济源市疾病预防控制中心 | 文件编号： |
作业指导书 | 第 1 页 共 5 页 | 第 1版 第 1次修订 |
起草人：王军鹏 | 审核人： |
| 批准人： | 批准日期：2013年12月18日 |
实施日期：2013年12月18日 |
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1. 范围
适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序
2.1 生物安全要求
MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料
2.2.1 生长成片的MDCK细胞
2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶
2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）
2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃
2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液
2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃
2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V
2.2.9 1mL、10mL无菌移液管
2.2.10 70％～75％的酒精
注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤
这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备
500mL D-MEM液中加入：
a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备
胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL
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胎牛血清灭活残余的胰酶。
2.3.7 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。
2.3.8 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）。
2.3.9 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。
2.3.10 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
3. 流感病毒细胞分离程序
3.1 生物安全要求
流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行BSL-2防护。流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。
3.2 材料
3.2.1 75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离
3.2.2 胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）
3.2.3 HEPES缓冲液，1M母液
3.2.4 D-MEM培养基，Hank's液
3.2.5 青、链霉素母液（10000 U/mL 青霉素G；10000 μg/mL硫酸链霉素 ）
3.2.6 牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液
3.2.7 临床样品0.5mL
3.2.8 1mL无菌移液管
3.2.9 10mL无菌移液管
3.2.10 15mL无菌离心管
3.3 实验步骤
3.3.1 细胞维持液准备
500mL D-MEM液中加入
a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL 青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
3.3.2 病毒生长液
每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2μg/mL。
3.3.3 流感病毒MDCK细胞分离步骤：
3.3.3.1 75％～90％成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。
a）用40×物镜观察细胞生长状态。
b）轻轻倒出细胞生长液，用10 mL 的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。
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3.3.3.2 细胞培养瓶的接种
a）用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。
b）用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。
c）然后放于35℃ 5% CO2培养箱中吸附1～2h。
d）吸出接种物，用10 mL 的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。
e）放置于33～35℃培养箱培养。
f）每日观察细胞病变情况。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。
3.3.3.3 细胞培养物的收获
当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10 mL 的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。收获的病毒液可以立即进行后续试验，或冻于-80℃冰箱待以后试验使用。
4. 流感病毒的鉴定
至今对流感病毒鉴定最常用的方法为红细胞凝集抑制（HI）测定，因该法简便、易行、结果可信。HI试验分常量法和微量法两种。微量HI法是目前国际普遍使用的方法，也是WHO流感监测中推荐使用的标准方法。HI试验的原理是流感病毒表面具有的血凝素蛋白能和含有唾液酸的受体物质特异结合，红血球浆膜上含有这类物质，当一定量病毒和适当比例的红血球混合后发生凝集，此为血凝现象。而用流感病毒特异性抗体和病毒作用，干扰了病毒和红血球的结合从而抑制了血凝，此为血凝抑制现象。这就是传统流感病毒的鉴定的理论依据。微量HI法实验步骤如下：
4.1 生物安全要求
流感病毒的鉴定实验室生物安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行BSL-2防护。流感病毒的鉴定操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。
4.2 实验材料
4.2.1 分离培养物（标本）
4.2.2 标准血清：常规鉴定用，包括甲1、甲3和乙型流感代表株的至少3种抗体；
4.2.3 红血球：0.75%人“O”型红细胞
智力积木4.2.4 受体破坏酶（RDE）
4.2.5 PBS或生理盐水
4.2.6 96孔微量板
4.2.7 可调多通道移液器和单通道移液器及滴头
4.2.8 其他水浴箱等
4.3 HI试验操作过程
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4.3.1 加PBS或生理盐水25ul于96孔板的第B行至H行的每一孔。
4.3.2 加1：10稀释的经受体破坏酶处理过的标准血清50ul于A行的每一孔。
4.3.3 用多通道移液器从A行各孔取25ul血清，倍比稀释至H排各孔，弃去25ul。
4.3.4 25ul被检病毒的4个血凝单位抗原加至各孔，混匀，室温静置15-30min，
4.3.5 然后加50ul的红血球（0.5%鸡红细胞或0.75%豚鼠红细胞），
4.3.6 室温静置30-60min（鸡血球30min；豚鼠血球60min）后观察结果。
4.3.7 结果判定：血凝被完全抑制的血清最大稀释度的倒数为血凝抑制试验的终点，该孔稀释度即为HI试验的效价。
4.4 受体破坏酶处理血清
目的是去除非特异性血凝抑制素。因为人和动物血清中存在非特异性血凝抑制素，它们是游离在血清中类似病毒受体的唾液酸残基，能与病毒血凝素分子上的受体结合，会竞争抑
制病毒与红血球的结合，因而造成假阳性，因此HI试验必须用受体破坏酶处理血清。具体操作如下：
4.4.1 3体积的RDE，1体积的血清（0.3ml RDE ： 0.1ml血清）混合。
销子材料>骨刺灵4.4.2 37℃水浴过夜。
4.4.3 56℃ 30min失活。
4.4.4 加入6体积的PBS或生理盐水混合，使血清稀释为1：10备用。或者按4：1处理后，倍比稀释为1：10备用。可乐杯
4.5 去除非特异性凝集素
处理过的血清可能与红细胞发生非特异性凝集。如血清中存在非特异性凝集，按下述方法处理：
4.5.1 用1体积的红细胞和20体积的RDE处理过的血清充分混匀。
4.5.2 搁置4℃ 1小时，其间使沉降红细胞再悬浮、混匀。
4.5.3 900 X g 5min离心。
4.5.4 取上清，反复上述操作直至血清与红细胞的吸附阴性为止。
电锅炉制造
4.6 4个血凝单位抗原的调制
病毒培养阳性的标本首先确定其HA滴度，在此基础上调制4个血凝单位抗原，用于HI 试验。HA测定和4个血凝单位抗原的调制方法如下：
