究杂志》(the journal of investigative dermatology),2013.133(7):第1857-1862页)。
4.细胞衰老是与衰老相关的最重要的体内机制之一。衰老细胞通过自然老化导致的不可修复的细胞损伤损害组织功能，从而限制寿命。复制性衰老是细胞衰老的主要原因，在培养物中大约60轮细胞分裂(海弗里克极限(hayflick’s limit))后观察到，是每次分裂后端粒逐渐侵蚀的结果。这种进行性侵蚀导致端粒功能障碍和不可逆的细胞周期停滞。
5.需要一种组合物和方法来对抗progerin对衰老，尤其皮肤衰老、细胞衰老或光老化的负面影响。

技术实现要素：

6.在第一方面，本发明提供了一种在哺乳动物中抗衰老的方法，该方法包括向哺乳动物施用组合物，该组合物包含有效量的二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物。
7.在一些实施方案中，通过抑制progerin实现抗衰老。
8.在一些实施方案中，抗衰老包括减轻或预防皮肤衰老、细胞衰老或光老化。
9.在一些实施方案中，组合物被制备成食品、饮料、营养补充剂、化妆品或药物组合
物的形式。
10.在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以2mg至2000mg的日剂量施用。在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以5mg至1500mg、20mg至1000mg、40mg至800mg、80mg至600mg或100mg至400mg的日剂量施用。在一些实施方案中，每日剂量以分剂量或单剂量施用。
11.在一些实施方案中，哺乳动物是人类。在一些实施方案中，施用通过选自口服、静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、局部涂覆或舌下施用的途径进行。在一些实施方案中，施用至少每天一次或每天多次。
12.在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物被配制成溶液、液体混悬剂、肠胃外溶液、注射剂、片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、膜剂、(微)胶囊剂、气雾剂、滋补剂或糖浆剂、饮料、营养品、零食、棒、口香糖、糖、面膜组合物、功能化乳霜组合物、功能化精华、护肤组合物、化妆品组合物或功能化食品组合物。
13.在第二方面，本发明提供了一种组合物，包含有效量的二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物，该组合物用于在哺乳动物中抗衰老。
14.在一些实施方案中，通过抑制progerin实现抗衰老。
15.在一些实施方案中，抗衰老包括减轻或预防皮肤衰老、细胞衰老或光老化。
16.在一些实施方案中，组合物被制备成食品、饮料、营养补充剂、化妆品或药物组合物的形式。
17.在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以2mg至2000mg的日剂量施用。在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以5mg至1500mg、20mg至1000mg、40mg至800mg、80mg至600mg或100mg至400mg的日剂量施用。在一些实施方案中，每日剂量以分剂量或单剂量施用。
18.在一些实施方案中，哺乳动物是人类。在一些实施方案中，施用通过选自口服、静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、局部涂覆或舌下施用的途径进行。在一些实施方案中，施用至少每天一次或每天多次。
19.在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物被配制成溶液、液体混悬剂、肠胃外溶液、注射剂、片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、膜剂、(微)胶囊剂、气雾剂、滋补剂或糖浆剂、饮料、营养品、零食、棒、口香糖、糖、面膜组合物、功能化乳霜组合物、功能化精华、护肤组合物、化妆品组合物或功能化食品组合物。
20.在第三方面，本发明提供了一种组合物在制备用于在哺乳动物中抗衰老的食品、饮料、营养补充剂、化妆品或药物组合物中的用途，该组合物包含有效量的二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物。
21.在一些实施方案中，通过抑制progerin实现抗衰老。
22.在一些实施方案中，抗衰老包括减轻或预防皮肤衰老、细胞衰老或光老化。
