杨恒;张曼玲;丁一
【摘 要】Surface enhanced Raman scattering(SERS) is an optical spectroscopy that has been widely used in biomed-ical analysis. It is capable of extremely sensitive biomolecule detection and multiplexed analysis. This perspective high-lights where SERS is been used to detect DNA,proteins,and where in vivo and in vitro analysis has been successfully u-tilized. SERS is becoming an alternative novel technique for biomolecule detection and clinical diagnostics.%随着光学技术的发展,表面增强拉曼光谱(SERS)作为一种新兴的技术被逐渐应用于生物医学领域.SERS波谱作为一种振动波谱,能够反应被测物质的内部信息,具有指纹识别特征;具备高灵敏度、高效能的特点,且能实现复合样本的同时测定;带标记的SERS技术能进一步提高SERS检测的特异性.目前SERS技术已被广泛用于体内外DNA、蛋白分子的检测,为生物分子的分析检测提供了一种崭新、高效的手段. 【期刊名称】《激光生物学报》
【年(卷),期】2017(026)005
【总页数】制备乙酸乙酯的装置8页(P385-392)
盖型螺母【关键词】表面增强拉曼光谱;DNA;综述;PCR;荧光标记
【作 者】杨恒;张曼玲;丁一
【作者单位】成都市第一人民医院口腔科,四川 成都610041;口腔疾病研究国家重点实验室,国家口腔疾病临床医学研究中心,四川大学华西口腔医院牙周科,四川 成都610041;口腔疾病研究国家重点实验室,国家口腔疾病临床医学研究中心,四川大学华西口腔医院牙周科,四川 成都610041
生活垃圾处理器【正文语种】中 文
【中图分类】O433
拉曼散射现象是光照射到原子或分子上时发生的非弹性散射现象(最早由印度物理学家Raman从实验中观察到)，即散射光中出现与入射光频率不同的光，分别出现在入射频率两侧对称的位置上，比入射光频率低的称为斯托克斯拉曼，比入射光频率高的称为反斯托克
斯拉曼。由于拉曼光谱作为一种共振光谱，反映了物质的结构信息，具有指纹特征，为研究晶体和分子的内部结构提供了一个有效的手段。1974年，Fleischmann[1]等人在粗糙的银电极体系中发现拉曼散射的增强现象，由于电极粗糙导致表面积增大，使吸附的分子数变多，从而导致拉曼信号变强，比普通拉曼信号高出106倍。表面增强拉曼散射光谱(surface-enhanced Raman scattering，SERS)与其它光谱相比具有稳定、不易淬灭、可用红光激发、对生物样品损坏小、不受生物样品自身荧光及水的干扰等特点，尤其适合于生物医学的研究。
表面增强拉曼散射的基本原理，目前比较公认的主要为化学增强原理[2]和电磁增强原理[3]两种。化学增强原理(CM)中的化学键效应来自于吸附分子与金属基底的复合、成键；另一电荷转移效应是在吸附分子与金属之间发生电子激发时产生，其机理尚不完全清楚，被认为可能是转移电荷改变了表面等离子体模式，进而改变了表面增强拉曼的强度，其在一定程度上类似于共振拉曼机理。电磁增强机理(EM)主要是指金属表面局域场的增强，是拉曼增强因子的主要贡献者。其中表面等离子共振模型作为一种电磁场增强模型，已为广大的SERS研究者所接受。简而言之，导体介质表面都有自由活动的电子，可以形象的看作电子气，电子气的集体激发称作等离子体。如果激发只局限在表面区域，就叫做表面等离子
