(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610575514.9
(22)申请日 2016.07.21
(71)申请人 上海奥普生物医药有限公司
地址 201201 上海市浦东新区瑞庆路526号
(72)发明人 朱奇朗 石晓强 朱传增 张蕾
张珂 李福刚 徐建新
(74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有
限公司 31227
代理人 吴泽
(51)Int.Cl.
G01N 33/68(2006.01)
G01N 33/558(2006.01)
G01N 33/533(2006.01)
(54)发明名称
制备方法
(57)摘要
延时开关电路本发明公开一种定量检测cTnI的荧光免疫
层析试剂及其制备方法，属于临床医学诊断领
域。该试剂由试纸条和荧光液两部分组成。其中，
试纸条包括底板、Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水
垫；所述Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水垫水平方
向顺序连接固定于底板上。所述硝酸纤维素膜上
构成的质控线。荧光液包含cTnI单克隆抗体2标
发明利用时间分辨荧光微球提高荧光强度，降低
背景信号，同时定量检测全血、血清或血浆中的
cTnI含量，样本仅需要10～20微升。该试纸条具
有方便快捷、操作简单、检测时间短、特异性强、
灵敏度高、检测结果更加准确，适用于临床POCT
的快速诊断。权利要求书2页 说明书10页 附图3页CN 106248958 A 2016.12.21
C N 106248958
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A
1.一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：该试剂由试纸条和荧光液两部分组成；所述的试纸条包括底板(1)、Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)；
所述Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)水平方向顺序连接固定于底板上；所述硝酸纤维素膜(3)上包被有cTnI单克隆抗体1(5)的检测线和兔IgG抗体(6)构成的质控线；
所述的荧光液(7)包含cTnI单克隆抗体2标记的的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球。
2.根据权利要求1所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的时间分辨荧光微球选自修饰过的聚苯乙烯微球。
3.根据权利要求2所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的聚苯乙烯微球，表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，粒径为100～500nm。
4.根据权利要求1所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述cTnI单克隆抗体1选自9701 85～95单克隆抗体、MF4 190～196单克隆抗体中的一种；
所述cTnI单克隆抗体2选自M18 18～28单克隆抗体、19C7 41～49单克隆抗体中的一种。
5.根据权利要求1所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的时间分辨荧光微球内部填充镧系元素的螯合物。
6.根据权利要求5所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的镧系元素为铕、钐、鈊、镝中的一种。
7.根据权利要求1所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于，所述的荧光液的制备步骤如下：
(1)cTnI单克隆抗体2标记时间分辨荧光微球的制备及稀释：
将时间分辨荧光微球溶于100mmol/L MES缓冲液中，每1mg时间分辨荧光微球对应100-300μL MES缓冲液，加入活化剂NHS和EDC,EDC的终浓度为0.05％-0.1％，NHS的终浓度为0.1％-0.2％；随后加入氨基乙酸，使得微球表面连接手臂，每1mg时间分辨荧光微球对应10-100μL 50mmol/L氨基乙酸；洗涤、20000-25000rpm离心后，再次加入活化剂活化，EDC的终浓度为0.05％-0.1％，NHS的终浓度为0.1％-0.2％；再次洗涤、20000-25000rpm离心，将时间分辨荧光微球用硼酸缓冲液复溶，随后加入cTnI抗体进行反应1h，微球与抗体的质量比为10mg:0.01mg～2.0mg；反应完后加入封闭剂进行封闭，
