1.本发明属于生物医药领域，具体涉及
肿瘤的预防或。
背景技术：
2.肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织
细胞增生所形成的新生物，多呈占位性块状突起。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。恶性肿瘤又称为癌。随着人类平均年龄的增长、自然环境恶化以及生化压力增强，癌症发病率逐年增高，这其中，肺癌、乳腺癌、
胃癌、结直肠癌、肝癌等是发病率最高的几种癌症。
3.科学家们一直致力于研究癌症的发病机理，以期从中获得方案。近些年，科学家们围绕信号转导等方面，开发了多种生物大分子作为癌症药物，这些大分子具有靶向性强、副作用小、效果好等特点。但癌症发病机理复杂，加之人类体中存在差异，对于合适药物的开发任重道远。
技术实现要素：
4.本发明的目的是提供一种新的肿瘤方案，对多种肿瘤细胞的生长和迁移都有抑制作用。
5.具体地，本发明提供锰型高稳定性超氧化物歧化酶在制备预防或肿瘤的药物中的应用，其中，
所述锰型高稳定性超氧化物歧化酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
6.优选地，所述肿瘤为良性肿瘤或恶性肿瘤；进一步优选地，所述肿瘤为胃肠道间质瘤、间皮瘤、卵巢癌、肺癌、胃癌或肠癌。
7.优选地，所述药物通过口服或注射途径给药；进一步优选地，所述注射为静脉注射或腹腔注射。
8.优选地，所述药物还包括一种或多种制药学上可接受的辅料，如稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、溶剂和/或缓冲剂等。这些辅料以本领域公知的方式与ms-sod制备成药，其用量亦是本领域技术人员可知的。
9.在另一个方面，本发明提供一种预防或肿瘤的方法，包括向需要的个体施用ms-sod。
10.本发明通过实验证明，ms-sod对卵巢癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、肠癌细胞、胃肠道间质瘤细胞以及间皮瘤细胞等都有明显的抑制生长作用，且能够抑制细胞迁移，具有所述肿瘤的潜力。
附图说明
11.图1a和b为ms-sod对卵巢癌细胞(es2、skov3)、肺癌细胞(a549和pc-9)、间皮瘤细胞(ms924)、胃肠道间质瘤细胞(gist-t1和gist48b)、胃癌细胞(sgc7901和bgc823)以及肠癌细胞(sw620、hct15和hct116)生长的影响，每个实验组设置3个平行复孔，实验至少单独
重复两次；*p《0.5，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001；
12.图2为ms-sod对卵巢癌细胞(es2、skov3)、肺癌细胞(a549和pc-9)、间皮瘤细胞(ms924)、胃肠道间质瘤细胞(gist t1和gist 48b)、胃癌细胞(sgc7901和bgc823)以及肠癌细胞(sw620、hct15和hct116)迁移的影响，每个实验组设置3个平行复孔，实验至少单独重复两次；
13.图3为ms-sod抑制胃癌细胞克隆的形成的染结果；
14.图4为定量分析ms-sod对胃癌克隆形成的影响结果，每个实验组设置3个平行复孔，实验至少单独重复两次，*p《0.5，**p《0.01,****p《0.0001；
15.图5为ms-sod对胃癌细胞周期的影响结果，每个实验组设置了3个平行,实验至少单独重复两次；
16.图6为ms-sod对胃癌细胞凋亡的影响结果，每个实验组设置了3个平行,实验至少单独重复两次；
17.图7为ms-sod突变体h29a对胃癌细胞6d生长的影响结果，每个实验组设置3个平行复孔，实验至少单独重复两次；
18.图8为ms-sod突变体h29a对胃癌细胞迁移的影响结果，每个实验组设置3个平行复孔，实验至少单独重复两次。
具体实施方式
19.以下将通过具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明的内容不限于此。
20.以下实施例中，如无特别说明，使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购的方式获得；使用的实验方法也为本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例的内容可以毫无疑问地实施所述方案并获得相应的结果。
21.以下实施例中使用的ms-sod序列如seq id no:1所示，它的制备过程详见如cn105624126a的实施例1，这部分内容通过引用的方式结合至本文。