体(SP)。当电磁波作用于等离子体时，会使等离子体发生振荡，电磁波的频率和等离子体振荡频率相同时，就会产生共振。如果金属结构大小在100 nm以内，则共振电子会被局限在局域表面，我们把这种受约束的等离子体称作局域表面等离子体(LSP)，其产生的共振叫做局域表面等离子共振(LSPR)(图1)。在外加光场作用下，金、银等贵金属表面的等离子共振效应会强烈改变表面局域电荷分布，导致局域场强显著增强，吸附在金属颗粒表面的分子受到局域电场的激发而产生拉曼散射。有研究理论认为，由电磁增强效应产生的表面增强拉曼效应可能主要来自“hot spot”[4,5]。由于贵金属(如金、银等)原子外层电子比较活跃，容易形成表面等离子共振，贵金属纳米结构表面受可见光激发时会产生大量热点，使局域电场大幅度增强，从而产生显著的SERS效应。 小学生文具盒
DNA是重要的生物大分子之一，在生命活动中起着至关重要的作用，作为遗传信息的载体，它参与遗传信息在细胞内的传递和表达，从而促进并控制代谢过程的进行。DNA检测不仅为科学研究提供重要信息，其在疾病(特别是肿瘤)的早期诊断、、预后过程中亦有着重大意义。DNA检测已被广泛应用于生物医学的各个方面，是基础医学研究和临床疾病不可或缺的检测手段之一。
金(Au)、银(Ag)粒子常用做SERS金属基底物质。纳米金、银颗粒凝胶制作方便、性质稳定，不仅可以用作免标记SERS探测的等离子活性基底，也可与标记后的分子或特定的配体(如抗体)相互反应。此外，纳米金、银颗粒可淬灭荧光干扰，因此即使采用宽波段的荧光标记物标记被测物质，拉曼光谱也不会受太大影响。SERS检测与传统荧光检测方法相比，其灵敏度和特异性更高，并且可以实现同一样本中的多个DNA检测，有望广泛应用于DNA检测当中。
总的来说，SERS检测可分为免标记和带标记检测两种方法。物质结构和实验条件严格限制了对单个碱基对、核苷酸或寡核苷酸链自身产生的SERS波谱的探测。 Papadopoulou[7,8] 等研究发现经过硫醇化(HS-)修饰后的DNA链若按一定方向倾斜或垂直吸附于金属粒子表面，在736 cm-1产生增强拉曼信号；而水平吸附于粒子表面的DNA产生的拉曼信号却很弱。而后该课题组发现在Ag胶质基底中加入一定量的MgSO4后能够促进Ag纳米颗粒的聚集从而获得DNA的拉曼光谱而不需要对DNA进行硫醇化。值得注意的是，纳米颗粒凝胶在高浓度NaCl条件下极易发生共聚，一旦发生不可逆的粒子共聚DNA将无法吸附于粒子表面也就不会产生SERS光谱。若硫醇化的DNA寡核苷酸链率先与金属纳米颗粒结合，生成拉曼探针，即使在NaCl离子浓度较高的环境下纳米颗粒也未见发生不可逆聚
合，并且生成的拉曼引物探针在高浓度离子环境下更加稳定，保存时间长(图2)[9]。Papadopoulou等的研究虽然实现了对单链、双链DNA以及单个错配DNA链的探测，但是分析结果耗费时间还产生了一些无序的特异性信号。Xu等学者利用经碘化物修饰后的银纳米基底在模仿人生理液态的环境中实现了对单/双链核苷酸的检测，他们建立的方法获得DNA的拉曼信号具有高度可重复性[10]。而Qian等学者近来采用一种将DNA“金属化”的方法，来实现对其拉曼光谱的高效、可重复性采集。在他们的研究中，采用核酸肽作为固相基底对核苷酸进行特异性配对识别，在识别过程中利用DNA自身所带静电对纳米银颗粒进行吸附，通过一系列化学还原反应使得银纳米颗粒在DNA骨架上生长从而获得拉曼信号。在这一过程中腺嘌呤作为DNA的内在标志物从而实现了DNA的面标记检测。表面增强拉曼光谱的免标记检测进展迅速，近年来已有课题组的研究将免标记SERS检测初步应用于临床样本检测中[11]。Wang等学者采用多重反转录聚合酶扩增方法(multiplex reverse transcription-recombinase polymerase amplification，RT-RPA)扩增待测样本中RNA标志物，采用多元统计分析法对其中的长链扩增子(200 bp)的免标SERS检测结果进行直接分析，以此方法分析了43位临床前列腺癌患者的尿液样本。其分析结果的特异性达93.0%，灵敏行达95.3%，准确度达到94.2%，为免标记SERS检测提供了又一便捷、高效的可行思路[12]。
