·论 著·
赵志英# 胡海涛 师社会 许杰华
【摘 要】 目的 寻求较理想的新生大鼠脑源性神经干细胞(neu ral stem cells,N SC s)分离培养方法。 方法 用不同的接种密度和多种配方的培养基：细胞种植密度采用1×104、1×105、1×106和1×107个 m l4个浓度；培养基除基础成分DM E M F12外，按照是否添加2%B27、碱性成纤维细胞生长因子(basic fib rob last grow th facto r,bFGF)、表皮生长因子(ep iderm al grow th facto r,EGF)以及开始培养时胎牛血清浓度不同而分别记为第1～8组。分离培养新生大鼠脑源性N SC s并诱导其分化，应用相差显微镜和免疫细胞化学法对其进行观察和比较。 结果 分离培养出的细胞聚集成神经球，可在体外大量增殖和长期存活，可诱导分化为神经元和神经胶质，具有神经干细胞特性。开始培养时培养液中加入5%胎牛血清有利于N SC s存活，当血清浓度采用10%时，克隆球迅速分化，干细胞收获量极少；干细胞增生速度在种植密度采用1×106个 m l时优于采用其它种植密度时，适当提高其种植密度可加快增生速度；培养基中加入2%B27、bFGF、EGF是必需的,2%B27、20ng m l的bFGF和EGF同时加入时N SC s生长最好,bFGF和EGF对加快N SC s的增生具有协同作用。 结论 成功建立了较理想的新生大鼠脑源性N SC s分离培养方法，为进一步研究和应用奠定了基础。
【关键词】 神经干细胞 大鼠 脑 细胞免疫化学 细胞培养 生长因子
中图分类号:Q421 Q813111 文献标识码:A
THE OPTI M IZATI ON OF THE M ETHOD OF CUL TUR ING NEURAL STE M CELL S IN NEONATAL RAT BRA IN ZH A O Z h iy ing,H U H a itao,S H I S hehu i,et a l.D ep a rt m en t of A na to m y,M ed ica l Colleg e of X i’an J iaotong U n iversity,X i’an S haanx i,710061,P.R.Ch ina
Corresp ond ing au thor:H U H a itao,E2m a il:huh t@m a il.x j tu.
【Abstract】 Objective To estab lish a better m ethod of iso lating and cu ltu ring of neu ral stem cells(N SC s)in neonatal rat b rain.M ethods T issue of b rain w as iso lated from neonatal rats.D ifferen t m edium and cu ltu re concen trati on w ere u sed to cu ltu re N SC s of neonatal rat.T he cu ltu re concen trati on u sed w ere1×104,1×105,1×106 and1×107 m l respectively.Ingredien t of m edium w as classified in to group1to8respectively acco rding to w hether to add2%B27,ep iderm al grow th facto r(EGF)and basic fib rob last grow th facto r(bFGF)as w ell as the difference in cu ltu re concen trati on.T he cells w ere induced to differen tiate as to be confirm ed as N SC s,and then w ere checked by phase con trast m icro scopy and iden tified by i m m unocytochem istry.Results T he cells iso lated and cu ltu red gathered in to neu ro spheres.T he cells w ere capab le of p ro liferati
ng and m ain tain ing long2term su rvival in v itro.T he cells cou ld be differen tiated in to neu ron s and glia.It w as to the benefit of the su rvival of N SC s to add5%fetal bovine serum(FBS) in to the m edium at the beginn ing of the cu ltu ring.W hen10%FBS w as added in to the m edium,the neu ro spheres differen tiated qu ick ly.W hen concen trati on1×106 m l w as u sed,the grow th rate of the cells w as the h ighest of all the concen trati on s.R easonab ly h igher cell concen trati on p romo ted the p ro liferati on of N SC s.It w as necessary to add2% B27,EGF,and bFGF in to the m edium.T he cells had the best grow th w hen2%B27,20ng m l bFGF and20ng m l EGF w ere added in to the cu ltu re m edium.EGF and bFGF had cooperative effect.Conclusion A better m ethod of iso lating and cu ltu ring of N SC s in neonatal rat b rain is estab lished and the foundati on fo r fu tu re research is laid.
【Key words】 N eu ral stem cells R at B rain I mm unocytochem istry Cell cu ltu ring Grow th facto r
Founda tion ite m:N atu ral Science Foundati on of Shaanx i P rovince(2001S M57)
aa183基金项目：陕西省自然科学基金资助项目(2001S M57)吸收二氧化硫
作者单位：西安交通大学医学院人体解剖学与组织胚胎学系(西安,710061)
#现在包头医学院基础医学部解剖学教研室
通讯作者：胡海涛，教授，博士导师，研究方向：发育与衰老神经生物学,E2m ail:huh t@m ail.