22.ms-sod的序列为：
23.mpypfklpdlgypyealephidaktmeihhqkhhgayvtnlnaalekypylhgvevevllrhlaalpqdiqtavrnnggghlnhslfwrlltpggakepvgelkkaideqfggfqalkekltqaamgrfgsgwawlvkdpfgklhvlstpnqdnpvmegftpivgidvwehayylkyqnrradylqaiwnvlnwdvaeeffnka(seq id no:1)。
24.申请人前期利用ms-sod对各肿瘤细胞进行生长和细胞迁移实验，后期着重探索ms-sod对胃癌细胞生长、迁移、克隆形成、周期、凋亡等细胞表型实验，探究其对肿瘤细胞增殖调控作用机理。
25.通过实验发现，ms-sod对卵巢癌细胞(es2、skov3)和肺癌(a549、pc9)细胞作用明显，以10u/ml浓度的sod就能对肿瘤细胞的生长起到抑制作用，并且有效抑制了肿瘤细胞的迁移。后期对胃癌细胞(bgc823、sgc7901)和肠癌细胞(sw620、hct116、hct15)进行相同的处理，发现10u/ml浓度的sod能有效抑制胃癌细胞和肠癌细胞的生长，且ms-sod还能有效抑制胃癌细胞的迁移。
26.1、实验细胞和培养体系
27.(1)细胞包括：人正常肝细胞(lo2)和胃癌细胞(sgc7901、bgc823)来自中山大学癌症中心馈赠，肠癌细胞(hct15、hct116、sw620)来自浙江理工大学馈赠，卵巢癌细胞(skov3、
es2)，肺癌细胞(a549、pc9)，胃肠道间质瘤(gist48b、gist-t1)，和间皮瘤细胞(ms924)均来自美国哈佛大学医学院brigham and women’s hospital馈赠。
28.(2)细胞所需培养条件：37℃，5％的co2浓度；
29.(3)培养基：lo2和sw620使用10％fbs的dmem(gibco,c11330500bt)；gist48b使用10％imdm(gibco,c12440500bt)；sgc7901、bgc823、hct15、hct116、skov3、es2、a549、pc9、gist-t1、ms924使用10％fbs的rpmi1640(gibco,c11875500bt)。
30.2、实验试剂
31.(1)含10％fbs的细胞培养基：
[0032][0033]
混合均匀，封口膜封住瓶口，存放于4℃。
[0034]
(2)噻唑蓝(mtt)工作液的配置：
[0035]
取40ml无菌pbs于50ml离心管，称取200mg噻唑蓝粉末加入，摇晃震荡，完全溶解后用0.2μm的过滤器过滤于15ml离心管，保存于-80℃备用(注意避光)。
[0036]
(3)pi溶液：
[0037][0038]
pi染工作液50ml，4℃，避光，可保存数月。
[0039]
(4)75％乙醇
[0040][0041]
4℃保存。
[0042]
3、主要仪器
[0043][0044]
4、实验步骤与方法
[0045]
4.1细胞生长检测(mtt法)
[0046]
1.将肿瘤细胞以3000个/孔，提前一天铺至96孔板，培养箱培养；
[0047]
2.次日早上弃培养基，加入新培养基，并加入不同浓度的ms-sod(10、25、50、100、200u/ml)，分别在作用3天和6天进行mtt测定，期间三天更换一次培养基并重新加入同样浓度的ms-sod；
[0048]
3.加mtt(5mg/ml)20μl/孔，放置培养箱3-4h，反应完全；
[0049]
4.小心弃上清，加入二甲基亚砜150μl/孔；
[0050]
5.水平振荡器震荡8min，600rpm；
[0051]
6.酶标仪检测，a
490nm
，作图。
[0052]
4.2细胞划痕
[0053]
1.六孔板中，待细胞丰度达到95％-100％时，弃掉上清，用100μl的头，垂直于六孔板长边平行划3道线，保持力度大小一致；
[0054]
2.用pbs清洗后后加入完全培养基，再加药，药物浓度为：ms-sod(u/ml)：50、200，显微镜下观察拍照0h照片；
[0055]
3.此后每隔12h拍照一次，正常喂养细胞，直至对照组伤口愈合。
[0056]
4.3细胞周期检测
[0057]
1.在15ml离心管上标注好信息，将旧的培养基收集于其中，pbs清洗一次细胞，清洗液也收集于其中；
[0058]
2.加胰蛋白酶500μl/孔，消化细胞，放置37℃培养箱适当时间，吹打细胞至成单个悬浮，转移进对应15ml离心管；
[0059]
3. 1000rpm，5min，弃上清；
[0060]
4.加1ml预冷的pbs重悬细胞，转移到1.5ml离心管中；
[0061]
5.重复步骤3一次；
[0062]
