题 目 | 微生物限度检查SOP |
标准编号 | QC/P1-011/01 | 共11页 第1页 |
制定部门 | 质检中心 | 复 制 号 | |
起 草 人 | | 日 期 | 2010年09月10日 |
审 核 人 | | 日 期 | 2010年09月11日 |
批 准 人 | | 日 期 | 2010年09月19日 |
颁发部门 | 质量管理部 | 发布日期 | 2010年09月19日 |
实施日期 | 2010年10月01日 |
变更记录 |
修订号 | 发布日期 | 实施日期 | 变更原因及目的 |
00 | 2006年04月19日 | 2006年05月08日 | 首次发布 |
01 | 2010年09月19日 | 2010年10月01日 | 根据2010版药典修订 |
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分发单位
生 产 部〔 〕 | 质量管理部〔 〕 | 质检中心〔 〕 |
动力设备部〔 〕 | 固体制剂车间 〔 〕 | 注射剂车间〔 〕 |
物 供 部〔 〕 | 人力资源部〔 〕 | 行政办公室〔 〕 |
销 售 部〔 〕 | 计 财 部〔 〕 | |
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1 适用范围:
本规程规定了微生物限度检查方法及操作要求，适用于本公司检品的微生物限度检查。
2 责任人:
质检中心生测组检验员。
3 仪器、设备:
超净工作台 恒温培养箱 生化培养箱 显微镜 高压蒸气消毒器 酒精灯 无菌衣、裤、帽、口罩 消毒鞋 刻度吸管(1ml、10ml) 具塞试管(20ml) 三角瓶(100ml) 平皿(φ90mm) 乳钵 镊子 接种环 棉花 洗耳球 除菌滤器 抽滤瓶(1000ml) 微孔滤膜(≤0.45μm) 恒温干燥箱 4.1 用具的包扎:
4.1.1 刻度吸管：在刻度吸管上端管内，松松地塞进少许棉花，然后分别用纸严密卷好，再取一层消毒布与牛皮纸包好。
4.1.2 用布袋将洗净晾干的无菌衣、裤、帽、口罩、配套装入，扎紧口袋，再用牛皮纸包扎好。
4.1.3 每批样准备20个清洁的φ90mm平皿，用消毒布和牛皮纸包扎好。
4.1.4 滤器: 将微孔滤膜先在水中浸泡湿润,取出后固定在细菌滤器的滤板上。滤板上、滤膜下均用耐高温垫圈垫好,上好滤器。滤器的螺旋灭菌前勿拧太紧，滤器上口用8层纱布及牛皮纸包扎，装妥后放入瓷盒内，再将盛滤器的瓷盒盖好盖子，用牛皮纸包扎。
4.2 用具的灭菌:
无特殊要求,请参照《卧式圆形压力蒸气消毒器SOP》操作。
4.3 洁净室的消毒及检测:
无特殊要求,请参照《洁净室清洁SOP》、《沉降菌取样SOP 》操作。
请参照商品干燥培养基使用说明书规定方法配制，测试其pH值,应符合规定,否则应校正。
5 细菌、霉菌及酵母菌计数
5.1 计数培养基的适用性检查
5.1.1 菌种:
⑴ 大肠埃希菌[CMCC(B)44102]
⑵ 金黄葡萄球菌[CMCC（B）26003]
⑶ 枯草芽胞杆菌[CMCC（B）63504]
⑷ 白念珠菌〔CMCC（F）98001〕
⑸ 黑曲霉〔CMCC（F）98003〕
5.1.2 菌液的制备：
5.1.2.1 接种大肠埃希菌、金黄葡萄球菌、桔草芽胞杆菌的新鲜培养物至营养肉汤中；接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，电热碗30-35℃培养18-24小时。
5.1.2.2 接种白念珠菌的新鲜培养物至改良马丁基培养基中，23-28℃培养24-48小时。
5.1.2.3 分别取上述菌悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至与5.1.4项下的菌液浊度标准管相同的浓度，然后作10倍系列稀释，制成50- 100cfu/ml的菌悬液。
5.1.2.3 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面基培养基上，23-28℃培养5-7天，加入3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释与5.1.4项下的菌液浊度标准管相同的浓度，然后作10倍系列稀释，制成每1ml含50- 100cfu的菌悬液。 5.1.3 菌液制备后若在室温下放置，应该在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。
5.1.4 菌液浊度标准管的配置
照下表，根据硫酸和氯化钡的比例来具体配置。
管 号 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
0.25%BaCl2（ml） | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.2 | 1.6 | 2.0 |
1%H2SO4(ml) | 9.8 | 9.6 | 9.2 | 8.8 | 8.4 | 8.0 |
细菌的近似浓度(×108/ml) | 1 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 |
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5.1.5 适用性试验
取大肠埃希菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备两个平皿，混匀，凝固，置30-35℃培养48小时，计数；取白念珠菌、黑曲霉各50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23-28℃培养72小时，计数；取白念珠菌50-100cfu，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23-28℃培养72小时，计数。同时用相应的对照培养基替
代被检培养基进行上述试验。
5.1.6 结果判定
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
5.2 计数方法的验证：
5.2.1 菌种及菌液的制备:
照5.1计数培养基的适用性检查项下的5.1.1及5.1.2.