利用神经干细胞(neu ral stem cells,N SC s)老年性痴呆、脊髓损伤等神经退行性病变是近年来研究的热点之一，其临床应用前景广阔。但在过程中需要大量N SC s，如何在体外快速获取高纯度N SC s是研究者必须面对的问题。培养N SC s的方法很多，其结果也存在较大差异[125]。我们对常用的几种培养方法进行比较研究，在进行新生大鼠脑源性N SC s分离和培养过程中，发现应用无血清培养基时N SC s的增生速度相对较慢，收获量较少，需较长时间才能达到研究要求。为此我们采用新生大鼠脑组织作为N SC s的来源，应用DM E M F12为基础培养基，添加不同成份，观察N SC s的生长情况，寻求较理想的新生大鼠脑源性N SC s分离培养方法。
1 材料与方法
1.1 材料
新生1～3d的SD大鼠，西安交通大学医学院实验动物中心提供。细胞培养试剂:DM E M F12、2%B27 (Gibco，美国)；碱性成纤维细胞生长因子(basic fib rob last grow th facto r,bFGF)和表皮生长因子(ep i
derm al grow th facto r,EGF),(Sigm a，美国)；胎牛血清(杭州四季青公司)。抗体：抗巢蛋白(nestin)单抗(Chem icon，美国)，抗B rdU单抗(Zym ed，美国)，抗胶质纤维酸性蛋白(glial fib rillary acidic p ro tein, GFA P)单抗、抗神经丝蛋白(N F2200)单抗、F ITC标记的羊抗小鼠二抗和SABC免疫组织化学试剂盒(武汉博士德生物工程公司)。
1.2 方法
1.2.1 脑组织单细胞悬液的制备 取新生1～3d SD 大鼠，按照文献[6]方法，获取单细胞悬液，计数并调整细胞密度，分别以不同种植密度和培养液配方接种于50m l培养瓶中，每瓶4m l。
1.2.2 不同细胞种植密度 选择较理想的培养基配方，将细胞按1×104、1×105、1×106和1×107个 m l 分别种入4个培养瓶培养，在第5、10、15和20天时取部分标本进行神经干细胞球计数。
1.2.3 不同的培养液配方 将制备好的脑组织单细胞悬液分别加入8个50c m2培养瓶内，使细胞密度约为1×106个 m l，分别记为第1～8组。第1组仅加入DM E M F12；第2组加入DM E M F12和2%B27；第3组加入DM E M F12、2%B27及EGF；第4组加入DM E M F12、2%B27及bFGF；第5组加入DM E M F12、2%B27、EGF及bFGF；第6组加入DM E M F12、2%B27、EGF、bFGF及5%胎牛血清,3d后将培养基中的血清去除，改为无血清培养；第7组加入DM E M F12、2%B27、EGF、bFGF及10%胎牛血清,3d后将培养基中的血清去除，改为无血清培养；第8组不加2% B27，其它成分
同第6组。其中DM E M F12、2%B27、EGF、bFGF浓度均为20ng m l。于37℃、5%CO2静置培养7d，每隔2～3d半量换液1次。每6～9天机械分离细胞克隆球传代1次，相差显微镜观察。
1.2.4 N SC s的诱导分化和免疫细胞化学染 取少量培养的N SC s，置入装有经多聚赖氨酸处理过盖玻片的24孔培养板中，培养条件为含10%胎牛血清的DM E M F12,37℃、5%CO2，培养2周后收获细胞。取神经克隆球及其分化后细胞爬片，按常规方法用4%多聚甲醛固定，用含3%H2O2的0.1m o l L PB S去除内源性过氧化物酶15m in,10%正常羊血清孵育30m in 封闭非特异反应。加入一抗(单克隆抗体，稀释度按各公司产品说明),4℃孵育过夜，生物素标记(IgG,1∶100)和SABC免疫组织化学试剂盒(1∶100)，各孵育2h,DAB呈。光学显微镜观察。
1.2.5 N SC s增殖能力鉴定 传代2次以上的N SC s 在培养液中加入5m g L的B rdU继续培养72h，将细胞转至多聚赖氨酸包被的玻片上，贴壁分化,4%多聚甲醛室温固定。4m o l L盐酸处理30m in，加入小鼠抗B rdU，室温过夜；加入F ITC标记的二抗,2h后荧光显微镜观察。吸油茶
2 结果
2.1 大鼠脑源性N SC s的分离、培养及鉴定
由新生大鼠脑组织分离培养的细胞，经6～7d无血清加B27和生长因子培养后，细胞呈圆形或长椭圆形
