一．前期对一些重要试剂用量的评估（以mRNA 100ng为计算标准）
1.如果原材料0.2g（约5株2周苗期的苗），分成两管，每管0.1g，则分别加TRIzol 2ml（共4ml），也就是说，每个生物样品作两次生物重复的话。每瓶TRIzol有100ml，所以可以做25个材料。 音箱分频器制作2.一个材料作二次生物重复，需要4根Zymo RNA纯化柱。一个标准Zymo Kit有100个反应柱子，也就是可以做25个材料。
3.RNA fragmentation完整Kit可以做100个样品。
4.mini/midi Kit可以做12个柱子反应。
二．前期准备工作
1.DEPC处理的Rnase free水；
2.RNA专用的75%乙醇、异丙醇、和NaOAc；
3.220℃烘烤>6小时的研磨棒、器皿和药匙；
三．其它小知识
理论上，每100mg材料可以获得100-200ug total RNA，纯化后获得的mRNA的量约为total RNA量的1/100。
四．具体实验步骤
（一）TRIzol提取总RNA
1．先将研磨棒等用液氮预冷，然后加液氮粉碎叶片（组织），越细越好。
电热恒温鼓风干燥机
2．准备好TRIzol管，每50-100mg材料加入1mlTRIzol（材料体积应小于TRIzol体积的10%），振荡或用移液器打至无大颗粒（震荡2分钟可）。 3．悬液室温放置>5min(可30min放置)。再加入1/5V（起始体积）氯仿，剧烈振荡1-2分钟，室温放置5min。然后13000rpm 2-8℃ 离心30 min。
4．吸取无上清（约有1/2的起始体积量），加入1/2 V（起始体积）异丙醇。室温放置10 min。然后13000rpm 2-8℃ 离心30 min。
5．弃上清液。沉淀物以75%乙醇洗涤（>1ml乙醇/1mlTRIzol）。然后13000rpm 2-8℃ 离心10min。
6．空转一次，吸去上清。
7．适当干燥5 min。加入经DEPC处理的Rnase free水100ul，冰浴1小时。
rat组合8．检测：2µl电泳检测，另取1µl稀释10倍后测OD值。
9．【用RNase free 的Dnase酶切。（一般100ug 的总RNA中加4%-5%V的RNase inhibitor和10-20U的 Dnase，然后37℃ 30 min）。】
10．如果暂时不用，可以加1/10V的3M PH5.5的NaOAc和3V体积无水乙醇，-80℃放置2小时以上或overnight。然后12500rpm 2-8℃ 离心15 min，重复step 5-7。
（二）从总RNA提取mRNA（Oligotex mRNA Midi Kit）（REPEAT）
(NOTE: Oligotex、OBB先37℃预热，然后振荡，25℃备用。OEB 70℃预热。)
1．根据以下表格依次混合在1.5ml微离心管内。须充分混合。
total RNA | add Rnase-free water to total RNA sample: | Buffer OBB(µl) | Oligotex Suspension(µl) |
<=0.25mg | 250µl | 250 | 15 (mini Kit) |
0.25-0.50mg | 500µl | 500 | 30 (midi Kit) |
0.50-0.75mg | 500µl | 500 | 45 (midi Kit) |
0.75-1.00mg | 500µl | 500 | 55 (midi Kit) |
| | | |
2．在70℃水浴3 min。再室温放置20 min。然后以14000-18000 rpm 离心2 min，直至上清液澄清。（可将所弃上清液另外保留，第一遍提取结束后回收原先的Oligotex再次加10µl 新的Oligotex，第二遍提取mRNA。）
3．沉淀用等体积的OBB和Rnase-free Water充分振荡混合，再70℃水浴3 min。再室温放
置20 min。然后以14000-18000 rpm 离心2 min，直至上清液澄清。
4．用400µl的Buffer OW2 充分振荡混合，转移至小离心柱放置于1.5ml微离心管内，以14000-18000 rpm 离心1 min；重复此步骤。
5．再以14000-18000 rpm 空转离心1 min。
6．将此小离心柱换入新的Rnase-free的1.5ml微离心管内。把70℃预热的Buffer OEB 75µl加入离心柱中，用移液器吹打3-4下后，即以14000-18000 rpm 离心1 min进行洗脱。为了保证能彻底的洗脱下来，重复此步骤，最后为150µl。（NOTE:多样品时，为保证洗脱效率，可将内置小离心柱的微离心管先置于70℃预热。）
