第一节融合程序
融合方法:
1、将108 脾细胞与2—5x107 SP2/0细胞混合于1支50ml融合管中，加入30mlDMEM基础液；
2、1000r/m离心5分钟；
3、吸净全部培养液；
4、在手掌上轻击离心管底部以打碎细胞积块，置400C水浴中预热；
5、用1ml吸管在45秒内加预热至370C的50%PEG（PH8.0）1ml，边加边搅；
卧式钻床6、用1ml吸管在90秒内加20—30ml
7、20—37℃静置10分钟；
7、1000r/m5分钟；
8、弃尽上清，轻击离心管底以分散细胞积块，重新悬浮于80—100mlHAT培养基中；
9、按比例加入107 —2X77 腹腔细胞（约2只小鼠）； 10、分装96孔细胞培养板，每孔0.10__0.15ml；24孔板，每孔1.0__1.5ml;
11、7.5%CO2,37℃孵箱里培养;
12、5天后HAT培养基换出1/2培养液;
13、7__10天后用HT培养基换出HAT;
14、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测.
15、其它详细资料请参阅刘秀梵教授编<<；单克隆抗体及应用>>.
第二节溶液配方
一、基础培养液：
1、老配方DMEM 13.37g+1000ml双蒸水使之溶解
鞋楦机
丙铜酸钠0.11g
碳酸氢钠 3.6g
pen/str 20万/2
0．22u过滤，分装，4℃保存（不超过1个月）
揉棉机2、新配方DMEM基础液：
四蒸水980ml NaHCO3 3.7g
DME(Giboo) 13.37g S.P(100X)10ml(本实验室用1支庆大霉素)
1NHCl调试PH至7.2_7.4(本实验室用1NnaOH调至7.2_7.4)，过滤除菌，分装后4℃保存.
3、DMEM完全培养基：
30mlDMEM基础液中加15-20ml BFS，1mlL-G（100X）即为完全培养基。
4、HT培养基
100mlDMEM完全培养基中加入100X HT 1ml即成，或按下列配方直接配制：
四蒸水980ml
人造石板
DME（Giboo）13.37g L.G(100X) 10ml
HT(100X) 10ml BFS(NCS) 150_200ml
NaHCO3 3.7g S.P(100X) 100ml
用1NHCl调至7.2_7.4, 过滤除菌，分装后4℃保存。
二、100Xaminopterin（4x10（-5）M MW=440.4）
1.76mg A+90ml双蒸水+0.5ml 1N NaOH助溶，双蒸水加至100ml+0.5ml 1N HCl中和,0.22um滤膜过滤除菌，分装2ml小瓶,-20℃保存。
三、100XHT
Hypoxanthine：MW 136 10（-5）M solution
Thymidine：MW242.2 1.6X10(-1)M solution
H和T可以配在一起，136.1mgH+100ml双蒸水+1N NaOH至H溶解，加T38.8mg，把PH用醋酸调至9.5, 0.22um滤膜过滤除菌,-20℃保存。
四、100Xglutamine 200Mm Solution
2．92g glutamine
100mlDMEM基础液，,37℃助溶液
0.22um滤膜过滤除菌，分装2-5ml小瓶，-20℃保存。
五、融合剂配制：PEG（Baker 1000）20-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃
水浴融化，0.6ml分装于青链霉素小瓶中，高压蒸汽灭菌，-20℃保存备用。临用前加热融化，加等量DMEM基础液，用少许5.6%NaHCO3调PH至8.0。
第三节单抗制备技术中的其它方法
一、杂交瘤细胞的克隆化
1、制备小鼠腹腔细胞；
2、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液；用不着5-20%血清的HT培养基稀释后使每毫升含2.5、15、50个细胞3种不同的稀释度。
3、按每毫升加入5X10（4）-5X10（5）个细胞的比划，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔细胞；防辐射手机
4、每种杂交瘤细胞分装货6孔板一块，每个稀释度32孔，每孔的量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞分别为0.
5、3、10。（或将士、3、4步改为配制15毫升HT培养基中含100个细胞，加入腹腔细胞后分装96孔1块）；
5、37℃，7.5%CO2湿润培养基7—10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；
6、在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测；
7、取阳性的细胞扩大培养，并冻存。
二、细胞冻存和复苏方法
1、将对数生长期的杂交瘤细胞或其它细胞离心，重新悬浮于预冷的冻存液中（其中含10—20%小牛血清，10%DMOS的HT培养基），浓度至少5X10（6）/ml。
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2、分装安瓶，每瓶1ml，置水浴上。
3、封口后，将发瓶入入一带收口绳的小布袋内，立即将布袋放入内衬石棉的百铁筒内，置—70℃冰箱。
4、2—4小时后，或过夜后，将布袋移入液氮罐。
注意：在—70℃保存时间不宜过长，一般不超过24小时。
5、复苏细胞时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴中融化，待最后一点冰快要融化时，从冰浴中取出，置冰浴上，用5—10mlHT 培养基稀释，离心后，再悬浮于适量培养基中，装瓶，置37℃含7.5%CO2培养箱中培养。
6、如细胞存活率不高，可加腹腔细胞进行培养。
7、细胞存取均应为高，可加腹腔细胞进行培养。
8、细胞存取均应做好记录。
三、单抗的大量生产
1、腹腔接种降植烷（Pristane）或液体石腊，每只小鼠（2月龄以上）0.5ml.
2、7—10天后腹腔接种PBS稀释的杂交瘤细胞，每只鼠5X10（5）/ml0.2ml。
注意：每只鼠接种细胞数不可太多或太少，否则单抗菌素产量不高。3间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨起，以手