球状集落，且神经干细胞球(克隆球)悬浮生长(图1)。克隆球中的细胞数目有数十至数百个不等。原代培养时，培养瓶内可见一些细胞碎片和贴壁的杂细胞，但经传代后，这些杂质均减少甚至消失，克隆球传至9代以上仍具干细胞特性，且生长状态良好。有血清培养诱导分化后，克隆球2～4h开始贴壁，发出呈放射状生长的细胞；分化的细胞贴壁，呈多种形态(图2)。克隆球经nestin免疫组织化学染，几乎所有细胞均呈阳性(图3)。分化的细胞有的为1～2个或多个突起的呈N F2200免疫染阳性的神经元(图4)；有的为多突起的呈GFA P免疫染阳性的星形胶质细胞(图5)。神经干细胞B rdU掺入后，分化培养的细胞中大多数细胞核荧光显微镜下可见B rdU免疫染阳性(图6)。
2.2 不同培养液配方的比较
第1、2组生长情况类似，培养瓶内细胞碎片很多，细胞聚集不明显。在培养过程中，有少量云团状死细胞
团漂浮，但始终未形成典型的克隆球；当培养至9d 后，漂浮死细胞团逐渐散乱成为碎片状物，细胞培养失败(图7)。
第3、4组情况类似，培养第2天，可见较多细胞碎片，有一定数量的细胞聚集；第7天，出现较明显的克隆球，但碎片仍较多(图8)。其中第3组加入DM E M F 12、
2%B 27及EGF ，在1～2周，克隆球长势较好，但贴壁、分化多;3周后细胞增殖明显变慢;5周后，全部细胞球均贴壁、分化而死亡。第4组加入DM E M F 12、2%B 27及bFGF ，只有少量克隆球形成，增殖速度较慢，有部分克隆球存活至5代以上。
第5、6组情况有较大差异。第6组在培养的第3天即可见培养瓶内细胞碎片少，有明显的细胞聚集。第5天可见有大量克隆球形成，细胞增殖快，细胞碎片进一步减少。第2次换液时，细胞碎片已很少，见较多大克
隆球，只有少量分化。为防止细胞球继续分化，改用不
含血清的完全培养基，克隆球分裂生长旺盛(图1)，可连续传代，其中一株已培养9代，细胞状态仍然较好。第5组在培养的第5天可见有较多克隆球形成，克隆球增长较快，有少量分化，但不如第6组理想，细胞碎片较多，克隆球增殖活力也较第6组差。
第7组前3天所见同第8组，此后继续用含10%胎牛血清的DM E M F 12培养基培养，有大量细胞贴壁，细胞团出现明显分化(图7)，从细胞球长出许多放射状突起，相邻细胞球之间的细胞突起相互交错连接成网。但仍有个别不分化的细胞团存在。第8组前3d 有较多克隆球形成，但增长速度较慢，同时克隆球大部分很快分化、消失，无克隆球存活至5代以上。2.3 不同细胞种植密度的比较
不同种植密度对克隆球形成的影响见图9。
实验
图1 由单个NSCs 分裂形成的神经球(倒置显微镜×200) 图2 由神经球分化游离出的神经终末细胞，
可见细胞形态各异(倒置显微镜×200) 图3 神经球经nesti n 免疫细胞化学染，几乎所有细胞呈阳性(×100) 图4 分化神经元NF -200免疫细胞化学染，见胞浆丰富，突起细长(×200) 图5 分化神经胶质细胞GFAP 免疫荧光化学染，胞核不明显，突起较多(×200) 图6 NSCs BrdU 掺入后，大多数分化后的细胞核呈BrdU 免疫染阳性(荧光显微镜×200) 图7 第9天，培养干细胞失败(倒置显微镜×200) 图8 第7天，出现了较明显的克隆球，但碎片仍较多(倒置显微镜×200) 图9 不同种植密度对克隆球形成的影响
F ig .1 The neurospheres der ived fro m si ngle neural ste m cells (I nverted m icroscope ×200) F ig .2 The neurospheres differen ti ated i n to ter m i nal neural cells with differen t shapes (I nverted m icroscope ×200) F ig .3 The neurospheres were nesti n -positive by i m munocytoche m istry sta i n i ng (×
100) F ig .4 So me differen ti ated neural cells were NF -200positive by i m munocytoche m istry sta i n i ng ,with plen ty of cell plas ma and long process (×200) F ig .5 So me differen ti ated gli al cells were GFAP positive by i m munocytoche m istry sta i n i ng ,with uncon sp icuous nucleolus and many processes (×200) F ig .6 BrdU was blunged i n to neural ste m cells ,so me karyon s of differen ti ated cells were BrdU -positive by i m munof luorescence sta i n i ng (f luoresence m icroscope ×200) F ig .7 The cultured neural ste m cells fa iled on the 9th day (I nverted m icrosco
