张艺;丁新良;张珏;周彬;郭明明;黄飚
【摘 要】研制了一种快速、定量荧光免疫层析试纸条,用于检测水体中MC-LR含量.基于竞争法原理,采用荧光免疫层析技术,建立MC-LR免疫层析法,并对该试剂考察其灵敏度、准确度、特异性、稳定性等指标.经过对免疫层析试纸条制备参数的优化,即检测线抗原浓度、微球标记量和结合垫微球浓度的选择,加样15 min后,获得了MC-LR荧光免疫层析法的工作直线,方法灵敏度0.195 μg/L,回收率99.4％,变异系数小于10％,与MC-LF交叉反应率低,与市售试剂盒检测结果一致,试剂在37℃稳定保存6d.本研究研制的荧光免疫层析试剂灵敏、稳定、准确,可快速、定量检测水样中MC-LR含量,操作便捷.%This study was designed to develop a rapid quantitative detection strip for MC-LR (microcystin-LR) in water samples using the fluorescent nanosphere immunochromatograhic technology.Based on competitive mode,an immunochromatograhic strip system was developed for detecting MC-LR,and the reagent performance was evaluated for its sensitivity,accuracy,specificity and stability.Several parameters for preparing immunochromatograhic ,the concentration of artificial anti
gen on the test line,labeling rate of nanosphere and antibody,the concentration of nanospheres on the conjugate pad,were optimized.After the sample added for 15 min,the immunochromatographic assay was finished with a linear working range,0.195 μg/L of sensitivity,99.4％ of recovery,below 10％ of variable coefficient,little cross reaction with MC-LF,well consistency with commercial kits,and solid stability for 6 days at 37℃.In summary,this fluorescent nanosphere immunochromatographic strip is sensitive,stable,accurate,rapid,quantitative,and easy performed for MC-LR detection.
【期刊名称】《生物技术通报》
山药去皮机【年(卷),期】2018(034)003
【总页数】5页(P75-79)
【关键词】免疫层析;微囊藻毒素;纳米微球;荧光
【作 者】张艺;丁新良;张珏;周彬;郭明明;黄飚
【作者单位】江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室江苏省分子核医学重点实验室,无锡214063;无锡市疾病预防控制中心,无锡214023;江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室江苏省分子核医学重点实验室,无锡214063;江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室江苏省分子核医学重点实验室,无锡214063;江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室江苏省分子核医学重点实验室,无锡214063;江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室江苏省分子核医学重点实验室,无锡214063
【正文语种】中 文
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微囊藻毒素（MC）是一种环状七肽物质，是古生物蓝藻的代谢释放产物，有多种异构体，对动物和人有强烈的肝毒性［1-2］。其中最常见、水体含量高、毒性最大的是MC-LR，能诱发肝癌，低剂量的MC-LR还能损伤神经细胞、生殖细胞，甚至危害肾、肺等器官［2-8］。在淡水水体富营养化的今天，蓝藻爆发事件时有发生，代谢产物MC-LR对人类的健康构成了严重威胁，而此毒素在水体中自然降解缓慢，使用现行自来水处理工艺难以去除［9-14］。鉴于此，我国制定标准《GB5749-2006》要求对饮用水、湖泊水、河水和地表水的MC-LR含量进行定期监测。
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因为检测手段的便利程度和准确程度，关系到各水厂和环保单位，关系到对蓝藻水华的控制、对水环境的综合治理，关系到居民饮用水安全和经济发展，意义重大。因此，建立符合我国实际情况，快速、准确、现场检测MC-LR的方法，必要而且迫切，具有良好的应用前景和推广价值。
目前常用的MC-LR检测方法包括：高效液相谱法和酶联免疫法［15-18］，这些方法各自的特点如下：前者测得结果准确，但采用的仪器昂贵、操作繁琐、成本高；以后者为代表的免疫分析方法价格低、操作相对简单，但存在或仅能定性、准确度欠佳，或不能单样本检测等缺点，因此上述方法不能实现准确、快速、定量测定MC-LR。因此，本研究拟解决上述问题，运用试纸条层析的优势，建立可快捷、定量、简单检测该毒素的一种方法，并研制相应的试剂。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验样品 水样源于无锡太湖水域，由无锡市疾控中心采样、收集。检测前，样品用0.45 μm膜过滤后，取澄清。