6.轻轻缓慢加入预冷的70％乙醇，轻混，4℃固定过夜；
[0063]
7.次日离心，弃上清；
[0064]
8.加入1ml预冷的pbs清洗一次，弃上清；
[0065]
9.加入0.4ml pi溶液，避光染30min；
[0066]
10.流式细胞仪c6检测。
[0067]
4.4细胞凋亡检测
[0068]
操作同4.3的步骤1-5；细胞凋亡测定采用pe annexin v apoptosis detection kit i(bd，559763)包含结合溶液、annexin v和7-add。
[0069]
1.向每管加入0.5ml 1x结合溶液，小心吹打细胞；
[0070]
2.取100μl细胞悬液至新的离心管内，立刻取annexin v与7-add各3μl加入其中；
[0071]
3.涡旋(需要轻柔)，置于常温避光15min；
[0072]
4.时间到，加入400μl 1x结合溶液，震荡混匀，2小时内流式细胞仪c6检测。
[0073]
4.5克隆形成实验
[0074]
1.将胃癌细胞以500个/孔铺至六孔板中，培养箱中培养至克隆形成，三天更换一次新鲜培养基，直到形成的每个克隆细胞量有30-50个，加入ms-sod(u/ml)：10、50、100、200，放入培养箱培养，正常换培养基喂养细胞，以下步骤都相同；
[0075]
2.吸掉旧培液，用pbs溶液小心润洗一遍，放在一边使其干燥；
[0076]
3.干燥后各孔以1ml甲醇固定20分钟；
[0077]
4.固定完后，用移液器吸掉甲醇，空气干燥；
[0078]
5.之后用1ml结晶紫染液处理40分钟；
[0079]
6.结晶紫回收，4℃保存；
[0080]
7.将6孔板用细小的流水小心冲掉剩余结晶紫，放在一边使其干燥，拍照记录；
[0081]
8.用33％的乙酸溶液洗脱，转移至96孔板；
[0082]
9.用酶标仪测定a
570
，利用数据绘图。
[0083]
4.6细胞侵袭实验
[0084]
1.实验前一天铺好基质胶(康宁，货号356234)，基质胶提前置于冰里融化，所用到的头、ep管放到冰上预冷；基质胶和预冷的无血清培养基以1:10比例混合；
[0085]
2.在24孔板里提前摆放好小室，每个小室慢慢加入60ml基质胶混合液，避免有气泡产生，如果有要及时扎破；
[0086]
3.盖好盖子，用封口膜封住周边，室温静置1h，然后放置4℃冰箱保存；
[0087]
4.提前30min拿出铺好的基质胶于室温放置；
[0088]
5.细胞消化，1000rpm，离心3min，弃上清；
[0089]
6.用pbs润洗，之后以0.5％fbs培养基润洗；
[0090]
7.取0.5％fbs培养基轻柔重悬细胞，取10μl计数，调整细胞浓度，保证200μl有7万个细胞(根据细胞生长快慢调整细胞数量，本实验针对胃癌细胞)；
[0091]
8.在24孔板底部(下室)加入正常培养基500μl，吸去小室内的上清，加入200μl细胞液，避免小室上部和下部出现气泡，将24孔板放入37℃培养箱，2h后再去观察是否有气泡出现，如果有要用头扎破；
[0092]
9.培养48h，吸去小室内旧培液，pbs润洗，卫生纸轻蘸去残留液体；
[0093]
10.取500μl甲醇放于24孔板剩余孔内，将小室放入甲醇中，上室加入200μl甲醇，室温固定20min；
[0094]
11.在空白孔加入500μl结晶紫备用，将小室取出，晾干，染45min；
[0095]
12.取出小室，用pbs洗涤多次，轻蘸去水，用湿棉棒轻轻擦去上室的基质胶，注意要轻柔，不要戳破膜；
[0096]
13.在显微镜下，取9个不同视野拍照；
[0097]
14.用手术刀割下薄膜，放置酶标板里，加入适量33％的冰醋酸震荡溶解；15.a
570
检测，定量分析。
[0098]
实施例1：ms-sod对各肿瘤细胞生长影响
[0099]
本实验选取卵巢癌细胞(es2和skov3)，肺癌细胞(a549和pc-9)，间皮瘤细胞(ms924)，胃肠道间质瘤细胞(gist-t1和gist48b),胃癌细胞(sgc7901和bgc823)及肠癌细胞(sw620、hct15和hct116)，每种细胞，3000个细胞每孔铺于96孔板，分别加入不同量的ms-sod，培养3天和6天后测定细胞的增殖(mtt法测定)。结果如图1的a和b显示，与对照组h2o相比，ms-sod能显著抑制细胞的增殖。
[0100]
实施例2：ms-sod对各肿瘤细胞迁移影响
[0101]
本实验选取卵巢癌细胞(es2和skov3)，肺癌细胞(a549和pc-9)，间皮瘤细胞(ms924)，胃肠道间质瘤细胞(gist-t1和gist48b)，胃癌细胞(sgc7901和bgc823)及肠癌细胞(sw620、hct15和hct116)，待细胞丰度达到100％时，用100μl头划痕(细胞划痕实验见4.2节)，每隔12h拍照记录一次，直至对照组细胞愈合。结果如图2显示，与对照组h2o相比，ms-sod能显著抑制肿瘤细胞的迁移。
