RNA提取常见问题、原因分析及其对策
一、RNA提取的通用方法
异硫氰酸胍/苯酚法（即TriZol类试剂）
细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 步骤:
材料准备：尽量新鲜。
裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。
清洁在线 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。
纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。
洗涤：70％乙醇。
沉淀：异丙醇、无水乙醇。
乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。
此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。
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二、影响RNA提取的因素
由于RNA样品易受环境因素特别是RNA酶的影响而降解，提取高质量的RNA样品在生命科研中具有相当的挑战性。RNA提取对样品的新鲜性要求非常高，获取样品后最好立即提取RNA，若无条件立即实验，应于-80℃或液氮中保存样品，提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞，以防RNA降解。 1.材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料，如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，
请分成多份保存，液氮长期保存，－70℃短期保存。
2.样品破碎及裂解：
根据不同材料选择不同的处理方法：
培养细胞：通常可直接加裂解液裂解
酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁97ga
动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻，样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量
四技术 3.纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。
RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策
一、常见问题
1.RNA 的降解 2.OD260 /OD280 比值偏低3.电泳带型异常4.下游实验效果不佳
RNA的降解
（1）新鲜细胞或组织的RNA降解
RNA降解：1.裂解液的质量2.外源RNase的污染3.裂解液的用量不足
4.组织裂解不充分5.另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。
（2）冷冻样品的RNA降解
1.样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；
2.先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；
3.样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。污水止回阀
OD260 /OD280 比值偏低
（1）蛋白质污染；（2）苯酚残留；（3）抽提试剂残留；（4）设备限制。
电泳带型异常
（1）非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。
（2）变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；
（3）甲醛的质量不高
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下游实验效果不佳
（1）RNA 降解 ；（2）抽提试剂的残留 ；（3） 样品中杂质的残留 ；（4）DNA 污染 。
