pdk1 s53/55
位点作为靶标在制备
乳腺癌药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及pdk1 s53/55位点作为靶标在制备乳腺癌药物中的应用。
背景技术：
2.针对乳腺癌表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,egfr)的靶向，应是多层次、多维度的联合策略许多上皮来源的肿瘤
细胞，如非小细胞肺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌等都存在egfr的数量变异和结构变异，前者是指egfr的异常高表达，如某些乳腺癌的细胞egfr表达量可高达2
×
106/个(正常细胞表达量约为4～10
×
105/个)；egfr结构变异主要指第19号外显子缺失和l858r变异，即第858号亮氨基变成了精氨基。这两种异常均导致egfr持续性激活，启动多条下游信号通路，如pi3k/akt、ras-raf-mek-erk、jak-stat和plcγ信号通路，从而调控肿瘤细胞的增殖、分化和迁移。因此egfr是肿瘤靶向中最经典的靶点，也是非常重要的生物标志物。
3.egfr属于her家族(her family)成员，该家族成员除egfr(her1/erbb1)外，还包括erbb2(her2/neu)、erbb3(her3)、erbb4(her4)，它们具有高度类似的结构及功能，其中her2最活跃、知名度最高，有研究表明，当her2存在时，家族中其他成员总是优先与之结合形成异源二聚体，如egfr/her2异源二聚体在细胞膜上停留的时间比同源二聚体长，不易被细胞内吞降解，可增强egfr信号传导。可见，her受体家族成员之间的功能和活性是相互依赖的，它们对肿瘤细胞恶性表型的影响取决于her受体的共表达和交流对话。
4.目前针对egfr的靶向药物，主要有抗体药物和酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,tki)，如西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)等，但这些egfr的靶向药物，主要用于结直肠癌、头颈癌、肺癌、肾癌等，而乳腺癌egfr过表达的比例高达14％～91％，却鲜有针对乳腺癌的egfr的临床靶向药物。
5.目前，乳腺癌临床常用的靶向药物是曲妥珠单抗(trastuzumab)、拉帕替尼(lapatinib)，前者是her2的人源化单抗，后者是抑制her2、egfr的tki药物。其中曲妥珠应用最普遍、战绩最辉煌，它于1998年上市，据报道此药可显著降低早期乳腺癌患者复发率50％，提高病人存活率30％；但随着用药时间延长，也出现副作用和耐药性，其耐药机制主要为：一方面，乳腺
癌细胞过表达egfr、胰岛素样生长因子受体1等，这些受体可形成同源或异源二聚体，“替代”her2而激活下游信号通路；另一方面，乳腺癌细胞出现pi3k/akt、stat3等信号途径的结构性激活，有研究表明，10号染体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，pten)是pi3k/akt通路的负性调控因子，减少pten表达可增加曲妥珠耐药的发生，pten缺陷的肿瘤细胞对单抗的反应性减低。
6.以上临床证据和研究数据表明：乳腺癌若单独使用靶向单抗药物或tki，临床效果并不理想，因此在研发针对乳腺癌egfr的靶向策略时，应该从多层次、多维度
进行综合考量，不仅要考虑her受体家族之间共表达和“串通”交流，还要考虑下游信号途径的激活因素，将egfr靶向药物与关键靶点干预调控有机结合的联合策略，是乳腺癌肿瘤靶向的发展趋势和方向。
技术实现要素：
7.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供pdk1 s53/55位点作为靶标在制备乳腺癌药物中的应用，为乳腺癌药物的设计提供新的理论基础。
8.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供pdk1 s53位点和/或s55位点作为靶标在制备乳腺癌药物中的应用。
9.进一步，所述乳腺癌药物包括以下成分中的至少一种：
10.pdk1 s53位点抑制剂，pdk1 s55位点抑制剂；
11.pdk1 s53位点敲除试剂，pdk1 s55位点敲除试剂。
