亚基的拆离、肽链降解和肽段的分离从蛋白质相对分子质量的测定和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，可以知道蛋白质是否由多亚基组成。若末端分析只有单一的结果，说明分子由相同亚基组成，无需将亚基拆开、分离。反之，分子若有两种以上不同亚基组成，首先要将不同亚基之间的连接拆开，并进行分离提纯。提纯后的亚基肽链一般都是相对分子质量也比较大，需要将大的肽链降解成小的肽段，并将肽段提纯，然后才能正式开始顺序测序工作。 蛋白质由一条以上的肽链组成时，肽链间的结合可能是靠非共价键结合，也可能是靠共价键结合。在进行肽链顺序分析时，首先要将它们分离开来。
若多亚基间以非共价键连接，在温和条件下即可以拆离亚基，如改变溶液pH，将pH降低到3-4或升高到9-10；或者加入变性剂，如8mol/L 尿素或6mol/L盐酸胍等。
例如：血红蛋白经8mol/L脲处理后，α及β链可以得到分离；核酮糖二磷酸羧化酶在0.2mol/L巯基乙醇即1％SDS溶液中保温1小时，大小亚基便相互分开。 载人旅行箱
拆离后的亚基可以用凝胶过滤方法进行分离。
靠共价键结合的因此比较牢固须用特殊的化学作用使其破坏。最常见的是半胱氨酸残基经氧化作用而形
成胱氨酸残基，即二硫键结构。
1、过甲酸氧化法
优点：能将巯基和二硫键同时氧化成磺酸基，生成的磺酸基很稳定，肽链不再重新形成二硫键，便于肽链分离。
缺点：氧化过程中，同时将蛋黄酸的侧链氧化成亚砜，氨酸的侧链也遭破坏。
2、还原法
一般可使用过量巯基化合物，如β巯基乙醇。在室温或pH8-9条件下放置数小时，即可使二硫键还原成巯基。加入8mol/L尿素或6mol/L盐酸
胍使蛋白质变性。在这种情况下，还原剂才能有效地作用于暴露的二硫键。二硫键还原后，需要用巯基保护试剂，如碘乙酸，以防止其重新被氧化。
二、肽链的部分降解
由于氨基酸顺序测定多数采用Edman降解法，它一次能分析肽链长度约10余个氨基酸残基，所以分离得到的肽链如果太长，须将长的肽链断裂成易分析的较短的肽链。
肽链部分降解的方法要求选择性强、裂解点少、反应率高，一般采用化学裂解和酶解法。
1、化学裂解法
CNBr与肽链中Met侧链的硫醚基发生反应，生成环化的溴化亚氨内酯，此产物水解后，产生高丝氨酸内酯，使Met羧基端的肽键断裂。所以它只专一性切断肽链中由Met残基的羧基参加形成的肽键。由于大多 数Prot只含有很少的Met，因此CNBr裂解产生的肽段不多。这些肽段可以用胰蛋白酶处理使成更小的肽段。断裂反应在70％甲酸中进行，这样可以使卷曲的多肽链松散开来，以便暴露Met侧链，有利于和CNBr发生作用。
优点：产率高（可达85%），专一性强，切点少，故实际应用较多；缺点：多为大肽段。
2、酶解法
酶解法相对化学裂解法而言，有许多优点，如专一性强、裂解条件温和、副反应少等，再则蛋白水解酶对肽键的水解率很高，且不同蛋白水解酶对不同氨基酸形成的肽键水解专一性不同，故作用位点不同，水解所得片段大小也不一样，因此酶解法被广泛用于Prot的部分水解。酶有内切酶和外切酶，常用的内切酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等；而外切酶主要是羧肽酶和氨肽酶，
它们分别从肽链羧基端和氨基端水解。
密度天平
几种常用蛋白水解酶的作用位点
蛋白水解酶主要作用位点
胰蛋白酶Lys、Arg等碱性氨基酸的羧基端
芳香族氨基酸的羧基端
胰凝乳蛋白
酶
胃蛋白酶Phe、Trp、Leu、Ala等氨基酸的羧基端
梭菌蛋白酶Arg的羧基端
V8蛋白酶Asp、Glu等酸性氨基酸的羧基端
香仁夏露内肽酶Lys-
Lys的羧基端
C
3、羟胺裂解法
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羟胺（NH2OH）在pH9下能专一性地断裂-Asn-Gly-之间肽键，也能部分裂解-Asn-Leu-及-Asn-Ala-键，故专一性不是很强。在酸性条件下可以断裂-Asp-Pro-间的肽键，产率可达80％。
4、部分酸水解
一般认为酸水解没有什么专一性而被忽视，后来发现部分酸水解还是有一定的专一性。在稀酸的条件下，也即在高浓度胍的甲酸中
（pH2.5），可裂解-Asp-Pro-间的肽键，产率高达80-90％。在浓酸条件下，含羟基氨基酸氨基端肽键容易断裂。但是终究部分酸水解的专一性差，副反应多，此法比较难掌握。
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三、肽链的分离提纯
肽链经部分裂解得到肽片段必须分离提纯，才能进一步测定其氨基酸顺序。
喷淋洗眼器先采用凝胶过滤，得到不同相对分子质量的肽片段组分，同时也脱去了样品中的盐类。然后，肽片段组分可用离子交换层析进一步提纯，也可应用双相高压纸电泳和层析相结合的方法，HPLC或FPLC具有更高的分辨率。