23.在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以2mg至2000mg的日剂量施用。在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以5mg至1500mg、20mg至1000mg、40mg至800mg、80mg至600mg或100mg至400mg的日剂量施用。在一些实施方案中，每日剂量以分剂量或单剂量施用。
24.在一些实施方案中，哺乳动物是人类。在一些实施方案中，施用通过选自口服、静
脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、局部涂覆或舌下施用的途径进行。在一些实施方案中，施用至少每天一次或每天多次。
25.在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物被配制成溶液、液体混悬剂、肠胃外溶液、注射剂、片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、膜剂、(微)胶囊剂、气雾剂、滋补剂或糖浆剂、饮料、营养品、零食、棒、口香糖、糖、面膜组合物、功能化乳霜组合物、功能化精华、护肤组合物、化妆品组合物或功能化食品组合物。
26.在第四方面，本发明提供了一种在哺乳动物中抑制progerin的方法，该方法包括向哺乳动物施用组合物，该组合物包含有效量的二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物。
27.在一些实施方案中，该方法用于抗衰老。
28.在一些实施方案中，抗衰老包括减轻或预防皮肤衰老、细胞衰老或光老化。
29.在一些实施方案中，组合物被制备成食品、饮料、营养补充剂、化妆品或药物组合物的形式。
30.在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以2mg至2000mg的日剂量施用。在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以5mg至1500mg、20mg至1000mg、40mg至800mg、80mg至600mg或100mg至400mg的日剂量施用。在一些实施方案中，每日剂量以分剂量或单剂量施用。
31.在一些实施方案中，哺乳动物是人类。在一些实施方案中，施用通过选自口服、静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、局部涂覆或舌下施用的途径进行。在一些实施方案中，施用至少每天一次或每天多次。
32.在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物被配制成溶液、液体混悬剂、肠胃外溶液、注射剂、片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、膜剂、(微)胶囊剂、气雾剂、滋补剂或糖浆剂、饮料、营养品、零食、棒、口香糖、糖、面膜组合物、功能化乳霜组合物、功能化精华、护肤组合物、化妆品组合物或功能化食品组合物。
33.在第五方面，本发明提供了一种组合物，包含有效量的二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物，该组合物用于在哺乳动物中抑制progerin。
34.在一些实施方案中，该组合物可用于抗衰老。
35.在一些实施方案中，抗衰老包括减轻或预防皮肤衰老、细胞衰老或光老化。
36.在一些实施方案中，组合物被制备成食品、饮料、营养补充剂、化妆品或药物组合物的形式。
37.在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以2mg至2000mg的日剂量施用。在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以5mg至1500mg、20mg至1000mg、40mg至800mg、80mg至600mg或100mg至400mg的日剂量施用。在一些实施方案中，每日剂量以分剂量或单剂量施用。
38.在一些实施方案中，哺乳动物是人类。在一些实施方案中，施用通过选自口服、静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、局部涂覆或舌下施用的途径进行。在一些实施方案中，施用至少每天一次或每天多次。
39.在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物被配制成溶液、液体混悬剂、肠胃外溶液、注射剂、片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、膜剂、(微)胶囊