12.进一步，所述抑制剂是通过抑制pdk1 s53位点或s55位点的活性，所述敲除试剂是通过敲除pdk1 s53位点或s55位点，从而抑制pdk1入核，抑制乳腺癌细胞增殖，促进乳腺癌细胞凋亡。
13.进一步，所述抑制剂是通过抑制pdk1 s53位点或s55位点的活性，所述敲除试剂是通过敲除pdk1 s53位点或s55位点，抑制pi3k-akt信号通路激活，从而抑制pdk1入核，抑制乳腺癌细胞增殖，促进乳腺癌细胞凋亡。
14.进一步，所述乳腺癌药物用于抑制乳腺癌发生、生长和转移。
15.进一步，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
16.进一步，所述乳腺癌药物还含有药学上可接受的辅料。
17.本发明还提供pi3k-akt信号通路抑制剂在制备乳腺癌药物中的应用。
18.进一步，所述pi3k-akt信号通路抑制剂通过抑制pi3k-akt信号通路激活，从而抑制pdk1入核，抑制乳腺癌细胞增殖，促进乳腺癌细胞凋亡。
19.进一步，所述pi3k-akt信号通路抑制剂选自pdk1 s53位点抑制剂、pdk1 s55位点抑制剂、pdk1 s53位点敲除试剂、pdk1 s55位点敲除试剂、ly294002中的至少一种。
20.本发明还提供一种乳腺癌药物，所述药物包括以下成分中的至少一种：
21.pdk1 s53位点抑制剂，pdk1 s55位点抑制剂；
22.pdk1 s53位点敲除试剂，pdk1 s55位点敲除试剂；
23.pi3k-akt信号通路抑制剂。
24.如上所述，本发明的pdk1 s53/55位点作为靶标在制备乳腺癌药物中的应用，具有以下有益效果：
25.本技术解决了乳腺癌中促癌分子pdk1核转位的机制，提出pdk1 s53/55位点在介导乳腺癌细胞pdk1核转位以及核内pdk1调节细胞周期的关键作用，为后续靶向这两个位点进行药物设计提供了科学的理论基础。
附图说明
26.图1显示为本技术实施例1中pdk1在乳腺癌细胞中表达情况。
27.图2显示为本技术实施例1中pdk1在乳腺癌组织中表达情况。
28.图3显示为本技术实施例2中pi3k-akt信号通路介导pdk1在乳腺癌细胞内定位情况。
29.图4显示为本技术实施例3中位点s53/55介导pdk1在乳腺癌细胞内的定位情况。
30.图5显示为本技术实施例4中敲低pdk1抑制乳腺癌细胞的增殖和凋亡的情况。
31.图6显示为本技术实施例4中改变pdk1核定位抑制乳腺癌细胞的增殖和凋亡的情况。
具体实施方式
32.本技术研究了乳腺癌中促癌分子pdk1核转位的机制，发现pdk1 s53/55位点在介导乳腺癌细胞pdk1核转位以及核内pdk1调节细胞周期起着关键作用，能为后续靶向这两个位点进行药物设计提供科学的理论基础。
33.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
34.实施例1
35.免疫组化染
36.pdk1(丙酮酸脱氢酶激酶1)在乳腺癌癌组织和乳腺癌细胞中均呈高表达，为分析pdk1在乳腺癌组织和两种乳腺癌细胞中的表达情况，本实施例收集了乳腺癌病人(来自于重庆医科大学附属第一医院病理科)的乳腺癌组织和配对的癌旁组织，通过免疫组化实验检测组织中pdk1的表达水平，组化实验过程如下：石蜡切片经过二甲苯和梯度酒精脱蜡后，用3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，抗原修复和组织封闭处理，然后在4℃下与稀释好的pdk1抗体杂交过夜；用dapi染细胞核；用共聚焦显微镜拍摄，结果如图2所示。
37.图1显示为pdk1在乳腺癌细胞中表达情况，其中(a)为免疫印迹检测pdk1在乳腺癌细胞细胞浆和细胞核内定位情况，(b)为免疫印迹实验检测mda-mb-231细胞中egf处理促进pdk1入核，(c)为免疫印迹实验检测bt549细胞中egf处理促进pdk1入核，(d)为免疫印迹实验检测hs578t细胞中egf处理促进pdk1入核，(e)为免疫荧光实验检测mda-mb-231细胞中egf处理促进pdk1入核，(f)为免疫荧光实验检测bt549细胞中egf处理促进pdk1入核，(g)为免疫荧光实验检测hs578t细胞中egf处理促进pdk1入核。