pe ×200) F ig .8 There were a few of neurospheres ,but with a lot of cell frag men t on the 7th day of cultur i ng neural ste m cells (I nverted m icroscope ×200) F ig .9 The
effect of var ious cell culture concen tration on generation of neurospheres火灾预警系统
中最理想的培养基配方为培养基中加入DM E M F12、2%B27、EGF、bFGF及5%胎牛血清,3d后将培养基中的血清去除改为无血清培养(第6组方法)。
1×104、1×105个 m l种植密度的培养瓶内有克隆形成，但数量相对少。1×107个 m l种植密度的培养瓶内细胞碎片较多，克隆球形成后，很快有部分崩解。1×106个 m l种植密度的培养瓶内，克隆球形成多，细胞碎片少，且克隆球分裂生长也旺盛。
3 讨论
神经干细胞是存在于神经系统中，能够增殖并分化为神经元和胶质细胞的特定神经前体细胞。N SC s 的生物学特点包括多向分化潜能、分裂增殖、长期自我更新维持自身数量稳定及对疾病、损伤的反应能力，其中最基本的属性为自我更新和多分化潜能。起始表达于神经胚形成时，但随着神经细胞分化的完成而停止表达的神经nestin，被广泛应用于N SC s的鉴定[7]。我们的实验用无血清培养所获得的神经球表达nestin，可传代培养维持自身数量稳定且仍保持未分化特性, B rdU可掺入DNA中，说明其
可分裂增殖；贴壁分化后的细胞，表达N F2200和GFA P，表明其可分化为神经元和胶质细胞。以上结果表明我们实验培养所获得的神经球确实为神经干细胞球。
细胞接种密度对干细胞的增殖速度有明显影响: 1×104～1×106个 m l，接种密度越高，增殖速度越快；但当接种密度达1×107个 m l时，由于细胞碎片过多，反而妨碍了干细胞增殖。根据N SC s的特性，其机制可能在于：脑内N SC s数量有限，只有足够量的脑细胞才可分离出较多的N SC s;N SC s间有某种联系，有密度依赖性。因此适当提高N SC s种植密度可加快其增殖速度。
我们的实验结果表明，在培养液中无生长因子和B27时，细胞培养失败，即使培养液中添加EGF和bFGF，但不加入B27时，其增殖速度较慢，克隆球存活不超过5代，说明B27添加剂对N SC s培养是必需的。当分别添加EGF、bFGF和这两种生长因子联合加入时的结果表明,bFGF和EGF为N SC s培养所必需,EGF 对干细胞早期存活起主要作用,bFGF在维持干细胞的长期增殖分裂方面有重要作用，二者联合应用对加快干细胞的增殖、分裂具有协同作用。这与朱晓峰等[8,9]的研究结果相似。
智能控制方法N SC s培养一般均采用无血清培养基，血清多在使N SC s向下一级细胞分化时使用[10]。与骨髓间质干细胞相似，高浓度血清易导致干细胞的自发分化[11]。我们通过实验的比较研究发现，若先给予较高浓度(10%)血清的培养基，即使有克隆球形成，也很快分化为神经元和神经胶质，干细胞收获量过低；而先给予低浓度(5%)血清培养基，数天后改为无血清培养基，神经干细胞球出现快，死亡细胞碎片少，是新生大鼠脑源性N SC s培养的最佳途径。
将N SC s移植于神经系统内，能够良好存活，大量增殖、迁移到不同部位分化为相应的细胞，并整合于宿主细胞。产生的神经元与宿主神经纤维建立突触联系，不会引起组织结构的异常和肿瘤形成,N SC s的移植可从解剖和功能上修复神经系统[12]。N SC s的培养方法优化，有利于获得足量的N SC s，为进一步应用于神经系统的损伤修复及神经性疾病的打下基础。
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(收稿:2004212216 修回:2005205216)
(本文编辑：董奇男 王雁)
