高效液相谱法操作规程与注意事项
1.程序
1.1.仪器及性能要求：
所用的仪器为高效液相谱仪，由泵系统，进样系统，谱柱，检测器和谱数据处理系统组成。 1.1.1.泵系统：HPLC泵系统通过高压力管和设备从溶剂瓶中吸取计量的流动相到
柱子中。现行的泵系统有一元或多元计算机控制的计量泵组成，这些泵可以
按照梯度洗脱的要求改变流动相的比例或者是按等度洗脱的要求混合流动
相。
1.1.
2.进样系统：化合物被溶解在流动相或合适的溶剂中，可以通过手动进样器或
定量环，或自动进样器转移到流动相中。自动进样器由可存放进样瓶的卡盘
组成，进样瓶的顶部有一个可以刺入的隔膜，进样针通过这个隔膜将样品转
移到一个定量环中然后输送到谱系统中。
1.1.3.谱柱：最常用的谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相谱系统使用非极性
填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型
的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅胶和氨基键合硅胶）也有使用。正相谱系
统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换谱系统使用离子交
换填充剂量；分子排阻谱系统凝胶或系统高分子多孔微球等；对映异构体
的分离通常使用手性柱。除另有规定外，柱温为室温。
1.1.4.检测器：常用的检测器包括紫外分光检测器，示差折光检测器，二极管阵列
检测器。固定波长检测器在单一波长下运行，典型的波长是254nm，通过低
压力的汞灯发射。可变波长的检测器包含持续的能源，例如氘灯或高压力氙
灯，通过单器或干涉过滤器产生一定波长的单光。
1.2.系统适用性试验
1.2.1.为了确定最终运行系统的有效性，应当进行系统适用性试验。整个系统可以
用以下指标来评价：信噪比、理论塔板数，分离度，重复性，拖尾因子，其
指标及计算方法应在相关分析方法中予以规定，如果没有专门的规定，按以
下方法进行计算：
信噪比：用于评价谱系统检测微量物质的能力，美国药典的计算公式：S/N=2H/h，H为峰顶到基线的距离，h为基线中噪声峰最大值与镇流器外壳
最小值的差，该段基线需取≥5倍半峰高宽的距离，如果有可能，目标
峰两侧取相等的距离（如图1）。美国药典规定：定量限测定时，信噪
比S/N≥10；检测限测定时，信噪比S/N≥2或S/N≥3。中国药典规定：
定量限测定时，信噪比S/N≥10；检测限测定时，信噪比S/N≥3。
图1噪声和谱峰，物质的信噪比
●理论塔板数：一般用于评价谱柱的柱效，美国药典的计算公式：N=16
（t R/W）2，当用电子积分时，可能通过以下公式计算：N=5.54*（t R/W h/2）2。tR为物质保留时间，W、W h/2分别为物质的峰宽和半高峰宽。中国药典中两个公式均可用，且中国药典和美国药典均规定：当测定结果存在争议时，谱柱的理论塔板数以峰宽的计算结果为准。
●分离度：用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程
度，是衡量谱系统效能的关键指标。两个相邻谱峰的分离度，美国药典的计算公式：R=2*（t R2-
t R1）/（W1+W2），当用电子积分时，可能通过以下公式计算：R=1.18*（t R2- t R1）/（W1，h/2﹢W2，h/2）。t R1为相邻两谱中前一峰的保留时间，t R2为相邻两谱中后一峰的保留时间，t R2＞t R1。W1，W2和W1，h/2和W2，h/2分别为相邻两物质的峰宽和半高峰宽（如图2）。中国药典中两个公式均可用，规定：当测定结果存在争议时，谱柱分离度以峰宽的计算结果为准。除另有规定外，待测物质谱峰与相邻谱峰之间分离度应大于1.5。
图2保留时间、峰宽和半峰宽
●重复性：为了充分验证系统的精密度，可以在样品进样之前以及穿插
在样品进样中进行标准试液的重复进样。
➢一般要求
根据USP<621>规定，对用于含量测定的标准溶液或其他标准溶液
重复进样分析，比较结果来确认精密度是否符合要求。连续进样5
次，除在方法中已明确规定外，其峰面积测量值RSD≤2.0%。如果
5针的RSD>2.0%，可连续进样6针，其峰面积测量值的RSD≤2.0%。
对于杂质检测，除非另有规定，要求相对标准偏差小于等于10.0%。
➢EP药典关于含量检测相对标准偏差所允许的最大值规定：
进样次数 3 4 5 6 B% 最大允许的相对标准偏差
2.0 0.41 0.59 0.73 0.85
2.5 0.52 0.74 0.92 1.06
3.0 0.62 0.89 1.10 1.27
●拖尾因子：描述峰的对称性，完美对称的峰托尾因子是1，拖尾越明
显其数值会增大。在某些情况下，托尾因子小于1。峰的不对称增加，
积分及精确度都会变差。美国药典中的计算公式：As=W0.05%/2f，W0.05%
为5%峰高处的峰宽，f为峰顶在5%峰高处横坐标平行线的投影点至
峰前沿与此平行线交点的距离（如图3）。中国药典中也用此公式且规
定：以峰高作定量参数时，除另有规定外，测定的T 应在0.95~1.05
之间。以峰面积作定量参数时，一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积
积分，但严重拖尾会影响基线和谱峰起止的判断和峰面积积分的准
确性，此时应在品种正文项下对拖尾因子作出规定。
图3 拖尾峰
1.2.2.可调整的谱条件