38.图2显示为pdk1在乳腺癌组织中表达情况。其中(a)为tcga数据库中不同人类癌症中pdk1表达水平，(b)为tcga数据中pdk1在正常乳腺组织、腔型、her2+型和三阴性乳腺癌中(及其主要亚类)的相对表达水平，(c)为tcga数据库中不同分期乳腺癌患者pdk1的相对表达水平，(d)为乳腺癌组织不同pdk1表达水平患者kaplan-meier生存分析，高表达的pdk1预示brca患者预后不佳，(e)为由170名brca患者组成的微阵列芯片中pdk1染的代表性ihc图像(放大
×
1，
×
10和
×
20)(来自3名患者)，(f)为对组织芯片结果量化，brca中pdk1显著升高，(g)为癌旁、非tnbc和tnbc中pdk1的相对表达水平，(h)brca患者肿瘤分期(ⅰ，ⅱ，ⅲ)中pdk1的相对表达水平。
39.由图2可知，在乳腺癌组织中相对于相邻的癌旁组织中pdk1的表达是上调的，尤其是在三阴性乳腺癌中pdk1表达高于其他乳腺癌亚型。
40.进一步地，考虑到肿瘤微环境特点，本实施例用表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，egf)来处理egfr高表达乳腺癌细胞株bt549、mda-mb-231等，拟从egf/egfr信号通路激活入手，系统性发现一些新的下游途径和信号分子的作用和功能。
41.另外，本实施例还通过高通量测序技术分析比较上述细胞(即egf处理过的egfr高表达乳腺癌细胞株bt549、mda-mb-231)的差异基因表达谱，结果显示，一些经典的egf/egfr下游细胞信号途径被激活，如pi3k/akt、mapk、jnk等；此外还特别关注了一些代谢途径和代谢酶的变化，发现一系列与糖酵解相关的代谢酶表达升高，其中丙酮酸脱氢酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase 1，pdk1)在乳腺癌细胞中升高倍数最多。
42.pdk1是调节线粒体中丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex，pdc)活性状态的四种pdk同工酶(pdk1、pdk2、pdk3、pdk4)之一，线粒体中pdc能够催化丙酮酸氧化脱羧生成nadh和乙酰辅酶a，把糖酵解、三羧酸循环以及atp的生成紧密地联系在一起。在正常情况下，pdk1主要存在于心肌组织中，有报道它在黑素瘤、结肠癌、非小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤、肾细胞癌、鼻咽癌等多种肿瘤组织中异常高表达。
43.肿瘤细胞代谢重编程过程中，细胞中多种糖酵解相关酶相较正常细胞，表达均会显著上调，如葡萄糖转运蛋白-1(glut-1)、m2型丙酮酸激酶(pkm2)、丙酮酸脱氢酶复合体(pdc)、己糖激酶(hk)和乳酸脱氢酶(ldha)等。如图2所示，本实施例表明，pdk1在乳腺癌细胞中呈现高表达，并且相对于其他乳腺癌亚型，三阴性乳腺中pdk1水平升高最为显著，pdk1表达升高与乳腺癌不良预后和疾病进程都有明显的相关性。
44.近年来的研究还聚焦于这些经典的胞质分布的糖酵解酶，能从细胞质转位入核，著名的有pkm2、ldha，这些转位入核的代谢酶，通过增强转录因子转录活性、参与调控组蛋白表观修饰等，影响癌基因转录，促进肿瘤的发生发展。
45.本技术发明人通过查阅人类蛋白质图谱(human protein atlas，hpa)数据库，细胞免疫荧光图片显示在皮肤癌细胞(a-431)、人皮肤成纤维细胞(bj)、骨肉瘤细胞(u-2os)中，pdk1在胞浆和胞核中均有分布(www.proteinatlas.org)，但尚未见到在乳腺癌细胞中的核定位分布；本实施例用免疫荧光法、western blot观察到pdk1不仅分布在乳腺癌细胞胞质中，也定位于胞核；且egf处理细胞后，随着处理时间延长pdk1转位入核增多(图1)。
46.实施例2
47.pdk1作为一种经典的糖代谢限速酶，一般都在细胞质和线粒体中发挥酶活性作用，那是什么原因导致乳腺癌细胞中pdk1转位入核，以及pdk1入核的分子机制是什么呢？本实施例进行了进一步地研究。
48.为了判断目标蛋白pdk1在细胞中的定位，将细胞浆和细胞核蛋白分别提取出来进行蛋白质印迹实验，进行了细胞核质蛋白分离提取实验：
49.取一个直径为10cm的乳腺癌细胞培养皿，用1ml ce缓冲液(10mm hepes,ph 7.9,50mm nacl,0.5m蔗糖，0.1mm edta,0.1％ triton x-100，以及新添加的蛋白酶和磷酸酶抑制剂)在4℃下裂解5分钟，然后在1000