[0102]
实施例3：ms-sod对胃癌细胞克隆形成的影响
[0103]
本实验选取胃癌细胞(sgc7901和bgc823)作为实验对象，参照4.5节的实验步骤，将细胞消化下来，以500细胞每孔铺于六孔板中，培养至每个克隆有30-50细胞左右，加ms-sod(50u、100u、200u)处理，以h2o为对照，对照组与实验组有显著差别时，进行染处理并拍照(如图3所示)。冰醋酸洗脱结晶紫，定量转化为图4。结果显示，加入ms-sod处理后，与对照组h2o相比，克隆数量减少，特别是高浓度ms-sod处理后，效果更加明显。因此，ms-sod能显著抑制胃癌细胞的克隆形成能力。
[0104]
实施例4：ms-sod对胃癌细胞周期、细胞凋亡的影响
[0105]
参照4.3和4.4节的实验步骤，本实验将胃癌细胞(sgc7901和bgc823)铺于六孔板，第二天加ms-sod(50u、100u、200u)处理4天，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。如图5所示，sgc7901处理组和对照组h2o相比，细胞周期阻滞在g2期，bgc823则周期效果不太明显；从图6看出，加入ms-sod处理组与对照组h2o相比，ms-sod促进了胃癌细胞的凋亡，bgc823相比较于sgc7901而言，凋亡效果更加明显。
[0106]
实施例5：ms-sod突变体h29a对胃癌细胞生长的影响
[0107]
参照实施例3的操作，本实验选取胃癌细胞(sgc7901和bgc823)，3000个细胞每孔铺于96孔板，培养6天后测定细胞的增殖。对ms-sod进行点突变，得到突变体h29a；对胃癌细胞施用该突变体(10、25、50、100和200u/ml)。图7的结果显示，与对照组h2o相比，ms-sod突变体h29a对胃癌细胞的增殖无影响。
[0108]
实施例6：ms-sod突变体h29a对胃癌细胞迁移的影响
[0109]
本实验选取胃癌细胞(sgc7901和bgc823)，将细胞铺板于六孔板，待细胞丰度达到100％时，用100μl头划痕(划痕实验见4.2节，使用的浓度为10、50、100u/ml)，每隔12h拍照记录一次，直至对照组细胞愈合。本实施例中使用如实施例5所示的ms-sod突变体h29a。图8的结果显示，与对照组h2o相比，ms-sod突变体h29a对胃癌细胞的迁移无影响。
技术特征：
1.锰型高稳定性超氧化物歧化酶在制备预防或肿瘤的药物中的应用，其中，所述锰型高稳定性超氧化物歧化酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述肿瘤为良性肿瘤或恶性肿瘤。3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述肿瘤为胃肠道间质瘤、间皮瘤、卵巢癌、肺癌、胃癌或肠癌。4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其中，所述药物通过口服或注射途径给药。5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述注射为静脉注射或腹腔注射。6.根据权利要求4所述的应用，其中，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、粉剂、粉针、注射剂或气雾剂。7.根据权利要求1-6中任一项所述的应用，其中，所述药物还包括一种或多种制药学上可接受的辅料。8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述一种或多种制药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、溶剂和缓冲剂。
技术总结
本发明涉及肿瘤的预防或，提供了氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的MS-SOD在肿瘤预防或中的应用。本发明的MS-SOD对卵巢癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、肠癌细胞、胃肠道间质瘤细胞以及间皮瘤细胞等都有明显的抑制生长作用，且能够抑制细胞迁移，具有所述肿瘤的潜力。的潜力。
技术研发人员：
孟凡国 李海龙 欧文斌 周盛梅
受保护的技术使用者：
凯睿恒济生物医药（杭州）有限公司
技术研发日：
2021.06.25
技术公布日：
2022/12/26
