一、实验原理 1、通过细胞素C的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤； 2、掌握制备细胞素C的操作技术及其含量的测定方法。 二、实验原理： 细胞素C的特点与实验原理 分子量 | 12000～13000，蛋白质部分含104个氨基酸残基 | 可溶性 | 易溶于水和酸性溶液，可在酸性水中提取 | 形态 | 氧化型（深红）、还原型（桃红），氧化型较稳定 | 稳定性 | 对热、酸、碱都较稳定，三和乙酸可使其失活 | 光吸收 | 氧化型：408nm、530nm；还原型：415nm、520nm、550nm，光吸收法测其含量 | 来源 | 心肌组织、酵母 | | |
三、实验器材、材料及试剂： 1、器材：捣碎机、离心机、磁力搅拌器、可见分光光度计、玻璃层析柱（2.5cm×30cm）、透析袋、纱布、广泛PH试纸、精密PH试纸、烧杯（2000、1000、500mL）、量筒、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒等； 2、材料：（1）新鲜猪心、（2）人造沸石（60～80目）、（3）0.25mol/L NaOH和1mol/L NaCl混合液、（4）0.2% NaCl，12%BaCl2，20%TCA，2mol/L H2SO4、（5）0.06mol/L磷酸氢二钠、0.4mol/L氯化钠、（6）1%BaCl2 三、实验步骤： 1、细胞素C的制备： 操作简要 | 详细操作 | 原理目的 | （1）提取 | 取50g心肌肉糜放入500mL烧杯中，加100mL水，磁力搅拌器搅拌，2mol/L H2SO4调PH到4.0（溶液暗紫），室温搅拌2小时。用1mol/L NH4OH调PH至6.0，停止搅拌。用四层纱布挤压过滤，取滤液，滤渣称重，于冰箱保存 | 在酸性条件下溶解细胞素C | （2）中和 | 用1mol/L NH4OH 调PH到7.2，静置10min，过滤，滤液通过人造沸石柱进行吸附 | 析出等电点在7.2的溶解度小的蛋白 | （3）吸附与洗脱 | 用25%硫酸铵洗脱 | 将细胞素C与杂蛋白分开 | 人造沸石预处理 | 取60g，放入500mL烧杯中，加水搅拌，用倾泻法除去12秒内不沉的过细颗粒，重复6次 | 使沸石颗粒均匀 | 装柱 | 玻璃柱(2.5×30cm)，柱下端连接一乳胶管，用夹子夹住，柱中加入蒸馏水至2／3体积，保持柱垂直，然后将已处理好的人造沸石带水装填人柱，注意一次装完 | 使沸石能够均匀地装到柱中，避免柱内出现气泡 | 应用系统集成上样 | 打开夹子，流出液的速度为1.0ml／分钟放水(柱内沸石面上应保留一薄层水)，将提取液装入下口瓶，通过人造沸石柱进行吸附。柱内人造沸石由白变为红，流出液应为黄或微红 | 使沸石能够吸附细胞素C | 洗脱 | 吸附完毕，往柱中缓慢加入蒸馏水，再100m1 0.2％NaCl，再用蒸馏水洗至水清，流速控制在3mL/min，用25％硫酸铵溶液洗脱，流速大约2ml/分钟，收集含有细胞素C的红洗脱液，当洗脱液红开始消失时，即洗脱完毕 | 先把柱中的杂质洗脱，去除杂志，然后弱酸性环境下把细胞素C洗脱 | （4）盐析 | 按45%硫酸铵浓度计算洗脱液中需加入的硫酸铵的量，称固体硫酸铵，研成粉,小量多次加入，边加边搅拌，静置30分钟，3000r/min离心10min，收集上清，量体积 | 进一步提纯细胞素C | （5）三氯醋酸沉淀 | 边加20％三氯醋酸边搅拌，细胞素C立即沉淀出来（可逆变性)，立即于3000转／分钟离心15分钟，收集沉淀。加入少许蒸馏水，用玻棒搅拌，使沉淀溶解 | 在可逆的情况下沉淀细胞素C，进一步对其纯化 | （6）透析 | 将细胞素C装入透析袋，用2mL蒸馏水洗涤离心管，一并转入透析袋，在500m1烧杯，电磁搅拌器搅拌，15分钟换水—次，换水3～4次后；检查透析外液SO42-是否已被除净（方法：取2m1 BaCl2溶液于试管中，滴加2至3滴透析外液至试管中，若出现白沉淀，表示SO42-未除净，反之，说明透析完全）将透析液过滤，即得细胞素C制品 | 分离和浓缩细胞素C | | | |