×
g离心4分钟，使细胞核成粒。然后用洗涤缓冲液(10mm hepes,ph 7.9,10mm kcl,0.1mm edta,0.1mm egta，以及新添加的蛋白酶和磷酸酶抑制剂)洗涤三次。上清再17000
×
g离心10分钟，以去除核污染，并转移到新的管中。颗粒和上清分别在sds样品缓冲液中煮沸。
50.接着，进行了免疫印迹实验：
51.乳腺癌细胞在ripa裂解缓冲液(beyotime，海门，中国)中均质，并添加完全蛋白酶抑制剂(mce，中国)和磷酸酶抑制剂(apexbio，美国)，蛋白裂解物通过离心去除不溶性物质，所得蛋白裂解物进行sds-page分析。蛋白质被湿转移到0.45μm pvdf膜(millipore公司，billerica,ma,usa)，用5％脱脂牛奶和1％ tbs-t缓冲液在室温下阻塞1小时。使用以下一抗:抗pdk1(1:1000,abcam)，抗pdk2(1:1000,abcam)，抗pdk3(1:1000,abcam)，抗pdk4(1:1000,abcam)，抗-α-tubulin(1:1000,proteintech)，抗dykddddk tag(1:800,proteintech)，抗histone h3(1:2000,abcam)，抗bcl-2(1:2000,cell signaling technology)，抗bax(1:2000,cell signaling technology)，抗p-akt(s473)(1:2000,cell signaling technology)，抗akt(1:2000,cell signaling technology)，抗e2f1(1:30 00,santa cruze)，抗rb1(1:30 00,santa cruze)，抗gadd45α(1:300,santa cruze)，抗p21 waf1/cip1/cdkn1a(1:3000,santa cruze)，抗cycline1(1:30 00,santa cruze)，抗cyclind1(1:50 00,wanlei)孵育一夜。膜在tbs-t中洗涤，并与以下适当的二抗孵育:山羊抗兔-hrp或山羊抗小鼠hrp(1:10 000,biosharp)。将膜暴露于ecl底物溶液(millipore)后，观察蛋白质条带，并使用imagej软件进行密度分析定量，结果如图3所示。
52.以及co-immunoprecipitation(co-ip)测定实验：
53.内源性co-ip试验采用pbst(pbs+0.1％ tween 20)缓冲液激活蛋白a/g磁珠(protein a/g magnetic beads,mce)5次。20μl一抗(小鼠抗pdk1,santa；鼠标anti-e2f1,圣诞老人；兔抗akt1,cst)或同型对照(小鼠igg,beyotime；将兔igg(beyotime)加入到600μl pbs中。每个样品与60μl磁珠混合，然后在室温下旋转过夜。细胞在10厘米的培养皿中培养。不同处理后，用pbs冲洗细胞3次，然后用细胞刮刀将细胞刮入1.5ml ep管中。在8000rpm离心5分钟后，使用ip细胞裂解缓冲液(beyotime，海门，中国)与蛋白酶抑制剂(biotool，休斯顿，德克萨斯州，美国)裂解细胞。将五分之一的全细胞裂解液作为输入，将预先结合的蛋白a/g磁珠与其余裂解液在4℃下混合过夜。含有2
×
sds-loading buffer(boster,wuhan,china)的免疫沉淀蛋白复合物煮沸5分钟，用western blotting分析，结果如图3所示。
54.图3显示为pi3k-akt信号通路介导pdk1在乳腺癌细胞内定位情况。其中，(a)为激酶芯片筛选egf(100ng/ml)处理30分钟前后bt549细胞中差异磷酸化激酶；(b)为灰度值量化芯片中p-prsa40、p-stat2、p-creb、p-akt、p-msk、p-egfr和p-erk水平的直方图；(c)为通过string数据库评估pdk1的ppi信息，预测与pdk1互作的分子包括prsa40、stat2、creb、akt、msk、egfr和erk；(d)为维恩图分析在hek293tvector、hek293twt和hek293twt+egf细胞中与pdk1相互作用的蛋白，每组中单个蛋白质的数量被标明；(e)为bt549细胞经dmso(20μm)、ly290042(20μm)、sc79(20μm)预处理24小时后，egf(100ng/ml)作用1小时免疫印迹实验检测pdk1定位情况改变；(f-g)为免疫沉淀实验检测egf(100ng/ml)处理前后akt1和pdk1之间的相互作用情况；(h)为不同截断形式的pdk1示意图；(i)为截断pdk1片段质粒转染bt549 pdk1敲除细胞后，核质分离实验和免疫印迹检测pdk1定位情况变化；(j)为细胞质和细胞核中截断pdk1的定量分析显示；(k)为免疫共沉淀和免疫印迹实验检测截断pdk1与akt1互作情况。
