紫花针茅研究
化[5]。信号转导与转录激活因子家族（STAT）已发现7个成员，STAT3是该家族的研究热点，且敲除该基因可以使胚胎死亡，说明该基因是不可或缺的。磷酸化修饰是调控STAT3活性的主要方式，Tyr705、Ser727是磷酸化的关键氨基酸位点[6]。此外，STAT3的Lys685可以在组蛋白乙酰转移酶的修饰下发生可逆乙酰化[7-8]。
在真核细胞中，蛋白质的泛素化和磷酸化是最常见的翻译后修饰。细胞外信号严格调控着蛋白的泛素化，在很多情况下，这种调控依赖于蛋白质的磷酸化[9]。磷酸化通过修饰泛素化的底物，或者修饰泛素化机器的某个组分来影响泛素化。此外，泛素化对于磷酸化和信号分子的传递也有一定的作用。本研究通过研究STAT3蛋白是否会发生泛素化，发生哪种类型的泛素化，并以此解释泛素化与STAT3活性之间的关系。
1材料与方法
1.1试验材料
单向器Taq DNA polymerase，购自北京鼎国生物技术有限公司；T4 DNA连接酶、pMD-19-T simple Vector、D NA酶Ⅰ、Oligo （dT）18、Random promers、PrimeScript RT reagent Kit
和SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）Kit，购自TaKaRa公司；dNTPs，购自北京盛旭百川生物科技有限公司；DNA分子量标准品，购自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；蛋白质非预染分子量标准marker及预染分子量标准marker，购自Fermentas公司；Tween-20，购自Amresco公司；质粒小量提取试剂盒、EASYspin plus RNA提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；质粒大量提取试剂盒、Enhanced chemiluminescence（ECL）kit，购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA凝胶回收纯化试剂盒，购自Zymo 公司；无内毒素大量质粒提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；Anti-c-HA单克隆抗体、protein A/G 碱性水机plus-agarose（SC-2003），购自Santa Cruz生物公司；Anti-FLAG M2（F1804）单克隆抗体、PI染料，购自Sigma 公司；HRP-标记山羊抗小鼠和山羊抗兔抗?w，购自北京鼎国生物技术有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂，购自Invitrogen公司；蛋白酶抑制剂，购自亚太恒信生物科技（北京）有限公司；Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶，购自NEB公司；HA-ub、HA-KO、HA-K48、HA-K63等载体质粒均由唐军教授馈赠；所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2Human STAT3基因的克隆
根据NCBI STAT3（ID：47080104）基因序列设计引物，上游引物为5′-ATGGCCCAATGGAATCAGC-
3′，下游引物为
5′-TCACATGGGGGAGGTAGCGC-3′。建立50 μL PCR反应体系：5 μL 10×PCR Buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs，20 pmol/L 上下游引物各1 μL，4 μL cDNA，1 μL Taq plus DNA polymerase，用ddH2O补至50 μL。按以下程序进行PCR反应：94 ℃预变性5 min，进入循环：94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2.5 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，目的基因大小为 2 313 bp。
1.3宿主细胞蛋白STAT3重组质粒的构建
针对pRK5-flag质粒多克隆位点设计引物并引入SalⅠ和HindⅢ酶切位点，以测序正确的pMD-19-T-STAT3质粒为模板进行PCR；1.5%琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物后，进行SalⅠ和HindⅢ双酶切，同时对pRK5-flag质粒进行SalⅠ 和HindⅢ双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物；将PCR酶切产物和pRK5-flag酶切产物按6 ∶1摩尔比混合，并加入等量的（5 μL）Solution I（酶溶液），过夜连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定正确后，由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序正确克隆保存菌种，并提取质粒待用。
pRK5-flag-STAT3：上下游引物分别引入SalⅠ和HindⅢ酶切位点，上游引物为
5′-ACGCGTCGACATGGCCCAATGGAATCAGCTAC-3′，下游引物为理疗环
紧定衬套
5′-CCCAAGCTTTCACATGGGGGAGGTAGCGCAC-3′。
窑炉技术1.4STAT3泛素化的检测
6孔板分别按下述方式转染HEK293T细胞，其中
pRK5-flag空载体组作为阴性对照：（1）pRK5-flag+HA-ub；（2）pRK5-flag-STAT3+HA-ub；（3）pRK5-flag+HA-KO；（4）pRK5-flag-STAT3+HA-K48；（5）pRK5-flag-STAT3+HA-K63。