封闭剂的终浓度为2-3％；封闭2h，洗涤、20000-25000rpm离心，再次用pH为7-9的60-100mmol/L硼酸缓冲液及封闭剂复溶、超声，封闭剂的终浓度为2-3％，cTnI抗体标记时间分辨荧光微球终浓度在0.5～50μg/ml，使微球均匀分散在缓冲液中，2-8℃避光保存；
(2)羊抗兔抗体标记的荧光微球的制备及稀释过程同(1)所述；
(3)滴配：
用pH为8.0、200mmol/L的Tris缓冲液将步骤(1)和(2)中同等量的cTnI抗体、羊抗兔包被的荧光微球分别进行稀释，其中，cTnI包被的荧光微球稀释200～300倍，羊抗兔包被的荧光微球稀释2000～3000倍，混合后即为所需要的荧光混合液。
8.根据权利要求6所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述洗涤采用0.9％NaCl，0.05％Tween 20，剩余为5mmol/L的PB混合而成的洗涤剂，其pH为7.8，加入洗
涤剂后微球终浓度在0.5％。
9.一种制备权利要求1所述的定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂的方法，包括如下步骤：
(1)制备检测线和质控线：硝酸纤维素膜(3)在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应
的发生的场所；检测线(5)是将cTnI抗体使用50mmol/L柠檬酸盐或蔗糖稀释液稀释，划线于所述硝酸纤维素膜(3)上；质控线(6)是将兔IgG抗体使用50mmol/L柠檬酸盐或蔗糖稀释液稀释，划线与所述质控线(6)，将划好的硝酸纤维素膜置于真空干燥箱，在37～45℃下，烘干24～48小时，检测线(5)位于质控线(6)左侧，即液体首先接触的位置；
(2)试纸条的组装：试纸条底板(1)由左到右依次粘附Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水纸(4)，将组装好的大板切成小条，即得到所述定量检测cTnI的时间分辨荧光免疫层析试纸条。
一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂及制备方法
技术领域
[0001]本发明属于临床医学诊断领域，具体涉及一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂及制备方法。
背景技术
[0002]心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)是心肌肌肉收缩的调节蛋白。cTn是由三种不同基因的亚基组成：心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTn I)和肌钙蛋白C(TnC) 1.2。目前，用于ACS实验室诊断的是cTnT和cTnI。
[0003]TnI(肌钙蛋白I)存在三种亚型：骨骼肌肌钙蛋白I(sTnI)中存在快骨骼肌型和慢骨骼肌型，它们具有相似的分子量(20KD)，但二者之间的氨基酸序列约存在40％的差异；第三种为心肌型。心肌肌钙蛋白I(cTnI)与骨骼肌型的氨基酸序列也存在40％的差异。但人的cTnI氨基末端比sTnI多31个氨基酸，使其分子量达到22KD，这种独特的顺序使之具有较高的心肌特异性，有助于制备相应的单克隆。cTn是以cTnI-C-T复合物和游离cTnI形式存在于心肌细胞中，心肌损伤时释放到血循环中后，cTnI-C-T可进一步分解为cTnI-C复合物和游离cTnI。故血循环中除cTnI-C-T、游离cTnI外还有cTnI-C，而且cTnI-C是其在血液中的主要形式。其代谢产物由肾脏排出体外。
[0004]测定心肌功能障碍标志物被作为诊断急性心肌梗塞(AMI：acute myocardial infarction)的标准手法，特别是心电图未发现异常时，可作为对有助于诊断的手法。据报告，cTnI浓度的上升，对诊断AMI、心脏挫伤、不稳定型心绞痛病人的心肌特异性障碍非常有用。AMI时，cTnI会在4-8小时内从损伤的心肌细胞释放到血液中，并超出正常浓度范围。通常，AMI发病12-18小时后，达到最高浓度，在5-10天内维持高值3.4。
[0005]对于AMI病人，cTnI浓度随着时间变化的增减，类似于CKMBmass(总肌酸激酶MB异构体量)。发病初期的浓度上升，虽然比CK-MB迟，但在美国心脏病学会和美国心脏协会的最新指南5.6显示，由于对心肌的高特异性和诊断效率等原因，cTnI对检测心肌功能障碍，具有较高的应用价值。cTnI作为一种新的诊断标志物被应用于AMI的临床诊断，特别是对那些没有心电图诊断的患者更加重要7.8。
