一种基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法与流程

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1.本发明涉及一种生物医学领域的用于防脱发和育发的方法，具体地，涉及一种基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法。

背景技术：

2.随着经济的快速发展，科技发达，快节奏的生活，人们面对的压力也越来越大，脱发人不断增加，而且脱发也慢慢趋向于年轻化。脱发是由许多内部或外部因素引起，例如荷尔蒙平衡紊乱，以及外部环境因素(电脑及各类电子产品的辐射)等一系列因素。对于脱发、斑秃等毛囊相关问题的解决，目前常规的手段有基因、药物和植发等。但是上述方法都具有它的缺点：使用药物针对脱发问题，一旦停药，会使病情反复，持续使用药物，会导致副作用累积。而植发虽然能恢复头发生长，是现如今比较流行的方法之一，但手术费用比较昂贵且操作也不是很方便，因此，替代方法对解决脱发至关重要。
3.现如今，人们对具有保护与美观作用的毛发越来越重视。对毛囊周期性再生的研究具有现实且重要的意义。毛囊干细胞(hairfolliclestemcell，hfsc)是毛囊中的干细胞，和其他成体干细胞一样，具有慢周期性、未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。毛囊干细胞还具有高增殖力、位于体表易于获取、无再创伤性，并有向表皮及附属器分化的特性，因此毛囊干细胞作为新的种子细胞日益受到人们的重视。

技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种利用毛囊干细胞的激活产物进行防育脱发的方法，能够解决现有技术中存在的问题，用于防育脱发的效果明显优于传统培养方法。
5.为了达到上述目的，本发明提供了一种基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法，其中，该方法包含：步骤1，在无菌条件下，取单株毛囊，并进行洗涤；步骤2，取出无菌培养皿，将单株毛囊转入培养皿中，将无菌盖玻片覆于毛囊上，静置片刻，用移液吸取原代培养基滴入培养皿中，盖上培养皿盖，标注好代次及日期，转至培养箱中培养；步骤3，原代p0培养第3天，将原代细胞和培养皿从培养箱中取出，喷洒酒精后转入生物安全柜，取出干细胞培养基在室温下静置后，再喷洒酒精转入生物安全柜，将培养皿中的培养上清吸出并弃之，分别另加新鲜的干细胞培养基，盖上培养皿盖，转入培养箱中继续培养；步骤4，原代p0培养第5天、第7天和第10天，对原代细胞进行换液，过程与步骤3相同；步骤5，p0代传p1代：在p0代培养第14天，将原代细胞和培养皿从细胞培养箱中取出，显微镜下观察，然后进行传代，将培养上清吸出并弃之，再吸取生理盐水，润洗细胞层后，滴加温和消化酶，在细胞消化完全后，加入生理盐水终止消化，吹打细胞悬液，并收集至离心管中，进行离心，然后弃上清，吸取干细胞培养基重悬细胞沉淀，再分别吸取干细胞培养基至2个细胞培养瓶中，然后将细胞悬液分别接种于细胞培养瓶中，混匀，转至培养箱中培养；步骤6，p1代传p2代：在p1代培养第3天后，从培养箱取出培养瓶，在显微镜下观察确认是否进行传代，传代过程与步骤5相同，将接种完的细胞培养瓶转至培养箱中继续培养；步骤7，在p2代培养的第2天，从
培养箱中取出细胞培养瓶，在显微镜下观察，然后在培养基中加入5％的脐带血cgf继续培养三天；步骤8，从步骤7所得的培养瓶中，获取毛囊干细胞与含5％脐带血cgf的培养基共培养后的上清液，即为毛囊干细胞的激活产物；步骤9，将毛囊干细胞的激活产物与米诺地尔共同使用在脱发的头皮表面，实现防育脱发。
6.进一步地，所述的步骤1中，在无菌条件下，取单株毛囊，并将单株毛囊用生理盐水加1％双抗洗涤4遍。
7.进一步地，所述的步骤2中，取出6孔无菌培养皿，用无菌眼科镊将单株毛囊转入培养皿中，将无菌盖玻片覆于毛囊上，静置，用移液吸取原代培养基缓慢滴入6孔板中，盖上培养皿盖，标注好代次及日期，转至37℃、5％co2培养箱中培养。
