TGF-βsignaling［J］.FASEB J，2020，34（7）：9207-9222.
［6］ALVAREZ-TEIJEIRO S，MENENDEZ S T，VILLARONGA M A.
Dysregulation of mir-196b in head and neck cancers leads to数字天线
pleiotropic effects in the tumor cells and surrounding stromal
fibroblasts［J］.Sci Rep，2017，7（1）：17785.
［7］ZHAO Y，QIAO W，WANG X，et al.14-3-3ζ/TGFβR1pro⁃motes tumor metastasis in lung squamous cell carcinoma［J］.
Oncotarget，2016，7（50）：82972-82984.
［8］AN Q，LIU T，WANG M Y，et al.KRT7promotes epithelial-mesenchymal transition in ovarian cancer via the TGF-β/Smad2/3
signaling pathway［J］.Oncol Rep，2020，45（2）：481-492.
［9］白雪莉，马涛，梁廷波.美国癌症联合委员会第8版胰腺癌分期系统更新简介及解读［J］.中国实用
外科杂志，2017，37（2）：146-148.
［10］武赞凯，杜恒锐，王振江，等.胰腺癌流行病学及诊治的研究进展［J］.中南大学学报（医学版），2017，42（6）：713-719.
［11］张贤彬，董鑫，闫玉梅，等.手术联合辅助与单纯手术可切除胰腺癌临床疗效的Meta分析［J］.中华消化外科杂志，2017，16（12）：1222-1228.
［12］LI N A，WANG W，XU B，et al.miR-196b regulates gastric can⁃cer cell proliferation and invasion via PI3K/AKT/mTOR signal⁃
ing pathway［J］.Oncol Lett，2016，11（3）：1745-1749.［13］SHAO L，CHEN Z，PENG D，et al.Methylation of the HOXA10 promoter directs mir-196b-5p-dependent cell proliferation and
invasion of gastric cancer cells［J］.Mol Cancer Res，2018，16
（4）：696-706.
［14］LI H，FENG C，SHI S.miR-196b promotes lung cancer cell migration and invasionthrough the targeting of GATA6［J］.Oncol
Lett，2018，16（1）：247-252.
［15］LEI Z，XU G，WANG L，et al.MiR-142-3p represses TGF-β-induced growth inhibition through repression of TGFβR1in non-
small cell lung cancer［J］.FASEB J，2014，28（6）：2696-2704.［16］MU Y，LI N，CUI Y L.The lncRNA CCAT1upregulates TGFβR1via sponging miR-490-3p to promote TGFβ1-induced
EMT of ovarian cancer cells［J］.Cancer Cell Int，2018，18：145.［17］WIMMER M，ZAUNER R，ABLINGER M，et al.A cancer stem cell-like phenotype is associated with miR-10b expression in
aggressive squamous cell carcinomas［J］.Cell Commun Signal，2020，18（1）：61-72.
［18］王小花，宋爽，韩瑞杰，等.TGF-β1诱导乳腺癌细胞上皮—间充质转化中相关miRNAs筛选［J］.现代肿瘤医学，2017，25（5）：676-680.
