马雯;吕微风;郑磊
【摘 要】MicroRNA (miRNA)是一种内源性的单链非编码RNA,参与细胞的增殖凋亡分化和代谢等重要生理过程.近年来发现循环miRNA能够耐受RNA酶消化、强酸强碱、煮沸等极端条件,是一种潜在的疾病标志物.因此,miRNA的检测对疾病的早期诊断具有重要的生物学意义.电化学生物传感器由于其简易、便携、灵敏、反应快速以及价格低廉等特点而被研究者广泛应用于miRNA检测的研究.本文综述了miRNA的电化学传感器的研究进展,评述了各类方法的优缺点,并对miRNA电化学检测的发展趋势进行了展望.
【期刊名称】《分子诊断与杂志》
【年(卷),期】2015(007)002
【总页数】虹膜识别芯片8页(P114-121)
【关键词】microRNA(miRNA);生物标志物;电化学生物传感器
【作 者】马雯;吕微风;郑磊飓风数据
【作者单位】南方医科大学南方医院检验科,广东,广州510515;南方医科大学南方医院检验科,广东,广州510515;南方医科大学南方医院检验科,广东,广州510515
【正文语种】中 文
电化学生物传感器是一门有关化学、物理学、生物学以及电子学等领域的交叉学科，它具有灵敏度高、检测速度快、操作简便、成本低、可进行连续动态监测等优点。其工作原理是：当待测物质经扩散作用进入敏感元件后，与敏感元件生物体成分（酶、激素、抗原、抗体、组织、细胞、细胞器等）特异性结合，发生生物化学反应，所产生的信息通过相应的信号转换元件（固体电极、气敏电极、离子选择性电极等）以转换为定量处理的电信号，再经电子测量仪的放大、处理和输出，即可达到分析检测的目的。 1993年，人类首次在秀丽新杆状线虫中发现
lin-4，随后又有研究者陆续发现m iRNA广泛地存在哺乳动物、果蝇和植物等生物中［1］。目前已有研究证明，miRNA参与生命过程中的一系列重要活动，包括生长发育、
免疫防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、肿瘤发展、心脏发生等［2］。虽然目前对已发现的m iRNA分子功能和作用靶基因的研究还处于初步阶段，但是从miRNA在不同组织和疾病中的表达谱中分析发现，某些miRNA在特定疾病表达谱中具有明显的组织特异性［3－5］。以上研究均表明，m iRNA在疾病发生发展过程中存在非常重要的作用。
2008年，Law rie［6］等在人类血清中首次检测到miRNA，并发现弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血清m iR-21表达上调。从此，不少学者将研究方向转到血清和血浆中来。最近几年，相继在乳腺癌、白血病、心肌梗死、肝炎［7－10］等疾病患者中发现循环m iRNA表达量与正常人相比具有明显差异，且在某些疾病中还可用于诊断、分期和预后检测。另还有报道证明循环m iRNA可耐受一些苛刻的环境，如多次反复冻融，强酸强碱、长期保存甚至煮沸［11］。这些研究均证实了m iRNA在血中十分稳定。目前关于血清和血浆样品中m iRNA稳定性的机制虽然还没有定论，但是已发现循环miRNA可与一些蛋白质结合形成复合物，如Argonaute2（Ago2）、核仁磷酸蛋白（nucleophosm in，NPM）、低密度脂蛋白（low densith lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL），也可以包含于微囊泡（microvesicle）、外泌体（exosome）、凋亡小体（apoptosis body）
等，这些特性均可为其稳定性提供基础［12－13］。
循环miRNA的发现是临床分子生物学革命性的突破，其高度的特异性和稳定性决定了其作为一种新的疾病生物标志物的巨大潜力。因此，到一种适合的检测方法显得尤为重要。
1.1 miRNA检测的难点
（1）m iRNA成熟体只有20多个bp，降解温度低，故miRNA提取后保存要求较高。（2）同一家族miRNA碱基组成区别不大，有的甚至只有1个碱基的区别。（3）m iRNA合成过程中，由于存在pri-m iRNA、pre-m iRNA、m iRNA成熟体，在检测miRNA成熟体时必须排除其他2种形式的miRNA干扰。（4）miRNA在人体内含量一般较低，对检测方法的灵敏度要求相对较高［14］。
1.2 目前常用的检测方法
目前常用的m iRNA检测技术包括Northern印迹杂交（northern blotting）、微阵列芯片（m icroarray）、实时荧光定量PCR（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）等。Northern blotting一般先用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出特定m iRNA，然后利用杂交原理与