8.进一步地，所述的步骤3中，原代p0培养第3天，将原代细胞从培养箱中取出，喷洒75％酒精后转入生物安全柜，取出干细胞培养基在室温下静置15分钟后，喷洒75％酒精转入生物安全柜，手部消毒后，打开细胞培养皿盖，用移液将培养上清吸出并弃之，每孔分别另加新鲜的干细胞培养基，盖上培养皿盖，转入37℃、5％co2培养箱中继续培养。
9.进一步地，所述的步骤5中，p0代培养第14天，将原代细胞从细胞培养箱中取出，显微镜下观察到细胞融合率大于85％，则将细胞培养皿喷洒75％酒精后转入生物安全柜，取出温和消化酶和干细胞培养基，在室温下静置15分钟后，喷洒75％酒精，转入生物安全柜，手部消毒后，打开细胞培养皿盖，用移液将培养上清吸出并弃之，用50ml无菌注射器吸取50ml生理盐水至50ml离心管中，取出移液用1ml吸头吸取生理盐水，分别润洗细胞层后，用移液吸取温和消化酶，每孔滴加1ml的温和消化酶，消化2分钟后，在显微镜下看到明亮且圆形的细胞呈流沙状脱落，则细胞消化完全，然后在每个孔中加入2ml生理盐水终止消化，用移液沿着培养皿底部吹打细胞悬液，并收集至50ml离心管中，配平，400g离心5min后，喷洒75％酒精，转入生物安全柜中，弃上清，用移液吸取1ml干细胞培养基重悬细胞沉淀，取2个t75细胞培养瓶，喷洒75％酒精后转入生物安全柜，取1支10ml移液管，用电动移液器分别吸取12ml干细胞培养基至2个t75细胞培养瓶中，将1ml细胞悬液分别接种于t75细胞培养瓶中，混匀，转至37℃、5％co2培养箱中培养。
10.进一步地，所述的步骤6中，在p1代培养第3天后，从培养箱取出t75培养瓶，在显微镜下观察细胞融合率大于85％，则进行传代，然后将接种完的细胞培养瓶转至37℃、5％co2培养箱中继续培养。
11.进一步地，所述的步骤7中，在p2代培养的第2天，从培养箱中取出细胞培养瓶，在显微镜下观察，细胞融合率在70％，则向培养基中加入5％的脐带血cgf，继续培养三天。
12.进一步地，步骤9中，第1天在脱发的头皮表面涂上米诺地尔，再联合使用毛囊干细胞的激活产物；然后在第2～13天，每天使用毛囊干细胞的激活产物涂抹于头皮脱发处；第14天重复第1天的操作；每两周为一个循环，共进行三个月。
13.本发明提供的基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法具有以下优点：
14.本发明首次使用脐带血cgf结合毛囊干细胞共培养的方法，相比传统的干细胞培养方法，细胞在培养过程中产生的细胞生长因子含量高于传统的培养方法。
15.本发明采用的是自体的毛囊干细胞，且培养方法相较于传统的方法简单有效。
16.本发明在使用时，步骤是采用米诺地尔和微针刺激相结合的方式，使细胞上清液能更好的进入头皮中从而发挥作用，使效果达到最佳状态。
17.本发明方案中的毛囊干细胞激活产物的使用时间点以及使用周期能合理有效的利用头皮恢复周期，在恢复期配合涂抹细胞上清液，完全可以防育脱发。
附图说明
18.图1为本发明实施例中实验组受试者使用毛囊干细胞的激活产物三个月后的效果图。
19.图2为本发明实施例中的实验组和对照组在三个月后的数据统计图。
具体实施方式
20.以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步地说明。
21.本发明提供的一种基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法其包含：
22.步骤1，在无菌条件下，取单株毛囊，并进行洗涤。
23.步骤2，取出无菌培养皿，将单株毛囊转入培养皿中，将无菌盖玻片覆于毛囊上，静置片刻，用移液吸取原代培养基滴入培养皿中，盖上培养皿盖，标注好代次及日期，转至培养箱中培养。
24.步骤3，原代p0培养第3天，将原代细胞和培养皿从培养箱中取出，喷洒酒精后转入生物安全柜，取出干细胞培养基在室温下静置后，再喷洒酒精转入生物安全柜，将培养皿中的培养上清吸出并弃之，分别另加新鲜的干细胞培养基，盖上培养皿盖，转入培养箱中继续培养。
25.步骤4，原代p0培养第5天、第7天和第10天，对原代细胞进行换液，过程与步骤3相同。
26.步骤5，p0代传p1代：在p0代培养第14天，将原代细胞和培养皿从细胞培养箱中取出，显微镜下观察，然后进行传代，将培养上清吸出并弃之，再吸取生理盐水，润洗细胞层后，滴加温和消化酶，在细胞消化完全后，加入生理盐水终止消化，吹打细胞悬液，并收集至离心管中，进行离心，然后弃上清，吸取干细胞培养基重悬细胞沉淀，再分别吸取干细胞培养基至2个细胞培养瓶中，然后将细胞悬液分别接种于细胞培养瓶中，混匀，转至培养箱中培养。