剂、气雾剂、滋补剂或糖浆剂、饮料、营养品、零食、棒、口香糖、糖、面膜组合物、功能化乳霜组合物、功能化精华、护肤组合物、化妆品组合物或功能化食品组合物。
40.在第六方面，本发明提供了一种组合物在制备用于在哺乳动物中抑制progerin的食品、饮料、营养补充剂、化妆品或药物组合物中的用途，该组合物包含有效量的二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物。
41.在一些实施方案中，该组合物可用于抗衰老。
42.在一些实施方案中，抗衰老包括减轻或预防皮肤衰老、细胞衰老或光老化。
43.在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以2mg至2000mg的日剂量施用。在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以5mg至1500mg、20mg至1000mg、40mg至800mg、80mg至600mg或100mg至400mg的日剂量施用。在一些实施方案中，每日剂量以分剂量或单剂量施用。
44.在一些实施方案中，哺乳动物是人类。在一些实施方案中，施用通过选自口服、静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、局部涂覆或舌下施用的途径进行。在一些实施方案中，施用至少每天一次或每天多次。
45.在一些实施方案中，二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物被配制成溶液、液体混悬剂、肠胃外溶液、注射剂、片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、膜剂、(微)胶囊剂、气雾剂、滋补剂或糖浆剂、饮料、营养品、零食、棒、口香糖、糖、面膜组合物、功能化乳霜组合物、功能化精华、护肤组合物、化妆品组合物或功能化食品组合物。
46.在第七方面，本发明提供了一种制备如本文所述的任何组合物的方法。
47.参考以下描述和所附权利要求书，将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点。
附图说明
48.图1a是补充不同浓度的dhb时ag01972细胞中lamin a和progerin的mrna表达水平的图。
49.图1b是补充不同浓度的dhb时2dd细胞中lamin a和progerin的mrna表达水平的图。
50.图2a是dhb补充组和非补充组的ag01972细胞中lamin a和progerin的蛋白水平的图。
51.图2b是dhb补充组和非补充组的2dd细胞中lamin a和progerin的蛋白水平的图。
52.图3a是通过mtt分析测量的不同浓度dhb对pd452bs细胞和wi38细胞增殖的影响的图。
53.图3b是dhb对2bs细胞增殖的影响的时间进程图。
54.图3c是dhb对wi38细胞增殖的影响的时间进程图。
55.图3d是2bs细胞的sa-β-gal阳性细胞率的定量图。
具体实施方式
56.在上面的发明内容和本部分发明详述，以及下面的权利要求书中，提到了本发明的特定特征，应当理解，本发明的说明书中公开了包括这些特定特征的所有可能的组合。例
如，当在本发明的特定方面或实施例或特定权利要求中公开了特定特征时，则该特征也可尽可能的和/或与本发明的其他特定方面和实施例结合使用。
57.皮肤衰老是一个复杂的过程。宏观上，皮肤衰老表现为细纹、失去弹性、橘皮或皮肤暗沉、表皮和真皮厚度减少。微观上，皮肤衰老的典型特征包括表皮萎缩、基底角质细胞有丝分裂率降低、增殖能力降低和细胞衰老、真皮细胞外基质萎缩和结缔组织生理特性改变。
58.小檗碱是一种生物活性化合物，可以从几种不同的植物中提取，包括一组称为小檗(berberis)的灌木。小檗碱最常用于糖尿病、血液中胆固醇或其他脂肪(脂质)水平高(高脂血症)和高血压。它也用于烧伤、口腔溃疡、肝病和许多其他病况。然而，还没有关于小檗碱与progerin、小檗碱与抗衰老和/或减轻或预防皮肤老化和/或减轻或预防细胞衰老和/或减轻或预防光老化之间的关系的报道。意外地，本发明人发现小檗碱及其代谢物可以抑制progerin的表达，从而抵抗衰老，特别是皮肤衰老、细胞衰老和/或光老化。
59.二氢小檗碱(dhb)是小檗碱的代谢物。药代动力学分析表明，肠道微生物的硝基还原酶可将bbr还原为可吸收形式的二氢小檗碱(dhb)，从而改善吸收并提高口服生物利用度(feng,r.等人,肠道微生物将小檗碱转化为肠道可吸收的形式(transforming berberine into its intestine-absorbableform by the gut microbiota).2015.5(1):第1-15页)。