（收稿日期：2020-10-12）
台卡制作任传涛1，2，杨洪超1，武靖华1，李爱武3
1德州市人民医院，山东德州253000；2山东大学临床学院；
3山东大学齐鲁医院
摘要：目的观察先天性巨结肠症（HD）患儿病变结肠组织生长相关蛋白43（GAP-43）、肌细胞增强因子2（MEF2）表达变化，并探讨其临床意义。方法选择接受巨结肠切除手术的HD患儿41例，取手术切除的结肠组织，选取痉挛段无神经节细胞的结肠组织（病变结肠组织）、近端扩张段有神经节细胞的结肠组织（正常结肠组织），采用RT-qPCR法检测GAP-43、MEF2mRNA表达，采用Western blotting法和免疫组化法检测GAP-43、MEF2蛋白表达。比较病变结肠组织与正常结肠组织GAP-43、MEF2表达，并分析病变结肠组织GAP-43表达与MEF2表达的关系。结果病变结肠组织GAP-43、MEF2mRNA和蛋白相对表达量均低于正常结肠组织（P均<0.05）。光镜下，病变结肠组织与正常结肠组织黏膜下肌层和肌间神经细胞均可见GAP-43、MEF2阳性表达，病变结肠组织GAP-43、MEF2阳性染较少，而正常结肠组织阳性染较多。病变结肠组织GAP-43、MEF2阳性表达率均低于正常结肠组织（P均<0.05）。Spearman相关分析显示，病变结肠组织GAP-43mRNA和蛋白相对表达量与MEF2mRNA和蛋白相对表达量均呈正相关关系（P均<0.05）。结论HD患儿病变结肠组织GAP-43、MEF2低表达，并且二者表达呈正相关关系，二者可能共同参与HD的发病过程。
关键词：先天性巨结肠症；生长相关蛋白43；肌细胞增强因子2；儿童
doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2021.10.013
中图分类号：R726文献标志码：A文章编号：1002-266X（2021）10-0056-04
先天性巨结肠症（HD）又称肠管无神经节细胞症，是小儿消化道发育畸形中的常见疾病之一［1］。目前，HD的病因尚不明确，一般认为是由肠神经系统发育缺陷引起的［2］。有研究报道，多种参与肠神经系统分化、发育和突触形成的蛋白在HD病变结肠组织中表达异常，这些异常表达的蛋白可能在
通信作者：李爱武（E-mail：）56
HD发生、发展中起重要作用，但其具体机制尚不清楚［3］。生长相关蛋白43（GAP-43）是一种存在于神经突触前末端的生长相关蛋白，与神经突触生长、神经系统发育以及神经再生关系密切［4］。肌细胞增强因子2（MEF2）是一种调控肌肉形成和发育的核转录因子，在肌肉组织中广泛表达。近年研究发现，MEF2在神经系统中亦大量存在，具有调控突触形成和神经元成熟等生物学功能［5］。有研究认为，GAP-43、MEF2异常表达可能与包括HD在内的肠神经系统疾病密切相关［6-7］。但目前国内外关于HD患儿病变组织GAP-43、MEF2表达变化的报道较少。为此，本研究观察了HD患儿病变结肠组织GAP-43、MEF2表达变化，并探讨其临床意义。现报告如下。1资料与方法
1.1临床资料选择2018年1月—2020年1月德州市人民医院收治的HD患儿41例（观察组）。所有患儿符合《新生儿先天性巨结肠的诊断与》［8］中的诊断标准，并经术后组织病理学检查明确诊断。纳入标准：①符合HD诊断标准；②接受巨结肠切除手术；③术前未接受任何。排除标准：①合并其他消化道畸形者；②非足月患儿。其中，男32例、女9例，年龄（1.58±0.44）岁。本研究经德州市人民医院医学伦理委员会批准，所有患儿监护人知情同意并签属知情同意书。
1.2GAP-43、MEF2mRNA表达检测采用RT-qPCR 法。取手术切除的结肠组织，液氮速冻后转运至-80℃冰箱保存。选取痉挛段无神经节细胞的结肠组织（病变结肠组织）、近端扩张段有神经节细胞的结肠组织（正常结肠组织）各约100mg，采用TRIzol法提取组织总RNA，经UV1901型紫外分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.7～