27.步骤6，p1代传p2代：在p1代培养第3天后，从培养箱取出培养瓶，在显微镜下观察确认是否进行传代，传代过程与步骤5相同，将接种完的细胞培养瓶转至培养箱中继续培养。
28.步骤7，在p2代培养的第2天，从培养箱中取出细胞培养瓶，在显微镜下观察，然后在培养基中加入5％的脐带血cgf继续培养三天。
29.步骤8，从步骤7所得的培养瓶中，获取毛囊干细胞与含5％脐带血cgf(concentrate growth factors，浓缩生长因子)的培养基共培养后的上清液，即为毛囊干细胞的激活产物。
30.cgf是通过抽取血液，再经一系列的分离、浓缩和提取等技术，不添加任何添加剂制取出来的一种似果冻状物质，因富含大量的生长因子、白细胞、cd34+细胞和纤维蛋白，具有更佳的促进骨组织、软组织及皮肤再生能力，又被称为血液中的”不老因子”。
31.步骤9，将毛囊干细胞的激活产物与米诺地尔共同使用在脱发的头皮表面，实现防
育脱发。
32.下面结合实施例对本发明提供的基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法做更进一步描述。
33.需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
34.除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
35.实施例1
36.一种基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法，其包含：
37.步骤1，在无菌条件下，取单株毛囊，将单株毛囊用生理盐水加1％双抗洗涤4遍。
38.步骤2，取出6孔无菌培养皿，用无菌眼科镊将单株毛囊小心转入培养皿中，将无菌盖玻片覆于毛囊上，静置片刻，用移液吸取原代培养基缓慢滴入6孔板中，盖上培养皿盖，标注好代次及日期，转至37℃、5％co2培养箱中培养。
39.步骤3，原代(p0)培养第3天，将原代细胞小心从培养箱中取出，喷洒75％酒精后转入生物安全柜，取出干细胞培养基在室温下平衡15分钟后，喷洒75％酒精转入生物安全柜，手部消毒后，打开细胞培养皿盖，用移液将培养上清吸出并弃之，每孔分别另加新鲜的干细胞培养基，盖上培养皿盖，转入37℃、5％co2培养箱中继续培养。
40.步骤4，p0代培养第5天、第7天和第10天，对原代细胞进行换液，过程与步骤3相同。
41.步骤5，p0代传p1代，p0代培养第14天，将原代细胞从细胞培养箱中取出，显微镜下观察，细胞融合率大于85％，将细胞培养皿喷洒75％酒精后转入生物安全柜，取出温和消化酶和干细胞培养基，在室温下静置15分钟后，喷洒75％酒精，转入生物安全柜，手部消毒后，打开细胞培养皿盖，用移液将培养上清吸出并弃之，用50ml无菌注射器吸取50ml生理盐水至50ml离心管中，取出移液用1ml吸头吸取生理盐水，分别润洗细胞层后，用移液吸取温和消化酶，每孔滴加1ml的温和消化酶，消化2分钟后，可在显微镜下看到，明亮且圆形的细胞呈流沙状脱落，细胞消化完全，可以终止消化，在每个孔中加入2ml生理盐水终止消化，用移液沿着培养皿底部小心吹打细胞悬液，并收集至50ml离心管中，配平，400g离心5min后，喷洒75％酒精后转入生物安全柜中，弃上清，用移液吸取1ml干细胞培养基重悬细胞沉淀，取2个t75细胞培养瓶，喷洒75％酒精后转入生物安全柜，取1支10ml移液管，用电动移液器分别吸取12ml干细胞培养基至2个t75细胞培养瓶中，将1ml细胞悬液分别接种于t75细胞培养瓶中，混匀，转至37℃、5％co2培养箱中培养。
42.步骤6，p1代传p2代，p1代培养第3天后，从培养箱取出t75培养瓶，在显微镜下观察细胞融合率大于85％，则细胞可进行传代。传代过程与步骤5相同，将接种完的细胞培养瓶转至37℃、5％co2培养箱中继续培养。
43.步骤7，p2代培养的第2天，从培养箱中取出细胞培养瓶，在显微镜下观察细胞融合率在70％左右，在培养基中加入5％的脐带血cgf继续培养三天。