60.如本文所用，术语“或”旨在包括“和”和“或”。换句话说，术语“或”也可以被替换为“和/或”。
61.如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”旨在也包括复数形式。
62.如本文所用，术语“包含”或“包括”或其变化形式指以下情况，其中该术语以其非限制性含义使用，指包括该词语后的项目，但并不排除未特别提及的项目。其还包括更限制性的动词
‘
基本上由
……
组成’和
‘
由
……
组成’。
63.如本文所用，术语“有效量”是指实现如本文所教导的效果所需的量。任何特定受试者的具体有效剂量水平将取决于多种因素，包括所处理迹象的严重程度；所用的具体组合物；受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；使用的二氢小檗碱或其类似物或其衍生物的施用时间、施用途径和排泄速率；施用的持续时间；以及医学领域中众所周知的类似因素。例如，在本领域技术人员内众所周知，起始剂量低于达到所需效果所需的水平，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。
64.本领域技术人员认识到，即使该迹象或状况没有完全根除或预防，但其或其症状和/或效果在受试者中得到部分改善或减轻，该量仍可被认为是“有效的”。
65.如本文所用，术语“药学上可接受的”是指药学上、生理学上、饮食上和/或营养学上可接受的，是指在合理的医学判断的范围内的那些组合物或试剂、材料或组合物和/或其剂型的组合，其适用于与人类和动物的组织接触，与组合物的其他成分相容，没有过多的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
66.如本文所用，术语“哺乳动物”或“受试者”可互换使用以指代可以应用或施用本公开的方法和组合物的任何动物。动物可能患有病痛或其他疾病，但动物不需要生病才能受益于本公开的方法和组合物。因此，任何动物都可以利用所公开的组合物或成为所公开方
法的接受者。“哺乳动物”包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、牛、马、灵长类动物，例如猴子、黑猩猩和猿，特别是人类。尽管动物受试者优选是人，但是本发明的方法和组合物同样适用于兽医学。
67.二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物和/或组合物包含其的组合物的剂量的范围可以很广，这取决于所需的效果和适应症。成年人类患者的每日施用方案可以是例如每公斤受试者体重0.01mg至3000mg二氢小檗碱或其类似物或衍生物，优选1mg至700mg，5mg至200mg，或约0.1mg至约1,000mg二氢小檗碱或其类似物或衍生物的口服剂量。根据受试者的需要，剂量可以是在一天或多天过程中给予的单一剂量或两次或更多次剂量。在一些实施方案中，这些化合物被连续施用一段时间，例如一周或更长时间，或数月或数年。
68.如本文所用，术语“施用”是指将所公开的组合物或有效成分递送给受试者的过程。本发明的组合物可以通过各种方式施用以发挥所要效果，包括口服、胃内和肠胃外(指静脉内和动脉内以及其他合适的肠胃外途径)等等。
69.如本文所用,“肠胃外溶液”是指可在除口腔和消化道以外的身体其他部位施用的溶液。它不是通过肠道递送的。例如，肠胃外溶液可以通过静脉输送。
70.如本文所用,“滋补剂”是指给人以活力或健康感觉的药用物质。
71.如本文所用，“糖浆剂”是指来自富含糖的植物，例如甘蔗、玉米和枫树的粘稠液体。
72.本领域存在多种施用组合物的技术，包括但不限于口服、直肠、局部、气雾剂、注射和肠外递送，包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射、鞘内、脑室内、腹膜内、鼻内和眼内注射。
73.此处使用的“腹膜内”是指在腹膜内或通过腹膜施用。腹膜是一层薄而透明的膜，排列在腹腔(腹膜)腔的壁上，包含/包裹着腹部器官，例如胃和肠。
74.如本文所用，“舌下”是指位于或施加在舌下。
[0075]“功能化乳霜组合物”包括对健康具有不仅仅是基本营养的潜在积极影响的乳霜组合物。
[0076]“精华”包括从特定植物或其他物质中获得的提取物或浓缩物，用于调味或香味。“功能化精华”包括具有不仅仅是基本营养的潜在积极影响的精华。
[0077]“功能化食品组合物”包括对健康具有不仅仅是基本营养的潜在积极影响的食品组合物。
[0078]
本文使用的任何标题或副标题均用于组织目的，不得用于限制本文公开的实施方案的范围。
[0079]