直线度测量
高频电子水处理器[0006]中国专利申请号201510070592.9披露了一种肌钙蛋白I超敏检测试剂盒及超敏检测方法，该申请号专利利用磁性微球标记不同目标物的抗体，实现肌钙蛋白I超敏检测。该申请号专利需要100μL的样本测试，而且最高只能到50ng/ml，特别是对于样本量少的和严重的心梗患者，该专利的测试还不能达到要求。
[0007]中国专利申请号201110440258.X公布了一种胶乳增强免疫比浊法测试心肌钙蛋白T的超敏感方法。该申请号专利采用聚苯乙烯胶乳颗粒作为标记物，该方法需要大量的抗体原料，大大提高了抗体的用量和试剂的成本。此外，该方法还是需要25μL的样本测试，而且最高仅仅能达到10ng/ml。
[0008]中国专利申请号201420648352.3披露了一种利用量子点标记测试肌钙蛋白I超敏检测试剂盒，该申请号专利利用量子点标记不同目标物的抗体，实现肌钙蛋白I超敏检测。
该申请号专最高也只能到20ng/ml，特别是对严重的心梗患者，该专利的测试还不能达到要求。
d570
[0009]现有的cTnI检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)，化学发光法和酶联荧光分析法。ELISA方法测定周期长；化学发光法和酶联荧光分析法价格昂贵，需有专门仪器和专业人员操作，只适用于中心实验室使用，检测结果到达医生手中的时间较长，不能满足临床快速检测需要，也不适合于中小医院尤其是没有中心实验室的乡镇医院。
[0010]胶乳增强免疫比浊法操作简单，但一般可以采用物理吸附法和化学偶联法，物理吸附法稳定性较化学偶联法要差，易受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，导致检测结果假阳性或假性升高。两种偶联方法将导致抗体结合力的损失，增加了抗体用量和生产成本。
[0011]胶体金免疫层析法标本用量少，简便快速，适合于cTnI的床旁检测。但胶体金免疫层析法仅能进行定性测定，对于定量测定则灵敏度很差。基于胶体金免疫层析法开发的检测卡，虽然可快速完成cTnI定性检测，但同样由于灵敏度较低的问题，在AMI早期，血清中仅含有少量cTnI的情况下，胶体金免疫层析法无法准确诊断出AMI的发作，所以在临床应用上还是有很大的局限性。
[0012]现在的有些试剂的检测范围太窄，不能达到临床检验的目的。
[0013]CN201510012347.2需要10μL的样本，但需要有样本的稀释过程，操作繁琐。而现在的有很多的测试方法CN201410561126.6需要100μL的全血样本。因为全血样本中含有很多的干扰物质，随着检测样本全血量的增加，干扰因素也会逐渐提高。所以在检测全血样本时，降低全血样本所需要的量变的越来越重要。
发明内容
[0014]本发明的目的是提一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂，该试剂能在较短的检测时间内完成cTnI的检测，检测时间短，检测灵敏度高。
[0015]本发明还提供了定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂的制备方法。
[0016]一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂由试纸条和荧光液两部分组成。[0017]所述的试纸条包括底板(1)、Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)。[0018]所述Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)水平方向顺序连接固定于底板上。
[0019]所述硝酸纤维素膜(3)上包被有cTnI单克隆抗体1(5)、的检测线和兔IgG抗体(6)构成的质控线。
[0020]所述的荧光液(7)包含cTnI单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球。
[0021]所述的时间分辨荧光微球选自修饰过的聚苯乙烯微球。
[0022]所述的聚苯乙烯微球，表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，粒径为100～500nm。
[0023]所述cTnI单克隆抗体1选自9701 85～95单克隆抗体、MF4 190～196单克隆抗体中的一种；
[0024]所述cTnI单克隆抗体2选自M18 18～28单克隆抗体、19C7 41～49单克隆抗体中的