55.基于前期的研究，本技术发明人提出猜想：细胞是否通过egf/egfr轴启动下游信号通路，导致一些信号途径的激酶激活，从而影响pdk1核转位变化？为回答这个问题，如图3所示，本实施例首先用激酶芯片分析，发现egf处理细胞乳腺癌细胞导致pras40、stat2、
creb、akt1/2/3、msk1/2、egfr、erk1/2等磷酸化水平升高。同时，通过string数据库预测发现pdk1与pi3k-akt信号通路多个分子存在相互作用，因此进一步提出猜想pi3k-akt信号通路可能介导了pdk1的核转位。为了验证上述猜想，本技术实施例再分别应用pi3k抑制剂ly294002乳腺癌细胞后，通过核质分离实验发现pdk1入核明显减少；应用激动剂sc79处理乳腺癌细胞进一步促进了乳腺癌细胞pdk1核转位，证实pi3k/akt信号通路是调节pdk1入核的关键信号通路；再通过co-ip实验证明akt1与pdk1存在相互作用。并且根据pdk1结构域对其进行区段化截断实验发现，pdk1与akt1结合区域在210aa-436aa区段。
56.实施例3
57.前期的实施例2用egf处理乳腺癌细胞，已经发现细胞pdk1出现核转位增加。为了分析位点s53/55介导pdk1在乳腺癌细胞内的定位情况，本实施例进行了phos-tag分析实验：
58.根据生产商的说明进行磷标记分析。在用100ng/ml egf刺激乳腺癌细胞前，将其血清饥饿12小时(peprotech,rocky hill,nj,usa)。在含有10mm atp、25mm mgcl2和20mm tris-hcl(ph7.4)的20μl激酶测定缓冲液中加入/不加入1μg alp，在30℃下进行60min的磷酸化反应。加入5
×
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)缓冲液，煮沸10min后，用10％sds-page-75μm磷结合剂丙烯酰胺(wako,aal-107)分离样品，转移到pvdf膜上进行免疫印迹分析。
59.图4显示为位点s53/55介导pdk1在乳腺癌细胞内的定位情况。其中，(a)为egf处理1h后，对含或不含有alp的bt549细胞进行phos-tag分析；(b)为在egf(100ng/ml)处理30分钟前，用dmso(20μm)、ly290042(20μm)、sc79(20μm)预处理24小时，用phos-tag分析测定bt549细胞核组分和胞质组分中pdk1的磷酸化水平；(c)为免疫共沉淀富集egf处理前后bt549细胞中pdk1，sds-page分离并考马斯蓝染确定蛋白位置；(d)为磷酸化修饰质谱分析确定pdk1 s53/55位点是egf诱导的磷酸化位点；(e)为对不同物种(包括人类[智人，国家生物技术信息中心(ncbi)参考编号np_002601.1]、小鼠(小家鼠，np_766253.2)、大鼠(褐家鼠，np_446278.2)、牛(牛牛，np_001192886.1)和狗(犬类狼lupus familiaris,xp_038303010.1))的s53/55周围pdk1序列进行比对，红文本表示ser53/55。(f)pdk1中s53/55磷酸化的分子模型，s53/55r使pdk1表面电子势发生变化；(g)为western blot检测野生型pdk1及其突变体在bt549 pdk1敲除细胞中的分布；(h)为免疫荧光法检测pdk1 s53/55突变体的亚细胞定位，图像由共聚焦激光显微镜拍摄。
[0060]