2.0，经琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA完整，可用于后续实验。分别取总RNA1μg，按PrimeScript TM RT Reagent Kit说明将总RNA反转录为cDNA。反转录条件：37℃15min，85℃5s。以cDNA为模板，按SYBR®Premix EX Taq TMⅡ试剂盒说明进行PCR扩增。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。引物序列：GAP-43上游引物5'-CTGACCAAGAACATGCCT⁃GA-3'，下游引物5'-GGGACTTCAGAGTGGAGCTG-3'；MEF2上游引物5'-CCGACTGCCTACAACACT⁃GA-3'，下游引物5'-GATAACTGCCCTCCAGCAAC-3'；β-actin上游引物5'-AGACCTGTACGCCAACA⁃CAG-3'，下游引物5'-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3'。PCR反应体系共25μL：cDNA模板2μL，上下游引物各1μL，
SYBR®Premix Ex Taq TMⅡ12.5μL，无酶水8.5μL；反应条件：95℃变性12s，55℃退火12s，72℃延伸15s，共45个循环。以β-actin为内参，采用2－ΔΔCT法计算GAP-43、MEF2mRNA相对表达量。实验重复3次，取平均值。
1.3GAP-43、MEF2蛋白表达检测①采用Western blotting法。取病变结肠组织和正常结肠组织各约100mg，液氮下研磨成粉末，组织裂解液充分裂解，离心提取组织总蛋白。经BCA法蛋白定量合格后，加入上样缓冲液，100℃水浴变性。取变性蛋白约30μg，SDS-PAGE分离蛋白。电泳结束，将蛋白电泳产物电转印至PVDF膜。然后将PVDF膜用5%脱脂牛奶室温封闭2h，分别加入GAP-43（稀释比为1∶1000）、MEF2（稀释比为1∶1000）、GAPDH（稀释比为1∶2000）一抗，4℃孵育过夜。次日，加入HRP 标记的IgG二抗（稀释比为1∶1000），室温孵育1h，ECL发光，暗室中曝光、显影。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。②免疫组化法。取新鲜的病变结肠组织和正常结肠组织，10%中性甲醛固定24h，常规脱水、透明和石蜡包埋，4μm厚连续切片。切片常规脱蜡、水化，微波修复抗原，室温下孵育10min，分别加入鼠抗人GAP-43、MEF2多克隆抗体，室温孵育过夜。次日，再滴加相应的二抗，室温孵育30min。DAB显，苏木精复染，中性树胶封固。以PBS代替一抗作为阴性对照。采用双盲法由两位经验丰富的病理科医师独立阅片，结果不一致时协商统一。GAP-43、MEF2阳性染定位于细胞质或细胞核，呈棕黄或棕褐颗粒状。以染强度和阳性细胞比例综合评价。染
强度评分标准：无为0分，浅黄为1分，黄为2分，棕褐为3分；阳性细胞比例评分标准：<5%为0分，5%～<25%为1分，25%～<50%为2分，50%～>75%记为3分，75%以上为4分。两项评分相加>2分为阳性表达。
1.4统计学方法采用SPSS2
2.0统计软件。计量资料以xˉ±s表示，结果比较采用独立样本t检验。相关性分析采用Spearman相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
酒精增稠剂2.1病变结肠组织与正常结肠组织GAP-43、MEF2表达比较见表1。
2.2病变结肠组织与正常结肠组织免疫组化染结果光镜下，病变结肠组织与正常结肠组织黏膜下肌层和肌间神经细胞均可见GAP-43、MEF2阳性表达，病变结肠组织GAP-43、MEF2阳性染较少，
57
表1
病变结肠组织与正常结肠组织GAP -43、MEF2mRNA 和蛋白相对表达量比较（-x ±s ）
组织类型病变结肠组织正常结肠组织
n 4141
GAP -43
mRNA
0.70±0.25*0.94±0.33
蛋白1.68±0.49*
2.24±0.46MEF2
mRNA
