明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2（基质金属蛋白酶-2）和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染，再脱，在蓝背景下可出现白条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。 复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。
试剂的配制
(1)配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）
A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）
10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 10ml（包括）
ddH2O 4.5ml
30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺） 2ml
1.5mol/l Tris（PH 8.8） 2.5ml
10% SDS 100ul
10%过硫酸铵（APS） 100ul
TEMED 8ul
1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解） 0.5ml
B.浓缩胶的配制
浓缩胶 6ml
ddH2O 4.5ml
30%储备胶 0.75ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml
10% SDS 60ul
10%过硫酸铵 60ul
TEMED 6ul
0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）
(3)4 ×上样缓冲液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS（PH7.2） 8ml
16%甘油 3.2 ml
溴酚蓝 0.024g
ddH2O 2.4ml
(4)洗脱液：
2.5% Triton X-100
50mmol/L Tris-HCl（6.057g/L）
5mmol/L CaCl2（0.5549g/L）
pH7.6
40分钟两次，中间换液
(5)漂洗液： 50mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）
(6)孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）
(7)染液：0.05% Coomassic 亮蓝 R-250，30%甲醇，10%乙酸（染3小时）
(8)脱液A、B、C：甲醇浓度分别为gprs水表30%,20%,10%,乙酸浓度分别为10%,10%,5%（分别30min,1h,2h脱）
实验步骤
(1)取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
(2)次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
(3)根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。（不要用用力吹打，防止出现过多气泡）
(4)配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4褐变度℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。
(5)电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱织造方法2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。
(6)孵育结束后经染液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸)染3h,及脱液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10% ,乙酸浓度分别为10%、10%、5%)分别脱0.5、光端机箱1、2h后，显示出MMP-2(72KD)和MMP-9(92KD)为位于蓝背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。
注意事项：
(1)制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡 。
(2)明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。
(3)用大梳子
(4)孵育液的PH最好在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。
(5)孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。
(6)明胶要4度保存，配好后1周内使用
蒸汽减温减压装置
凝胶制备：
(1)玻璃板对齐后放入夹中，垂直卡紧，加满水检漏。
(2)配10%分离胶，APS和TEMED作用为促凝，最后灌胶前加。若板不漏水，则将水倒出，并用吸水纸洗净后灌胶，灌至大约3/4处，上面加满水压平。
(3)配浓缩胶，同样地，APS和TEMED最后加，分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝，同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线，说明胶已凝固。
(4)将上面的水倒去，吸水纸洗净，灌入浓缩胶，灌满，注意一定不要有气泡，然后将梳子插入，注意保持水平，约30min后凝固可用。
(5)拔梳子在电泳缓冲液中拔，加样孔用小针筒冲洗干净再上样，注意上样时勿使样品逸至邻孔，样品混匀时要轻，不要产生气泡，否则加样时易导致逸出而使结果不准确。
【PS 某种酶蛋白活性分析】
（1）用于测定蛋白酶活性。
数据加密网关（2）三个主要内容：生物轭合物；试剂盒；分析方法。
（3）生物轭合物包含：连接物；荧光剂；猝灭剂。
（4）连接物包含能识别所检测的酶并且与之相互作用的部分；荧光剂包含多种荧光物质，并与所述连接物的第一位置轭合；猝灭剂与所述连接物的第二位置轭合。连接物上能识别蛋白酶并与之相互作用的部分位于第一和第二位置之间。多种荧光物质相互结合，使得猝灭剂能放大荧光剂的超猝灭。
