一、 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜
，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析
。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 二、 试剂及仪器 1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等 2. 硫酸铵(NH4)2SO4 3. 饱和硫酸铵溶液4. 蒸馏水 5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 ) 6. 透析袋 7. 超速离心机 8. pH 计 9. 磁力搅拌器 擦鞋巾配方
Bgain三， 操作步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液 1.将 767g (NH4)2SO4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液(SAS)（ 4.1 mol/L, 25 ° C ）.
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（二）沉淀 1.样品（如腹水） 20 000 ′ g 离心 30 min ，除去细胞碎片； 2.保留上清液并测量体积； 3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为 1 ： 1 。4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 ° C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析 1.蛋白质溶液 10 000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ）。弃上清保留沉淀； 2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 ° C ），每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 四，应用提示
（一） 先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1.边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中，使浓度为 0.5:1 (v/v) ； 2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时 或过夜（ 4 °
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C ）；3.3000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效
（二） 为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。
纯化产物 的鉴定：
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（1）效价测定 : 采 用间接ELISA法 (3 mg / L抗原包被 , 1∶ 1 000 开始倍比稀释)检测抗体的效价 。
（2）Ig亚类 ( 型 ) 的鉴定 : 用小鼠 Ig亚类检测试剂盒鉴定杂交瘤细胞培养上 清中 mA b 的 类和亚类 。
（3）westernblot 鉴定抗体特 异性 : 取 5 μ g 人 IgG 经 SDS-PAGE后 , 转移至硝酸纤维素膜上 , 用 5 0 g/L 脱脂奶粉室温封闭1 h。依次滴加封闭液稀释的 5 mg/L纯化 抗体 (室温孵
育2 h或 4℃过夜 ,洗膜3次)及1∶1 000 稀释的 HRP 标记的羊抗鼠 Ig G(室温孵育1 h, 洗膜 3次)。最后加 DAB显 ,观察结果 。
（4） 相对亲和力测定 : 以 IgG与抗体结合曲线上部趋于平坦的一段(平台期)的吸光度值(A)为100%, 查出 A值为 50%点的抗体的浓度,以此来表示各株的相对亲和力 。
1.为什么需要用透析袋透析？用透析袋透析以彻底除去硫酸氨；
修整机2.纯度如何简单鉴定？用BSA试剂盒测定抗体浓度，也可以用考马斯法、紫外法、双缩脲法等测定。
3.为什么要进行活性鉴定？进行活性测定可以判定抗体效价，初步确定抗体的稀释倍数，能便于到最好的稀释倍数，避免背景深等不良影响。
5.纯化产物如何保存？注意事项？
纯化产物可以冻干保存、过滤除菌后加叠氮化钠4℃保存、或加50％甘油-20℃保存，也可直接置于液氮中保存。