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的完整公开和描述，而不是旨在限制发明人所认为的发明范围，也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已经努力确保所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。
[0080]
本说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，就如每个单独的出版物或专利申请都具体和单独地通过引用并入一样。实施例实施例1
[0081]
本实施例描述了细胞培养程序、根据一些实施方案的组合物的处理以及其导致的基因表达变化。
[0082]
ag01972原代hgps细胞获自coriell细胞库(new jersey,usa)。人真皮成纤维细胞(hdf)分离自青少年包皮，也称为2dd。ag01972细胞在t75组织培养处理的烧瓶(fisher,uk)中在潮湿，37℃，5％co2/95％空气孵育箱中培养，烧瓶含有杜尔贝科最低必需培养基+glutamax(invitrogen,uk)，补充有15％胎牛血清和1％青霉素/链霉素(invitrogen)。细胞每周传代两次。将细胞以2
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105个的密度铺在含有13mm直径盖玻片的9cm培养皿中。接种后6小时，用0.1％二甲基亚砜、不同浓度的dhb处理ag01972细胞。初始处理后24小时重复dhb处理。处理48小时后分析细胞。
[0083]
根据制造商的方案，使用rneasy micro提取试剂盒分离总rna。进行柱上dnase i消化以避免基因组dna扩增。使用nanodrop技术检查rna含量和品质。使用superscript iii逆转录试剂盒将总共500ng rna用于逆转录。按照制造商的说明进行定量pcr分析。
[0084]
基因表达的定量基于deltact方法，并根据18s表达进行归一化。s.rodriguez和同事们已经描述了pcr引物(rodriguez,s.等人,细胞衰老期间哈钦森-吉尔福德早衰综合征截短型lamin a转录物表达增加(increased expression ofthe hutchinson-gilfordprogeria syndrome truncated lamin a transcript during cell aging).2009.17(7):第928-937页)。lamin a(外显子11/12)的引物序列，5'-tcttctgcctccagtgtcacg-3
′
(seq id no:1)和5
′‑
agttctgggggctctgggt-3
′
(seq id no:2)，progerin(外显子11/12)的引物序列，5
′‑
actgcagcagctcgggg-3
′
(seq id no:5)和5
′‑
tctgggggctctgggc-3
′
(seq id no:6)。lamin a(外显子11)的taqman mgb探针序列，5
′‑
actcgcagctaccg-3
′
(seq id no:7)，progerin(外显子11)的taqman mgb探针序列，5
′‑
cgctgagtacaacct-3
′
(seq id no:9)。用于lmna基因座分析的报道和淬灭染料是5
′‑
6fam和3
′‑
非荧光淬灭染料。18s(assay hs_99999901_s1)探针和引物由life technologies提供。18s核糖体rna(缩写为18s rrna)是核糖体rna的一部分。18s rrna是真核细胞质核糖体小组分的结构rna，因此是所有真核细胞的基本组分之一。
[0085]
在dhb处理ag01972细胞后48小时，测量a型lamin的蛋白水平以及lamin a和progerin的mrna表达。图1a是补充不同浓度的dhb时ag01972细胞中lamina和progerin的mrna表达水平的图。如图1a所示，与未处理的细胞相比，lamin a和progerin表达的相关剂量依赖性降低，在5μmol/l时效果最大。本研究中所有进一步的实验都是在此剂量下进行的。然后在2dd细胞中证实了用5μmol/l dhb处理对lamin a表达的影响，显示lamin a mrna表达降低。图1b是补充不同浓度的dhb时2dd细胞中lamin a和progerin的mrna表达水平的图。实施例2
[0086]
本实施例描述了根据一些实施方案的组合物的处理抑制了progerin蛋白的表达水平。
[0087]