2.细胞素C含量的测定： 根据还原型细胞素C水溶液在波长520nm处有最大光吸收这一特性，作出细胞素C浓度和光吸收值标准曲线，然后根据所测定的光吸收值，由标准曲线的斜率来求得所测样品的含量。具体操作如下： (1)标准曲线的绘制 配制细胞素C标准母液（3.24mg/mL）。按下表配制标准样品的浓度梯度，再在各管中加入3mL的水，混匀，以0号管做空白对照，在520nm波长处测得各管的光吸收值（A520nm），如图： 管号 | 雷米迪维0 | 思情乐园 1 | 2共享空调 | 3 | 4 | 5 | CytC母液 （3.24mg/mL）(mL) | 0 | 0.05 | 0.10 | 0.20 | 0.30 | 0.40平行流冷凝器 | 蒸馏水（mL） | 1.00 | 0.95 | 0.90 | 0.80 | 0.70 | 0.60 | CytC浓度（mg/mL） | 0 | 0.162 | 0.324 | 0.648 | 0.972 | 1.296 | 光吸收值（A520nm） | 0.000 | 0.025 | 0.063 | 0.101 | 0.172 | 0.212 | | | | | | | |
（2）样品测定 取纯化后的细胞素C液1mL加水3mL，混匀，测A520nm。如果光吸收值不在标准曲线范围内（0～0.30），应用水稀释适当倍数后，重复上步 的操作，然后换算。 五、结果计算： 实验中测得的细胞素C的光吸收值为： A520nm=0.266 按照老师的计算公式(y=0.1675x)： 样品浓度=1.588mg/mL 我得到的吸光度与浓度换算公式(y=0.166x+0.0014)： 样品浓度=1.594mg/mL 原因：可能是所用软件运用不同的算法造成的误差。 细胞素C的含量=细胞素C的浓度×稀释倍数×终体积 =0.266×1×5.40=1.44mg 六、思考题: 1、制备细胞素C通常选取什么动物组织？为什么？ 答：采取动物的心脏或着酵母；因为细胞素C是呼吸链中极重要的电子载体，主要存在于线粒体中，动物的心脏需氧量较大，因此细胞素C含量也较大。 2、本实验采用的酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞素及含量测定，各是根据什么原理? 答：酸溶液提取：细胞素C易溶于水和酸性溶液； 人造沸石吸附：物理吸附，沸石的多孔结构能够吸附溶解的细胞素C； 硫酸铵洗脱：（未有明确答案，待询问老师） 三沉淀：低浓度的三可使细胞素C产生可逆变性沉淀，通过离心可将其分离，加入清水后又可复性。 3、试以细胞素C的制备为例，总结蛋白质制备的步骤和方法。 答：步骤：从组织中初步提取→分离纯化→检测 提取：组织研磨、细胞破碎等； 分离纯化：层析、过滤、离心、洗脱、沉淀等； 激光夜视仪 检测：吸光光度法、电泳。 4、在本次实验中如何确定称取一定量的沸石上柱？ 答：根据玻璃柱的直径大小以及2/3长度，计算出所需沸石的体积，再根据沸石的密度，即可算出所需沸石的重量，用天平称取即可。 六、实验注意事项及遇到的问题 （1）注意事项： 1）提取、中和步骤要注意调节PH。吸附、洗脱步骤应严格控制流速； 2）盐析时，硫酸铵应多次少量加入，边加边搅拌； 3）逐滴加入硫酸铵，摇匀，尽快离心，长时间会导致细胞素C永久变性。 （2）问题： 1）在调节PH时很难调节到所需PH，在试验中曾经加入大量酸后没有见精确PH试纸显示相应的PH，用普通PH试纸则显示过酸，当加入碱后，也没有显示出相应的PH，在本次实验中，我们组调节的PH没有达到预期的效果，没有精确到要求，且导致肉糜的颜较黯淡。 | 