1.1.2 试剂与耗材 MC-LR标准品、MC-LR-牛血清白蛋白（MC-LR-BSA）、抗MC-LR多克隆抗体、MC-LF，均由无锡市疾病预防控制中心提供。羊抗鼠IgG由武汉华美提供。含有荧光染料异硫氰酸的高分子纳米微球，购自biodot公司。样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和卡壳，购自杰一公司。碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）由Sigma公司提供。MC-LR ELISA试剂盒，由江苏省苏微微生物研究有限公司提供。其他试剂均为沪试分析纯。1.1.3 仪器 免疫层析定量分析仪，上海互帼公司；ELX800酶标仪，美国BioTek公司；5417R离心机，美国Eppendorf 公司；超声仪，深圳洁康公司；喷金划膜仪和切条机，杭州赛凯生物公司。
1.2 方法
1.2.1 试纸条的制备
1.2.1.1 MC-LR抗体的预处理 将MC-LR单克隆抗体、MC-LR-BSA和羊抗鼠IgG，分别用0.05 mol/L（pH 7.2）的磷酸盐缓冲液在4℃下透析过夜。
1.2.1.2 结合垫的制备 在高分子纳米微球溶液中加入碳二亚胺（EDC）（终浓度为20 mmol）
和预处理过的MC-LR抗体，室温反应2 h，离心，去除上清液后，加入样品稀释液（含有1%BSA的0.05 mol/L，pH 7.2的磷酸盐缓冲液）至微球浓度为1.0 g/L，待用。用喷金划膜仪以3 μL/cm-5 μL/cm的量将制备好的微球喷涂于聚酯膜形成的结合垫上，避光的条件下于35-38℃烘干1 h，加入干燥剂封存备用。
1.2.1.3 硝酸纤维素膜的制备 使用含1%蔗糖的0.02 mol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液，分别将透析过的MC-LR-BSA抗原和1 g/L的羊抗鼠IgG抗体，使用定量喷膜仪以1 μL/cm的量将两者以一定的间隔喷于硝酸纤维素膜上，35-38℃烘干1 h，加入干燥剂封存备用。
1.2.1.4 试纸条的组装 在底板中间先铺设硝酸纤维素膜，然后在与质控线相临近的一端铺吸水纸，使吸水纸与硝酸纤维素膜部分重叠；在与检测线相临近的一端铺结合垫，使硝酸纤维素膜与结合垫部分重叠；最后贴样品垫。试纸条结构如图1所示。用切条机切按0.4 cm宽度斩切后，装入塑料卡壳中。
图1 MC-LR-POCT试纸条结构1：底板；2：硝酸纤维素膜；3：吸水纸；4：样品垫；5：结合垫；6：质控线；7：检测线
1.2.2 反应过程 使用前，先将试纸条和其他试剂室温放置15 min。将10 μL样品或者MC-LR标准品与50 μL样品缓冲液，滴加入试纸条的样品垫上，室温放置一定时间后，将试纸条卡壳放入检测仪器中读数，仪器可根据测定荧光值自动计算出样品的MC-LR浓度值。
1.2.3 统计学分析 每个样品均检测3次，对应数据用均值（X）或X±变异系数（X±SD）表示。用Origin 8.0软件绘制曲线。
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2 结果
2.1 反应原理
MC-LR-荧光纳米免疫层析采用竞争型反应，经毛细管作用，样品中的MC-LR向结合垫方向移动，然后，带动了结合垫处耦联着MC-LR抗体的荧光微球向硝酸纤维素膜方向移动。当混合物到达检测线时，游离抗原、固定相人工抗原与荧光微球表面的抗体竞争结合，最终在检测线处形成抗原-抗体复合物。未被检测线捕获的微球，将与质控线上的羊抗鼠二抗，形成免疫复合物。其中，样品中MC-LR的含量与检测线上的荧光强度呈反比，荧光信号的强弱由数值显示，这使得样品浓度的定量成为可能。
2.2 检测线抗原浓度的选择
检测线抗原的浓度与抗体结合的效率决定了反应的信号强度，因此本研究率先探讨了检测线上MC-LR人工抗原的含量。使用1 μg/mL微球喷涂与结合垫，针对空白样品做检测，结果见图2。由图所示，0.5 g/L的MC-LR人工抗原适合喷涂在检测线上，此时可以在检测线获得较高的荧光信号。
图2 检测线上MC-LR-BSA含量与荧光信号强度的关系
2.3 微球标记量的选择
预处理过的MC-LR抗体和微球按照不同的质量比1∶200-1∶10，与EDC混合反应。获得的微球按照1 μg/L喷涂在结合垫上。用0和1 μg/L的MC-LR标准品作为样品，考察按照不同质量比标记的微球对反应结果的影响。测0 μg/L浓度样品时，有最高荧光值B0；1 μg/L与0 μg/L的比值B0/B1作为竞争反应效率的反映，比值越大，说明1 μg/L与空白浓度的区分度越大。结果见图3，可知抗体与微球反应比率为1∶50（wt∶wt）时，免疫反应竞争结合效率较高，空白样本的荧光值也相当较高，因此选为本研究的工作比率。
图3 微球标记量对结果的影响
2.4 结合垫微球浓度的选择
将微球用含有1%BSA，0.1%NaN3的0.05 mol/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释到0.12 μg/mL，0.25 μg/mL，0.5 μg/mL，1.0 μg/mL 等不同的浓度，并进行喷涂等处理，然后按前述方法反应检测。结果见表1，从上面的数据可以看到，喷涂不同的微球浓度，检测结果误差不同。当微球浓度较低时，标记抗体量不足，导致检测结果偏低，误差过大。当喷涂浓度为0.5 μg/L或以上时，误差降低，可控制在10%以内，从成本考虑，0.5 μg/mL的喷涂浓度合适。
表1 微球浓度对检测结果的影响（μg/mL）标准值 微球浓度0.12 0.25 0.5 1.0 MC-LR值 0.975 0.811 0.865 0.902 0.934 MC-LR误差 / -16.82% -11.28% -7.49% -4.21%
2.5 标准曲线的获得
根据优化的条件制备MC-LR免疫层析试纸条，即以0.5 g/L的MC-LR人工抗原喷涂检测线，抗体与微球反应比率为1∶50，使用该微球以0.5 μg/L的浓度喷涂于结合垫上。在试纸条的紫外线吸收剂329
加样区加入不同浓度的MC-LR标准品（取6个不同的浓度，分别为0 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L，每个浓度做5个平行样）。膜层析反应 15 min后，仪器读取T、C线信号，以检测的样品荧光值信号为纵坐标，MC-LR标准品浓度为横坐标，建立方程并拟合得到标准曲线 y = 730.42x2 - 6158.4x + 14665（R2 = 0.985），见图4，然后通过该标准曲线得到标准卡，作为对样品中所含MC-LR浓度进行定量分析的基础。