收集ag01972细胞和2dd细胞的全细胞裂解物，通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并使用液体转移方法转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下，将印迹在含10％脱脂牛奶的tween 0.1％tris缓冲盐水中封闭1
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1小时。将膜在4℃下孵育过夜。使用辣根过氧化物酶缀合的物种特异性二抗检测抗原-抗体结合，随后使用增强化学发光蛋白质印迹检测试剂。
使用imagej软件对蛋白质印迹结果进行定量。
[0088]
图2a是dhb补充组和非补充组的ag01972细胞中lamin a和progerin的蛋白水平的图。图2b是dhb补充组和非补充组的2dd细胞中lamin a和progerin的蛋白水平的图。蛋白质印迹分析证实，与未经处理的细胞相比，经5μmol/l dhb处理的ag01972细胞中的progerin含量显著降低，并且经5μmol/l dhb处理的ag01972细胞和2dd细胞中的lamin a也降低。该数据表明，dhb可以抑制lamin a的表达水平，并降低progerin蛋白水平。
[0089]
对经dhb处理的ag01972细胞和2dd细胞的研究显示，dhb在蛋白质和mrna水平上均抑制lamin a的表达，并抑制体外细胞模型中的progerin，这表明dhb具有很好的潜力，可以进一步开发成为有前途的抗衰老候选物。实施例3
[0090]
本实施例描述了根据一些实施方案的组合物的处理延长了人胚肺二倍体成纤维细胞(2bs和wi38)的复制寿命，改善了形态学，并增强了复制性衰老的再生标记。
[0091]
从女性胎儿肺成纤维细胞组织中分离出人二倍体成纤维细胞2bs和wi38细胞。这些细胞系购自商业来源。细胞在补充有10％胎牛血清(fbs；gibco)、2mm谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的杜尔贝科改良伊格尔最低必需培养基(dmem，life technologies inc.)中，在37℃下在含5％co2的潮湿空气中生长。这些细胞在pd30或以下时被认为是年轻的，在pd50或以上时被认为是完全衰老的。
[0092]
细胞周期分析：简言之，在pd45生长至约85％汇合的wi38或2bs细胞以1:2的比例分裂。将其中之一重悬于含有不同浓度dhb(0、0.300、0.625和2.5μg/ml)的dmem中，并在37℃下在5％co2中孵育72小时，而另一个重悬于正常dmem中并在类似条件下孵育。使用becton-dickinson facscan流式细胞仪系统(bd)通过荧光激活细胞分选法测量细胞的dna含量。使用cellfit软件分析数据。
[0093]
细胞毒性分析：cck-8分析试剂盒(dojindo)用于测试体外细胞毒性。在pd45，将2bs或wi38细胞以每孔5
×
103个细胞/0.2ml的密度接种至96孔平底微孔板中。20小时后，当细胞达到亚汇合状态时，将细胞转移至含有各种浓度dhb的特殊培养基中，在37℃、5％co2中进一步生长达24小时。细胞活力(％)＝(od处理组-od
空白
)/(od
对照组-od
空白
)
×
100。
[0094]
使用cck-8方法分析细胞增殖。将细胞以每孔2.5
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103个细胞/0.2ml接种至96孔板中，并在不同dhb浓度(0、0.300、0.625和2.5μg/ml)下孵育一周。在第0天(铺板后4小时)和第1、2、3、4、5和6天测量每个孔的吸光度值。每24小时更新含有dhb或dmso的培养基。在指定点，用10％cck-8收获细胞一小时，并在490nm处测量吸光度。每个数据点测量5次，每条曲线重复3次以上。
[0095]
衰老相关的β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)分析：根据稍作修改的dimri方法(dimri，lee等人，1995)对在具有/不具有0.300μg/ml dhb浓度的dmem中生长的2bs细胞(pd45)进行染。将板上生长的细胞用pbs洗涤，在室温下在4％甲醛中固定5分钟，再用pbs洗涤。然后，将细胞在37℃下在无co2下，在新鲜制备的染缓冲液(1mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷(x-gal)，40mm柠檬酸/磷酸钠，ph 6.0，5mm亚铁，5mm铁，150mm nacl和2mm mgcl2)中孵育过夜16小时，然后根据说明手册(cst，9860s)进行检查。基于三个独立实验计算每组样品的sa-β-gal阳性细胞百分比的平均值。