带式输送机传动滚筒事实上，近年来众多学者对基于免标记SERS检测都提出了多种检测和分析方法，并取得一定成果，提供了许多具备可行性的方案和研究思路[13-15]，然而免标记的SERS检测确有局限。其一，SERS本质上是一种表面选择性技术，与被测物质的结构密切相关。只有当被测物质吸附或邻近于金属活性基底才能探测到SERS光谱，如果被测物质结构中不存在决定其亲近金属表面的结构，那么免标记SERS检测就无法实施。其二，尽管所有分子都可以产生拉曼共振，但共振的强度与分子的拉曼截面(Ramma crossing sections)大小相关[16]。在生物医学界，很多物质分子都没有足够的拉曼截面，这样即使被测物质与拉曼基底能够结合，在低浓度条件下也无法探测，降低了检测灵敏度。其三，目前为止，等离子纳米结构技术还无法同时满足灵敏度(增强磁场)和可重复性要求，“热点”(hotspot)产生的位置局限且难以控制。
带标记的SERS探测需具备以下三个要素：1.标签分子能够产生特征性的拉曼信号波谱；2.具备等离子活性的金属纳米基底，在激发光照射后通过静电作用增强标签分子产生的SERS信号；3.能够识别目标物质的相应配体。目前，许多商业化的荧光标记物均可标记特异性寡核苷酸链用于SERS的定性甚至定量检测。
网络播放机在2002年，Cao[17]等学者以6种拉曼活性荧光标记物标记巯基修饰后的特异性寡核苷酸链，实现了多个目标DNA的同时检测。与目标DNA互补的一半寡核苷酸链预先包被于芯片上，经过修饰的带标记的另一半寡核苷酸链与Au纳米颗粒结合作为SERS探针，采用“三明治”方法，当目标DNA出现后通过DNA杂交实现探测目的。实验中，研究者采用金属Ag包被结合后的Au纳米颗粒，使得SERS强度大大增加，检测浓度可达到20 fmol/L(图3)。Faulds[18] 等在不通过后期化学统计计算的情况下也实现了同一样本中多个带标记寡核苷酸链拉曼探针探测。他们采用了FAM、R6G、BODIPY-TRX、ROX和Cy5.5五个荧光标签，两种激发波获取SERS波谱(FAM和R6G的探测激发波长为514.5 nm，另外三种为632.8 nm)。该课题组后来在这一基础上采用多元变量分析法，使用一种激发波长实现了对6种不同DNA序列的同时检测[19]。
Kang[20] 等构建了一种纳米线作为SERS传感器用以检测多种病原体DNA。他们设计了一种直径约150 nm的Au纳米线，表面以巯基化的“捕获”寡核苷酸序列修饰后置于硅片上；另有带有SERS标签和“报告”DNA链的Au纳米颗粒溶液。功能化的硅片先与目标DNA结合后置于带标签的Au纳米颗粒溶液，通过“三明治”法配对杂交形成“Au纳米颗粒-线”结构，SERS信号的“热点”产生于纳米线与纳米颗粒之间，一旦目标DNA出现，“三明治”结构形成
即可产生强SERS信号被探测。以此方法为基础，将四种不同细菌DNA序列结合于纳米线置于硅片上形成固相芯片基底，与相应4种带SERS标签和“报告”DNA序列的纳米颗粒配对杂交，实现复合样本的同时检测。
Thompson[21]等学者首次报道了以Ag纳米颗粒结合寡核苷酸链作为SERS探针检测DNA的方法。与Au纳米颗粒相比Ag纳米颗粒聚集后能产生更强的电磁场，对低浓度DNA的检测更加灵敏。Harper[22]等进一步研究了DNA与Ag纳米颗粒的亲和度与SERS强度的联系。DNA与Ag纳米颗粒以静电力结合，不受荧光标记物的影响，且单链DNA产生的SERS信号明显强于双链DNA。值得一提的是，由于DNA的磷酸骨架带负电荷，不易与以还原剂生成的带负电荷的Ag纳米颗粒凝胶结合，因此采用促进共聚沉降的试剂(如精胺)中和DNA本身的负电荷将利于二者的结合。
对DNA突变位点的检测在基因诊断和中有十分重要的意义。基于表面共振光谱学检测的技术比基于液相技术的检测手段可控性更好，且SERS检测还能实现复合样本的同时检测。Küstner[23]等学者设计了一种空心半球状结构的单层金属Au结构基底，可以根据实验设计更改球体直径和金属膜厚度。巯基修饰后的寡核苷酸固定于固体结构表面，带标记的
目标DNA通过配对杂交被前者捕获，SERS标签分子在金属Au基底表面产生增强拉曼光谱。之后通过对配对后DNA不同退火温度下SERS信号强度的监测，鉴别野生型、点突变和多点突变DNA。实验结果显示，野生型DNA最高退火温度为51 ℃；点突变和多点突变DNA的退火温度分别为46.8 ℃和39.3 ℃。