由图4可知，phos-tag sds-page实验结果显示，egf处理也使乳腺癌细胞pdk1磷酸化水平明显增加；为了进一步明确pi3k-akt信号通路和pdk1磷酸化之间的关系，本实施例利用pi3k-akt信号通路抑制剂ly294002作用乳腺癌细胞后，胞质内pdk1磷酸化水平降低且不随egf处理升高；相反，激动剂sc79的应用进一步促进了胞质中pdk1磷酸化水平升高。上述实验结果明确了pi3k-akt信号通路在介导pdk1磷酸化及核转位的关键作用。为了进一步明确pdk1发生磷酸化修饰介导入核的关键位点，本实施例进一步利用ip-ms实验检测egf处理前后pdk1磷酸化水平变化，发现s53、s55、y185、s187、s190、s199等位点出现明显差异，通过进一步位点突变本实施例发现去磷酸化突变s53/55a可以明显抑制pdk1核转位，而磷酸化模拟突变s53/55d可以促进pdk1核转位，提示s53/55位点是egf促进pi3k-akt信号通路激活后介导pdk1核转位的关键位点。
[0061]
实施例4
[0062]
近年来报道，一些经典的代谢相关酶可由胞质转位到胞核而发挥新的功能，这些研究丰富和深化了研究者对于代谢酶类功能的认知和想象。据报道，核转位的代谢相关酶主要发挥以下作用：一是作为转录辅因子通过与转录因子结合，调控相关基因的转录，如恶性胶质瘤细胞pkm2入核与stat3、β-catenin、hif-1α、oct-4等多种转录因子结合，参与调节基因转录表达，促进细胞增殖和emt、抑制细胞凋亡等；二是发挥经典的酶活性作用，即肿瘤细胞中代谢酶由胞质转位到胞核后，仍然保留着它们在胞质中的功能，比如恶性胶质瘤细胞核内的pdc仍然发挥调节糖代谢的作用，通过催化丙酮酸生成乙酰coa，上调组蛋白h3k9、k18位点的乙酰化水平，促进肿瘤细胞进入s期；三是非经典的代谢酶活性作用，即核内的代谢酶展现新的功能，比如在宫颈癌细胞核内的ldha不再介导乳酸的产生，而是一方面促进α-羟丁酸(α-hb)的生成，另一方面通过与组蛋白h3特异性甲基转移酶dot1l结合，促进组蛋白h3k79位点的三甲基化，从而促进sod1、cat等抗氧化应激相关基因的转录，抵抗癌细胞的氧化应激反应。
[0063]
关于核内pdk1作用，本技术实施例通过前期实验已经初步发现，乳腺癌细胞核内pdk1敲除不仅影响其经典的在线粒体能量代谢方面的关键作用，与细胞周期进程和细胞凋亡也有明显的相关性。
[0064]
为了探讨pdk1调节与乳腺癌细胞细胞周期进程、增殖和凋亡的关系，本实施例通过流式细胞术检测细胞凋亡：
[0065]
六孔板中每孔铺上5
×
103cells/孔。12h后，各组细胞分别转染不同质粒。用不含edta的胰蛋白酶收集细胞，并用冷pbs洗涤三次。离心后，在500μl pbs中以1
×
106细胞浓度重悬细胞。细胞用annexin v-异藻蓝蛋白(apc；bd pharmingen,usa)和碘化丙啶(pi；bd pharmingen,usa)。流式细胞仪检测结果显示annexin v-apc阳性细胞为凋亡细胞。
[0066]
图5显示为敲低pdk1抑制乳腺癌细胞的增殖和凋亡的情况。其中，(a)为火山图描述转录组测序bt549 wt和bt549 ko细胞中差异基因，该线表示5％的fdr，灰线表示-1和1log2(折线变化)；(b)为差异基因的生物学进展(bp)，细胞成分(cc)，分子功能(mf)；(c)为差异基因中htftarget数据库中e2f1下游基因所占比例和示例基因；(d)为流式细胞术检测bt549 wt和bt549 ko细胞周期；(f)为bt549 wt和bt549 ko细胞周期中各时期所占比例量化；(g)为cck8试剂盒检测bt549 wt和bt549 ko的细胞活力；(g)为edu细胞增殖实验检测bt549wt和bt549ko细胞增殖；(h)为流式细胞术检测bt549 wt和bt549 ko细胞凋亡水平变化；(i)为bt549 wt和bt549 ko细胞凋亡量化；(j)为免疫印迹检测bt549 wt和bt549 ko细胞细胞周期和凋亡相关蛋白水平；(k)为免疫沉淀检测bt549 wt和bt549 ko细胞中e2f1与rb1的相互作用情况。其中，bt549wt代表野生型bt549；bt549ko表示pdk1敲除bt549细胞。
[0067]
由图5可知，流式细胞术检测敲除pdk1导致乳腺癌细胞凋亡增加，细胞周期阻滞在g1/s期，细胞增殖水平明显下降，且pdk1敲除导致细胞周期相关蛋白e2f1水平下降，e2f1和rb1结合增多，提示pdk1敲除引发的细胞周期的阻滞是由e2f1转录下降引起的。
[0068]