如果为了满足系统适用性要求，各个运行条件作适当的调整是必要的，但不能根本地修改方法，必须考虑各个条件的最大改变值。为了满足系统适用性要求进行谱系统的调整并不是为了弥补柱子的失效或者是系统的功能失常。多种改变可能会对系统行为有累积效果，在执行时应当详细的考虑。
●流动相的pH：缓冲溶液的pH有±0.2个单位的波动或指定范围调整，
适用于梯度分离和等度分离。
●缓冲盐的浓度：在满足pH变化的情况下，缓冲盐的浓度可有±10%的
波动。适用于梯度分离和等度分离。
●流动相组分的比例：下列的调整限度适用于流动相中的次要组分
（≦50%）。这些组分相对含量可以有±30%的波动。然而，任何组分的
绝对含量不可以超过±10%的波动。在三元混合溶液中，可以对一种次
要组分进行调整。下列给出了二元和三元混合溶液的调整。
二元混合溶液：
指定混合比例50：50---50的30%是15%，但是超过了绝对含量只有±10%
的波动。因此，流动相的比例只能在40：60-60：40内波动。
指定混合比例2：98---2的30%为0.6%，因此允许的变化比例为1.4：98.6-2.6：
97.4
三元混合溶液
指定混合比例60：35：5---对于第二种组分，35的30%为10.5%，超过了
绝对含量只有±10%波动的限度。因此第二种组分可调整的范围在
25%-45%。对于第三种组分，5的30%为1.5%。在所有的情况中，第一种
组分有足够的数量满足100%的要求。因此，混合比例50：45：5-70：25：
5或58.5-35-6.5-61.5：35：3.5。
● 可见紫外波长检测器：不允许背离方法中指定的波长。检测器厂商指
定的规程或者另外经验证的规程，用来验证检测器波长的误差在±3nm
内。
● 柱长：看粒径
● 柱内径：如果线速度保持不变是可以调整的，看流速。
● 粒径：对于等度分离来说，粒径或柱长可以修改，条件是柱长（L ）和
申智惠粒径（dp ）的比例保持不变或在规定柱长（L ）和粒径（dp ）比例的-25%
至50%内修改。另外（只要粒径的改变适用于表面多孔粒径），其他L
和dp 的组合也能用，条件是柱理论塔板数（N ）的变化在-25%至+50%
内。需要小心的是这种调整会导致更高的理论塔板数，会产生更小峰
体积，这样可能要求通过仪器泵、检测器单元体积、采样率和进样体
积来使附加柱的谱带增宽降至最小。如果个论中没有提及粒径，这比
例的计算必须利用USP 中定义的柱最大粒径的大小。对于梯度分离来
说，改变长度、柱内径和粒径是不允许的。
97ga
● 流速：当粒径改变了，流速也需要调整，因为更小的颗粒柱需要更高
的线速度来满足同样的性能（通过减少塔板高度来衡量）。流速改变由
柱内径和粒径决定：[]
）（22112212/)d (dp dc dp c F F ⨯⨯⨯= 式中：F 1、F 2——分别是初始和更改后的流速；
dc 1、dc 2——分别是初始和更改后柱内径；
dp 1、dp 2——分别是初始和更改后粒径。
在等度分离中当粒径从≥3μm 改至<3μm ，在柱效降低不超过20%的条件下， 可以增加线速
度（通过改变流速）。相似地，从<3μm 改至≥3μm 需要另 外减低线速度（流速）来避免柱效降低超过20%。在梯度分离中，改变F 、 dc 和dp 的是不允许的。
另外，流速可以调整±50%（仅等度）。
例如：可以对柱长、内径、粒径和流速的组合调整来得到相等的条件（相 同的N ），但会形成不同的压力和运行时间。以下表格列出了常用柱的一些 配置通过这些变量的调整得到相同的效果（N ）。
例如，如果在个论中指定一根柱子150mm×4.6mm，5μm在1.5ml/min条件
下操作，用一根75mm×2.1mm，2.5μm的柱子在1.5ml/min×0.4=0.6ml/min
条件下操作也可能达到一样的分离。
●进样体积：进样体积可以尽可能的调整直到精度、线性和检测限能够
满足。注意过多的进样体积能导致不可接受的谱带增宽，引起N的减
少和分离。适用于梯度分离和等度分离。
●柱温（HPLC）：调整±10℃。推荐使用柱温箱来提高控制柱温和保留时
间的重复性。适用于梯度分离和等度分离。
1.3.测定方法
1.3.1.内标法
按各品种项下的规定，精密称取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量
取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录
谱图。测量对照品和内标物质的峰面积，按下式计算校正因子
校正因子（f）=（A S/C S）/(A R/C R)
式中A S为内标物质的峰面积，A R为对照品的峰面积，C S为内标物质的浓度，
A R为对照品的浓度。
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录谱图，测量
供试品中待测组分和内标物质的峰面积，按下式计算含量
偏心轮机构
智能一体机含量（Cx）=f*Ax/(A’s/C’s)
式中，Ax为供试品峰面积，Cx为供试品的浓度，A’s为内标物质的峰面积，
C’s为内标物质的浓度，f为校正因子。
采用内标法，可避免因样品前处理或进样体积误差对测定结果的影响。
1.3.
2.外标法
按各品种项下的规定，精密称取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取
油质检测一定量，注入仪器，记录谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分
的峰面积，按下式计算含量：
C x=C R*A x/A R
C x——试样中待测成分的浓度
C R——对照品溶液中待测成分的浓度
A x ——试样中待测成分的峰面积