44.步骤8，从步骤7所得的培养瓶中，获取毛囊干细胞与含5％脐带血cgf的培养基共培养后的上清液，即为毛囊干细胞的激活产物。
45.通过以上过程完成毛囊干细胞的提取。毛囊干细胞的激活产物即为毛囊干细胞与含5％脐带血cgf的培养基共培养后的上清液。
46.步骤9，将毛囊干细胞的激活产物与米诺地尔共同使用在脱发的头皮表面，实现防育脱发。
47.实施例2
48.选择实施例1制备的毛囊干细胞的激活产物，进行使用。
49.1)使用第1天，在脱发者头部敷麻药至麻药起作用(按照麻药说明书上建议敷麻时间)，麻药清洗完毕后进行消毒，然后用5ml注射器吸取上清液，即毛囊干细胞的激活产物，然后将注射器安装到微针按摩器上，将微针长度调整到0.3微米，然后先将患处涂上米诺地尔，再用微针反复按摩患处，将头皮头皮刺破至出血，从而达到激活毛囊干细胞、血小板活化和皮肤损伤修复机制的释放，完毕后，照led光15分钟，本次使用结束(24小时后才可洗头)。
50.2)第2-13天，每天使用毛囊干细胞上清液涂抹于患处。
51.3)第14天，步骤同1)，用滚针配合按摩，2周一次，三个月为一个疗程。
52.4)使用期间注意防晒，夏季出门戴帽子或者打遮阳伞。
53.实施例3
54.随机选择70名脱发者，35名作为实验组的研究对象，35名作为对照组，进行三个月的试验。两组性别、年龄等临床资料差异无统计学意义。
55.实验组采用实施例1所得的毛囊干细胞的激活产物，按照实施例2的过程进行。对照组使用传统的毛囊细胞培养方法所得的产物。
56.三个月后，实验组受试者使用本发明的效果参见图1所示。脱发人使用后的最终统计结果如图2所示。
57.通过结果可见，本发明的细胞培养方法明显优于传统细胞培养方法，用于脱发人后，痊愈数字高于传统方法，而传统培养方法的效果一般，使用后无效的病例也较多。
58.本发明的基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法，本发明采用的脐带血cgf结合毛囊干细胞培养的方法，脐带血的cgf的优势在于cd34+含量高，免疫源低，相较于传统单独使用干细胞培养基培养细胞所收集的上清液生长因子的含量高，本方法用于防育脱发的效果明显优于传统培养方法。
59.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

技术特征：

1.一种基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法，其特征在于，该方法包含：步骤1，在无菌条件下，取单株毛囊，并进行洗涤；步骤2，取出无菌培养皿，将单株毛囊转入培养皿中，将无菌盖玻片覆于毛囊上，静置片刻，用移液吸取原代培养基滴入培养皿中，盖上培养皿盖，标注好代次及日期，转至培养箱中培养；步骤3，原代p0培养第3天，将原代细胞和培养皿从培养箱中取出，喷洒酒精后转入生物安全柜，取出干细胞培养基在室温下静置后，再喷洒酒精转入生物安全柜，将培养皿中的培养上清吸出并弃之，分别另加新鲜的干细胞培养基，盖上培养皿盖，转入培养箱中继续培养；步骤4，原代p0培养第5天、第7天和第10天，对原代细胞进行换液，过程与步骤3相同；步骤5，p0代传p1代：在p0代培养第14天，将原代细胞和培养皿从细胞培养箱中取出，显微镜下观察，然后进行传代，将培养上清吸出并弃之，再吸取生理盐水，润洗细胞层后，滴加温和消化酶，在细胞消化完全后，加入生理盐水终止消化，吹打细胞悬液，并收集至离心管中，进行离心，然后弃上清，吸取干细胞培养基重悬细胞沉淀，再分别吸取干细胞培养基至2个细胞培养瓶中，然后将细胞悬液分别接种于细胞培养瓶中，混匀，转至培养箱中培养；步骤6，p1代传p2代：在p1代培养第3天后，从培养箱取出培养瓶，在显微镜下观察确认是否进行传代，传代过程与步骤5相同，将接种完的细胞培养瓶转至培养箱中继续培养；步骤7，在p2代培养的第2天，从培养箱中取出细胞培养瓶，在显微镜下观察，然后在培养基中加入5％的脐带血cgf继续培养三天；步骤8，从步骤7所得的培养瓶中，获取毛囊干细胞与含5％脐带血cgf的培养基共培养后的上清液，即为毛囊干细胞的激活产物；步骤9，将毛囊干细胞的激活产物与米诺地尔共同使用在脱发的头皮表面，实现防育脱发。2.