[0096]
使用人胚肺二倍体成纤维细胞(2bs和wi38)测试了低浓度dhb对复制性衰老的影
响及其机制。这些细胞系在pd30或以下被认为是年轻的，在pd50或以上被认为是完全衰老的。细胞增殖用于评估培养细胞的老化状态。图3a是通过mtt分析测量的不同浓度dhb对pd452bs细胞和wi38细胞增殖的影响的图。如图3a所示，确定dhb的最佳浓度为0.3μg/ml。图3b是dhb对2bs细胞增殖的影响的时间进程图。图3c是dhb对wi38细胞增殖的影响的时间进程图。另外，浓度为0.3μg/ml的dhb在7天孵育期间促进了2bs(pd45)和wi38(pd45)细胞的增殖(图3b和3c)。此外，sa-β-gal的细胞阳性率通常用作体的标志(dimri，lee等人，1995)。图3d是2bs细胞的sa-β-gal阳性细胞率的定量图。图3d中sa-β-gal的定量分析显示，与pd 45-dmem组(约55％)和pd 45组(约60％)相比，dhb(约9％)可以显著延迟或逆转2bs细胞的体衰老。
[0097]
尽管本文已经说明了本发明的特定实施方案和实施例，但本领域技术人员将理解，可以在不脱离本发明的原则的情况下进行任何修改和变动。上面的实施例和说明并不限制本发明的范围。本发明的实施方案的任何组合，以及其任何明显的扩展或类似物，均在本发明的范围内。此外，本发明涵盖旨在实现相同目的而存在的任何布置，以及落入所附权利要求书的范围内的所有这些变动和修改。

技术特征：

1.一种在哺乳动物中抗衰老的方法，其特征在于，所述方法包括向所述哺乳动物施用组合物，所述组合物包含有效量的二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过抑制progerin实现所述抗衰老。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗衰老包括减轻或预防皮肤衰老、细胞衰老或光老化。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物被制备成食品、饮料、营养补充剂、化妆品或药物组合物的形式。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以2mg至2000mg的日剂量施用。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物被配制成溶液、液体混悬剂、肠胃外溶液、注射剂、片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、膜剂、(微)胶囊剂、气雾剂、滋补剂或糖浆剂、饮料、营养品、零食、棒、口香糖、糖、面膜组合物、功能化乳霜组合物、功能化精华、护肤组合物、化妆品组合物或功能化食品组合物。7.一种组合物，包含有效量的二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物，其特征在于，所述组合物用于在哺乳动物中抗衰老。8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，通过抑制progerin实现所述抗衰老。9.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述抗衰老包括减轻或预防皮肤衰老、细胞衰老或光老化。10.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物被制备成食品、饮料、营养补充剂、化妆品或药物组合物的形式。11.一种组合物在制备用于在哺乳动物中抗衰老的食品、饮料、营养补充剂、化妆品或药物组合物中的用途，其特征在于，所述组合物包含有效量的二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物。12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，通过抑制progerin实现所述抗衰老。13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述二氢小檗碱或其药学上可接受的盐、酸、酯、类似物或衍生物以2mg至2000mg的日剂量施用。

技术总结

本发明提供了在哺乳动物中抗衰老，尤其减轻或预防皮肤衰老、细胞衰老或光老化的新方法，特别是通过抑制progerin而实现。该方法包括向哺乳动物施用组合物，该组合物包含有效量的二氢小檗碱(DHB)或其类似物或其衍生物。本发明还提供了包含有效量的二氢小檗碱(DHB)或其类似物或其衍生物的组合物，用于通过抑制progerin而抗衰老，尤其减轻或预防皮肤衰老、细胞衰老或光老化。细胞衰老或光老化。细胞衰老或光老化。