5.2.1 验证方法
验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
5.2.1.1 试验组
平皿计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu牧草收割机试验菌，分别注入平皿
中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计算时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。
5.2.1.2 菌液组
测定所加的试液菌数。
5.2.1.3 供试品对照组
取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
5.2.1.4 稀释剂对照组
若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度，试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
5.2.3 结果判断
在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，若试验组的菌回收率（实验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率占）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数，若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。
5.3 检查法
5.3.1 供试品的处理:
5.3.1.1 不含抑菌成分供试品:
于无菌条件下，用无菌操作称取样品10g，置于装有100ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的
三角瓶中，充分振摇(LED路灯外壳可于≤45℃水浴中加热)，使成1:10的均匀混悬液。如为不易分散溶解的片剂，可先用乳钵研磨成粉末状，再加100ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1:10的均匀混悬液。
5.3.1.1 具抑菌活性的供试品:
供试品如有抑菌活性时，依5.3.1.1法制成1:10均匀混悬液，按下法处理后,依法检验。
（1） 稀释法：将供试液接种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。
（2） 薄膜过滤法：取规定量的供试液，置无菌生理盐水100ml中，摇匀, 无菌操作加入装有直径约50mm，孔径≤0.45±0.02μm微孔滤膜过滤器内, 减压抽干后, 用稀释剂冲洗滤膜3 次, 每次50～100ml，取出滤膜备查。
5.3.2 供试液的稀释：
5.3.2.1 用1ml无菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿试管壁缓缓加入备妥的9ml无菌氯化钠-蛋白
胨缓冲液中, 振摇试管使成均匀的1:100稀释液，以此类推，根据各检品的要求，制成1:1000；1:10000的供试液。
5.3.2.2 在作10倍递增稀释的同时，根据各检品的要求选择三个稀释级，以吸取该稀释液的吸管吸取该级稀释液1ml于灭菌的平皿内，每个稀释级作4个平皿（其中2个用于细菌检查，2个用于霉菌及酵母菌检查），同时每次应做2厌氧胶能用于木材吗个无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液阴性对照平皿。
5.3.3 培养及计数
5.3.3.1细菌总数的测定:
将灭菌后的营养琼脂培养基熔化，冷却至45℃，注入15-20ml至上述作细菌检查的平皿内，迅速、平稳地摇动平皿(按前,后左右及 圆形位置来回摇动), 使样品液与培养基充分混合均匀，放置待凝，将凝固之平板倒置于30-35℃恒温箱中培养3天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。低通滤波器设计
5.3.3.2 霉菌及酵母菌检查:
将灭菌后的虎红琼脂培养基熔化，冷却至45℃，注入15-20ml至上述作霉菌及酵母菌检查的平皿，迅速平稳地转动平皿，使样液与培养基充分混匀,放置待凝,将凝固之平板倒置于23-28℃生化培养箱中培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。
煤气阀
5.3.3.3 阴性对照试验
阴性平板上分别注入15-20ml营养琼脂培养基凝固后平板倒置30-35℃恒温箱中培养3天和15-20ml虎红琼脂培养基凝固后平板倒置于23-28℃生化培养箱中培养5天，均不得有菌生长。
6 控制菌检查
6.1 控制菌检查用培养基德适用性检查
6.1.1 菌种:
⑴ 大肠埃希菌[CMCC(B)44102]
⑵ 金黄葡萄球菌[CMCC（B）26003]
⑶ 乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）500904]