图6显示为核pdk1与cyclind1协同调控e2f1/rb信号通路及细胞周期进程。其中，(a)为免疫印迹实验检测在bt549 ko细胞中稳定表达位点突变wt pdk1、pdk1 s53/55a和s53/55d质粒后蛋白表达情况；(b)为流式细胞检测位点突变的细胞凋亡情况；(c)为流式细胞检测不同位点突变的细胞凋亡量化；(d)为cck8检测位点突变的细胞增殖水平改变；(e)
为edu细胞增殖实验检测位点突变细胞增殖能力；(f)为免疫共沉淀和sds-page银染检测核内与pdk1存在相互作用的蛋白质；(g)为维恩图取hek293t细胞和bt549细胞核内与pdk1存在相互作用的蛋白；(h)为免疫共沉淀和免疫印迹实验检测位点突变的pdk1与cyclind1互作情况。
[0069]
由图6可知，对介导pdk1磷酸化入核关键位点s53/55进行模拟去磷酸化突变s53/55a和磷酸化突变s53/55sd，调控pdk1定位后发现，s53/55a突变抑制pdk1入核，从而抑制乳腺癌细胞增殖，促进凋亡；而持续磷酸化模拟突变促进乳腺癌细胞增殖，抑制凋亡；表明核内pdk1发挥着介导细胞周期进展的作用。通过免疫共沉淀，发现pdk1通过与细胞周期调节蛋白cyclind1互作，影响转录因子e2f1转录，进一步调节细胞增殖和凋亡，进一步证明了pdk1 s53/55位点在乳腺癌发生发生过程中的关键作用。
[0070]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
技术特征：
1.pdk1 s53位点和/或s55位点作为靶标在制备乳腺癌药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌药物包括以下成分中的至少一种：pdk1 s53位点抑制剂，pdk1 s55位点抑制剂；pdk1 s53位点敲除试剂，pdk1 s55位点敲除试剂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抑制剂是通过抑制pdk1 s53位点或s55位点的活性，所述敲除试剂是通过敲除pdk1 s53位点或s55位点，从而抑制pdk1入核，抑制乳腺癌细胞增殖，促进乳腺癌细胞凋亡。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抑制剂是通过抑制pdk1 s53位点或s55位点的活性，所述敲除试剂是通过敲除pdk1 s53位点或s55位点，抑制pi3k-akt信号通路激活，从而抑制pdk1入核，抑制乳腺癌细胞增殖，促进乳腺癌细胞凋亡。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述乳腺癌药物用于抑制乳腺癌发生、生长和转移。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述乳腺癌药物还含有药学上可接受的辅料。7.pi3k-akt信号通路抑制剂在制备乳腺癌药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述pi3k-akt信号通路抑制剂通过抑制pi3k-akt信号通路激活，从而抑制pdk1入核，抑制乳腺癌细胞增殖，促进乳腺癌细胞凋亡。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述pi3k-akt信号通路抑制剂选自pdk1s53位点抑制剂、pdk1 s55位点抑制剂、pdk1 s53位点敲除试剂、pdk1 s55位点敲除试剂、ly294002中的至少一种。10.一种乳腺癌药物，其特征在于，所述药物包括以下成分中的至少一种：pdk1 s53位点抑制剂，pdk1 s55位点抑制剂；pdk1 s53位点敲除试剂，pdk1 s55位点敲除试剂；pi3k-akt信号通路抑制剂。
技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体公开了PDK1 S53/55位点作为靶标在制备乳腺癌药物中的应用。本申请通过研究乳腺癌中促癌分子PDK1核转位的机制，发现PDK1 S53/55位点在介导乳腺癌细胞PDK1核转位以及核内PDK1调节细胞周期起着关键作用，进一步地提出了通过靶向这两个位点设计乳腺癌药物的方案，为乳腺癌的靶向提供了新的策略。癌的靶向提供了新的策略。癌的靶向提供了新的策略。
技术研发人员：
陈婷梅 张典
受保护的技术使用者：
重庆医科大学国际体外诊断研究院
技术研发日：
2022.10.31
技术公布日：
2022/12/30