7．适量电泳检测。另取适量测OD值。
（三）纯化mRNA（每柱量<25ug）（Zymo Research RNA clean-up Kit）
1.每管mRNA样品中加4倍体积的RNA-Binding Buffer。混合后，转移至Zymo专用小离心柱放置于收集管内。以>10000 rpm 离心1 min。
2.然后加350µl Wash Buffer至离心柱，以>10000 rpm 离心1 min。重复此步骤。
3.再以 >10000rpm 空转离心1 min。
4.将此小离心柱换入新的Rnase-free的1.5ml微离心管内。用43µl Rnase-free Water洗脱，放置1 min后以>10000 rpm 离心1 min；重复此步骤，最后为86µl。
5.取1µl电泳检测，另取1µl稀释10倍后测OD值。
6.加1/10V的3M PH5.5的NaOAc和3V体积无水乙醇，-80℃ 30min-2小时。
7.10000rpm 4℃离心30min，弃上液，加75%乙醇 400ul洗，再10000rpm 4℃离心3min，弃上液，适当晾干5min，溶解于9ul Rnase free水中（冰浴放置30min-2小时）。
（四）mRNA fragmentation
化纤抽丝1.将9ul的mRNA样品转移到200ul PCR专用tube管中，再加10XFragmentation Buffer（Ambion，#AM8740）1ul，放置于PCR仪70度5分钟。
2.加入1ul Stop Buffer（Ambion，#AM8740），立即置于冰上。
3.转移到1.5ml的tube管中，依次加入1ul 3M NaOAc（PH5.2），2ul glycogen（Ambion，#AM9510），30ul 100% EtOH，-80度放置30分钟。
4.以14000rpm 4度离心25分钟沉淀，弃上液，加75%乙醇 400ul洗，再10000rpm 4℃离心3min，弃上液，适当晾干5min，溶解于10.5ul Rnase free水中（冰浴放置30min-2小时）。
（五）First strand cDNA synthesis
1.将10.5ul样品转移到200ul PCR专用tube管，然后加入1ul Random Hexamer Primers（3ug/ul，Invitrogen，#48190-011），在PCR仪65度放置5分钟，立即置于冰上。
2.准备以下的mixture，充分混合，保证能提供7.5ul mixture至一个样品。
依次5X first strand buffer（Invitrogen，#18064-014）4ul；
100mM DTT（Invitrogen，#18064-014）2ul；
dNTP mix（10mM）1ul；
RnaseOUT（40U/ul）（Invitrogen，#10777-019）0.5ul
3.将7.5ul mixture加入样品中，充分与样品混合，25度放置2分钟。
4.加1ul SuperScript II（200U/ul，Invitrogen，#18064-014）到样品中，按以下程序依次加热或置冷：
24ba25度10分钟--->42度50分钟--->70度15分钟--->4度hold
（以上每个样品实际量为20ul）
（六）Second strand cDNA synthesis
1.直接在样品加入51ul水。
2.依次加入5XSecond strand buffer（Invitrogen，#10812-014）20ul，dNTP mix（10mM）3ul，充分混合，再冰上放置5分钟。
3.webservice安全加入RNaseH（2U/ul，Invitrogen，#18021-014）1ul，DNA Pol I（10U/ul，Invitrogen，#18010-025）5ul，充分混合，在PCR仪16度放置2.5小时。
（以上每个样品实际量为100ul）
4.进行样品DNA纯化（Qiagen，#28106）：即每个样品中加500ul PB，转入柱子中，12500rpm离心1分钟，弃去下液，柱子中加750ul PE，12500rpm离心1分钟，弃去下液，再空转1分钟，放置1分钟，柱子换入新的tube管中，加入16ul EB洗脱，再加入16ul EB洗脱第二次.
5.各取2ul测OD值。
样品后续交给测序组，用Illumina Genomic DNA Sample Prep Kit（#1000181）继续样品制备，上样测序。
