从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。
#22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。抗uchl3抗体购自ProteinTech公司 (12384 - 1 - ap)。抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。反
γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572)
从微孔被购买。Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和
anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体
购买的σ。反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。
CRISPR / Cas9敲除
(sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAAT
镁合金微弧氧化加工CCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCC
ACCTCGG-3′)。gRNA序列被克隆到载体中。
LentiCRISPR-V2-puro。细胞被慢病毒感染
sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择，和单一的克隆是通过连续稀释和放大。通过免疫印迹鉴定克隆
抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。
构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列
被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。总之，在LB培养基培养细菌在37°C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。然后细胞连续培养15 h在18°C添加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。细胞
然后用超声波提取和裂解。细胞溶解产物
用16000g离心30min，得到的上清液与他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化
分别是GST和GST- uchl3蛋白。
体外GST-UCHL3拉试验,50µg重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5% BSA 在4°C 2 h其次是孵化与50µg His-UCHL3额外2 h在4°C。然后用不同盐浓度的NETN缓冲液冲洗5次。结合蛋白被筛选了1×SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95°C。用单克隆抗his 抗体检测His-RAD51，用Coomassie blue染GST-UCHL3
体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验
对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除U2OS细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解μL 62.5
毫米Tris-HCl(pH值6.8),2% SDS、10%甘油,20毫米NEM,1毫米碘乙酰胺；煮15分钟；用含有蛋白酶抑制剂的NETN缓冲液、20mm NEM和1mm碘乙酰胺进行测定10次；然后离心分离细胞碎片。细胞提取物的免疫沉淀与指示抗体和涂抹抗ub抗体。为了制备大量泛素化蛋白作
为体外脱泛素实验的底物，HEK293T细胞与Myc-RAD51和His-Ubexpression载体一起转染。在变性条件下，用他的珠子从细胞提取物中纯化泛素蛋白。接下来，用Ub-RAD51蛋白从细胞提取物中纯化抗myc -琼脂糖颗粒在裂解缓冲液(50mm Tris-HCl pH)中7.8, 137毫米NaCl, 10毫米NaF, 1毫米EDTA, 1% Triton X-1000.2%萨科齐，1mm DTT, 10%甘油，新鲜蛋白酶抑制剂)。重组GST-UCHL3和UCHL3 CA在BL21细胞中表达，按照标准方案纯化。deubiquitination测定体外,ubiquitinated蛋白质是孵化与重组UCHL3 eubiquitination 缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值8.0,50 mM氯化钠,EDTA 1毫米,10毫米德勤,5%甘油)4 h 第一中文
30°C。
芯片
通过转染I-SceI表达质粒，在U2OS DR-GFP细胞中诱导单个DSB。转染后24小时，细胞在室温下用1%甲醛固定10分钟，将蛋白质与DNA交联。加入甘氨酸(0.125 M) 5分钟，停止交联。细胞被收获，颗粒在细胞裂解缓冲resuspended(5毫米管道(KOH)在pH值8.0,85毫米
氯化钾,0.5% NP-40)亮抑酶肽1μg /毫升,1μg /毫升抑肽酶,1冷凝器设计
空调温度控制器毫米PMSF。核在2000克的离心作用下，5分钟内被离心分离，然后在核溶解缓冲中重新悬浮（50 m
M Tris在pH.1，10毫米EDTA，1%SDS，1 g/mL，1 g/mL aprotinin，1毫米PMSF），并将染质切成平均大小为0.6 kb的染质。用三文鱼精子DNA/蛋白-琼脂糖浆液预先清除裂解物。每个上清液的10%作为输入控制，并通过交联反转步骤进行处理。其余的上层清
液与5μg孵化表示抗体在一夜之间在4°C。珠被洗了四次：一次在高盐缓冲(50毫米Tris-HCl
pH值8.0,500毫米氯化钠,0.1% SDS、脱氧胆酸盐0.5%,1% NP-40,1毫米EDTA)，在氯化锂缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值8.0,250毫米氯化锂,NP-40 1%,0.5%脱氧胆酸盐,1毫米EDTA)，和两次TE缓冲(10毫米Tris-HCl pH值8.0,1毫米EDTA,pH值8.0)。然后在洗脱缓冲液(1% SDS, 0.1 M NaHCO3)中重新悬浮，在室温下旋转20分钟。洗脱样品孵育0.2 M
氯化钠一夜之间在65°C到反向交联。样本
孵化与核糖核酸酶为30分钟37°C其次是蛋白酶K 1 h在37°C。然后使用PCR清理试剂盒对DNA进行纯化，并用于定量PCR分析。芯片的PCR引物,∼220个碱基对远离I-SceI削减网站如下：向前,5′-GAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3′；和反向5′-CCGTAGGTCAGGGTGGTCAC-3′。
HR分析
我们使用来自Maria Jasin博士(纪念斯隆凯特琳癌症中心)的U2OS DR-GFP细胞，通过CRISPR系统产
生控制或UCHL3敲除U2OS DR-GFP细胞系。将ISceI表达载体(pCBA-I-SceI)转染到细胞中。在I-SceI转染后2 d采集细胞，并使用流式细胞术检测I-SceI消化诱导的重组。采用pEGFP-C1平行转染法对转染效率进行归一化处理。
统计数据
对于细胞存活试验和HR试验，数据提出了均值±SEM的三个独立的实验。对于焦点形成分析，提出了数据作为三个独立的均值±SEM。每项实验计数超过200个细胞。
统计分析采用t检验、方差分析或log-rank检验。图中有1个星号表示P < 0.05, 2个星号表示P < 0.01。地址标准化
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