印迹膜上修饰的标记寡核苷酸探针杂交，通过检测标记进而分析靶m iRNA的含量。但是此方法由于其样品需求量大、灵敏度低、不适合高通量分析等特点而并不适用于临床［15］。微阵列芯片又称基因芯片，其可对m iRNA实行高通量、多组分检测。可这种方法相对费用较高，且存在背景及其他信号干扰导致重复性差，一般只用于初筛，所得结果最终还需实时荧光定量PCR验证［16］。目前临床和科研中最常使用实时荧光定量PCR来进行m iRNA的检测，此方法将逆转录后的cDNA产物进行特异性的扩增，从而大大提高检测能力。但是这种技术对实验条件以及实验操作者要求较高，且检测费用相对较贵。此外，还有研究者利用表面增强拉曼、生物发光、原位杂交、纳米孔技术来检测m iRNA，但是这些方法一般需要特殊仪器，不利于临床大规模开展。若发展一种适用于临床实验室的m iRNA检测方法，应满足以下几点要求：（1）应具备敏感的检测能力，能定量敏感检测出不同临床标本甚至极低丰度的m iRNA；（2）应具备良好的特异性，能区分出高度同源的m iRNA；（3）检测过程相对简便，无需昂贵的设备和试剂。电化学生物传感器由于其简易、便携、灵敏、反应快速以及价格低廉等特点而被研究者广泛应用于m iRNA检测的研究。现就m iRNA电化学检测新技术作一综述。 食用油抗氧化剂一个典型的m iRNA生物传感器设计原理是将识别元件固定在载体表面，加入可指示杂交信
号的电活性物质，通过检测电极在待测溶液中电化学信号的变化，以确定靶m iRNA的浓度。特异性和敏感性是评价m iRNA生物传感器的2个至关重要的因素。特异性主要由识别元件（一般为捕获探针）来决定，敏感性则主要由信号放大技术决定。
2.1 捕获探针设计
所有的miRNA电化学传感器检测方法均存在1个杂交的过程，因此捕获探针的设计显得尤为重要。由于m iRNA的序列较短，所以捕获探针在设计上难度较大。目前常用的是线性寡聚DNA探针、具有茎环结构的分子信标探针、DNA纳米结构的探针。
2.1.1 普通线型探针
一维线型探针合成简单，线性单链DNA探针分子作为识别元件非特异结合较多，配对碱基间结合力弱，无法鉴别单个碱基错配，检测特异性及灵敏度不高［17］。但是又有文献［18］报道可以通过提高杂交温度来消除碱基错配的影响。在37℃时，线性探针无法消除错配的影响，但当杂交温度达到65℃时，单碱基错配的电流信号接近背景值［19］。
2.1.2 分子信标探针
自控温伴热带
芯片散热片分子信标探针是一种可在核酸5′和3′端自身形成的具有茎环状结构的寡核苷酸探针，其环状部分与目标序列互补，一般为15～30个碱基。其茎干区的碱基数一般为环状区的一半，过长，灵敏度下降；过短，则稳定性下降。由于分子信标杂交前后环状区与靶分子的双链结构之间存在着热力学平衡关系，它的杂交特异性明显高于常见的线状探针，是目前应用最广的捕获探针。
2.1.3 DNA纳米结构探针
传统的DNA探针通常为一维（单链探针）或二维（茎环状探针）结构，传感界面在制备过程中均一性极难得到有效的控制，从而影响了实际样品检测的重复性和稳定性。三维DNA探针因其高结构稳定性和刚性的特点，可以有效提高DNA探针表面分布排列的均一性，精确调控探针之间的距离，因而显著提高了生物检测的灵敏度和特异性，这一研究结果显示了DNA纳米技术作为新型生物传感平台的巨大潜力［20］。将DNA三维纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面，使目标m iRNA与工作电极表面DNA三维纳米结构探针杂交，随后加入氧化还原酶和相应的底物使用电化学装置进行电化学检测（图1）。该方法检测限低至10 aM，从而解决了现有技术需要大量检测样品的难点［21］。另外，该检测方
法的特异选择性强，能够很好区分同族的m iRNA的碱基错配，与传统探针相比，本方法稳定性更高。
2.1.4 其他
识别元件的取代基类型决定了其与靶物质的结合亲和力及稳定性。目前应用于传感器识别元件的核酸寡聚体除了传统的DNA、RNA之外，还有RNA的核酸模拟物（locked nucleic acid，LNA）及DNA的核酸模拟物肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）。锁核酸（LNA）［22］是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O、4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。与其他寡核苷酸相比，LNA有如下优势［23］：（1）和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性；（2）抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；（3）LNA-DNA杂交物能激活RNaseH；（4）水溶性好，自由穿入细胞膜，易被机体吸收；（5）体内无毒性作用。基于以上这些优点，大量基于LNA探针的m iRNA检测方法被大量开发。肽核酸（PNA）是一种人工合成的具有类多肽骨
架的DNA类似物，其有如下特点：（1）骨架呈电中性，与靶序列杂交时不受静电排斥作用的影响；（2）杂交活性几乎不受介质盐浓度的影响；（3）PNA／RNA杂交比DNA／RNA杂交更易受碱基错配影响；（4）体内无毒性作用［24］。目前已有研究将PNA作为检测探针与氧化石墨烯结合成功实现在胞内同时检测多种m iRNA，并论证了PNA用于m iRNA检测的优越性［25］（图2）。
2.2 信号放大技术
由于m iRNA在体内含量极少且本身序列较短，产生的信号很难与背景信号进行区分，所以需要使用信号放大技术将信号进行放大，使检测信号与背景信号很好的区分开来。目前，电化学传感器常用的信号放大技术有纳米材料放大技术、酶催化信号放大、电活性物质放大技术、鸟嘌呤氧化放大技术等。