如权利要求1所述的基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法，其特征在于，所述的步骤1中，在无菌条件下，取单株毛囊，并将单株毛囊用生理盐水加1％双抗洗涤4遍。3.如权利要求1所述的基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法，其特征在于，所述的步骤2中，取出6孔无菌培养皿，用无菌眼科镊将单株毛囊转入培养皿中，将无菌盖玻片覆于毛囊上，静置，用移液吸取原代培养基缓慢滴入6孔板中，盖上培养皿盖，标注好代次及日期，转至37℃、5％co2培养箱中培养。4.如权利要求1所述的基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法，其特征在于，所述的步骤3中，原代p0培养第3天，将原代细胞从培养箱中取出，喷洒75％酒精后转入生物安全柜，取出干细胞培养基在室温下静置15分钟后，喷洒75％酒精转入生物安全柜，手部消毒后，打开细胞培养皿盖，用移液将培养上清吸出并弃之，每孔分别另加新鲜的干细胞培养基，盖上培养皿盖，转入37℃、5％co2培养箱中继续培养。5.如权利要求1所述的基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法，其特征在于，所述的步骤5中，p0代培养第14天，将原代细胞从细胞培养箱中取出，显微镜下观察到细胞融合率大于85％，则将细胞培养皿喷洒75％酒精后转入生物安全柜，取出温和消化酶和干细胞培养基，在室温下静置15分钟后，喷洒75％酒精，转入生物安全柜，手部消毒后，打开细胞培养皿盖，用移液将培养上清吸出并弃之，用50ml无菌注射器吸取50ml生理盐水至50ml离
心管中，取出移液用1ml吸头吸取生理盐水，分别润洗细胞层后，用移液吸取温和消化酶，每孔滴加1ml的温和消化酶，消化2分钟后，在显微镜下看到明亮且圆形的细胞呈流沙状脱落，则细胞消化完全，然后在每个孔中加入2ml生理盐水终止消化，用移液沿着培养皿底部吹打细胞悬液，并收集至50ml离心管中，配平，400g离心5min后，喷洒75％酒精，转入生物安全柜中，弃上清，用移液吸取1ml干细胞培养基重悬细胞沉淀，取2个t75细胞培养瓶，喷洒75％酒精后转入生物安全柜，取1支10ml移液管，用电动移液器分别吸取12ml干细胞培养基至2个t75细胞培养瓶中，将1ml细胞悬液分别接种于t75细胞培养瓶中，混匀，转至37℃、5％co2培养箱中培养。6.如权利要求1所述的基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法，其特征在于，所述的步骤6中，在p1代培养第3天后，从培养箱取出t75培养瓶，在显微镜下观察细胞融合率大于85％，则进行传代，然后将接种完的细胞培养瓶转至37℃、5％co2培养箱中继续培养。7.如权利要求1所述的基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法，其特征在于，所述的步骤7中，在p2代培养的第2天，从培养箱中取出细胞培养瓶，在显微镜下观察，细胞融合率在70％，则向培养基中加入5％的脐带血cgf，继续培养三天。8.如权利要求1所述的基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法，其特征在于，所述的步骤9中，第1天在脱发的头皮表面涂上米诺地尔，再联合使用毛囊干细胞的激活产物；然后在第2～13天，每天使用毛囊干细胞的激活产物涂抹于头皮脱发处；第14天重复第1天的操作；每两周为一个循环，共进行三个月。

技术总结

本发明公开了一种基于毛囊干细胞的激活产物防脱育发的方法，包含：步骤1，取单株毛囊，进行洗涤；步骤2，将单株毛囊转入培养皿中，滴入原代培养基，转至培养箱中培养；步骤3，原代P0培养第3天，进行换液；步骤4，原代P0培养第5天、第7天和第10天，分别进行换液；步骤5，P0代传P1代；步骤6，P1代传P2代；步骤7，P2代培养的第2天，在培养基中加入5％的脐带血CGF，继续培养三天；步骤8，获取毛囊干细胞与含5％脐带血CGF的培养基共培养后的上清液，即为毛囊干细胞的激活产物；步骤9，将毛囊干细胞的激活产物与米诺地尔共同使用在脱发的头皮表面。本发明的方法简单有效，用于防育脱发的效果明显优于传统方法。传统方法。传统方法。