0.05±0.01*0.13±0.04
蛋白0.34±0.09*
0.44±0.12注：与正常结肠组织比较，*
P <0.05。
而正常结肠组织阳性染较多，见图1。病变结肠组织与正常结肠组织GAP -43阳性表达率分别为29.27%（12/41）、73.17%（30/41），MEF2阳性表达率分别为24.39%（10/41）、63.41%（26/41）。病变结肠组织GAP -43、MEF2阳性表达率均低于正常结
肠组织（P 均<0.05）。
2.3病变结肠组织GAP -43表达与MEF2表达的关
系
Spearman 相关分析显示，病变结肠组织GAP -
43mRNA 相对表达量与MEF2mRNA 相对表达量呈正相关关系（r =0.634，P <0.05），GAP -43蛋白相对表达量与MEF2蛋白相对表达量亦呈正相关关系（r =0.543，P <0.05）。3
来电显示电话机讨论
HD 是一种比较常见的先天性肠神经系统发育
畸形，在新生儿中的发病率为0.02%～0.05%，并且存在性别差异，男女之比约为4∶1。如果不及时，易在新生儿期并发小肠炎，严重者常常因中毒性
休克而死亡［9-10］。HD 最基本的病理变化是病变肠段肌肉和黏膜下层神经节细胞缺如。消化道肠管内神经节细胞是由外胚层的神经嵴细胞发育而来，在胚胎期6～12周，神经嵴细胞沿头尾向消化道壁移行形成神经节，且分化成不同亚型进入肠道神经元。肠道神经元的生存依赖于肠道演化过程中所提供的微环境，当微环境发生改变时，神经嵴细胞移行停顿，神经节生成受限，无神经细胞节段延长［11］。目前，造成肠道神经元发育停顿的机制尚不明确，可能是由多个基因的累加效应引起的［12］。
GAP -43是目前研究较多的一类神经营养因子，
在促进神经突触生长、神经系统发育以及神经再生等方面具有重要作用。有研究报道，肠神经系统中GAP -43表达降低时，其传递的肠神经系统抑制性神经递质相应减少，从而引起抑制性神经减弱、兴奋性
神经增强，导致肠管收缩增强，从而引起HD ［13-14］。此外，肠道蠕动依赖神经细胞与平滑肌细胞的连接，突触则是两者连接的根本结构，而肠神经系统中存在大量的突触，故突触异常也是导致肠道功能障碍的重要因素。毕佳琦等［15］研究发现，上调突触可塑性相关蛋白GAP -43表达，能够激活PI3K /PTEN /AKT 信号途径，促进大鼠肠道突触修复，由此认为GAP -43低表达可导致抑制性神经递质减少，神经分
化受限、突触结构异常，继而导致神经与肠壁的连接受限，神经化学信号传导异常，从而导致HD 的发生。本研究结果发现，病变结肠组织GAP -43mRNA 和蛋白表达均低于正常结肠组织，提示GAP -43低表达能够促进HD 的发生、发展。
MEF2为MDAS -box 转录因子家族中的一种转
录调节因子，在脊椎动物中含有4种亚型：MEF2A 、MEF2B 、MEF2C 、MEF2D 。MEF2可通过激
活MAPK 、PKC 等多条信号通路对细胞增殖和分化进行调节［16］。以往对MEF2的研究多围绕生肌过程，
在骨骼肌、心肌、平滑肌的发育过程中介导细胞的分化。近年研究发现，MEF2在神经系统发育过程中亦具有重要作用，特别是在中枢神经系统的神经细胞中，MEF2的4种类型均高表达［17］。雷颉等［18］研究发现，MEF2C 在胶质母细胞瘤中高表达，故认为MEF2可能与神经细胞的功能或分化程度密切相关。本研究结果发现，病变结肠组织MEF2mRNA
和蛋白表达均低于正常结肠组织，提示MEF2低表达能够促进HD 的发生、发展。
GAP -43、MEF2在神经发育过程中均具有重要作
用。本研究在HD 患儿病变结肠组织中发现GAP -43、MEF2均阳性表达，并且病变结肠组织GAP -43
、
注：A 为正常结肠组织GAP -43阳性染，B 为病变结肠组织GAP -43阳性染，C 为正常结肠组织MEF2阳性染，D 为病变结肠组织MEF2阳性染。
图1病变结肠组织与正常结肠组织GAP -43、MEF2阳性染情况（免疫组化染，100×）
58
MEF2阳性表达率均低于正常结肠组织。笔者认为GAP-43、MEF2表达降低可导致神经嵴细胞沿消化道壁移行受阻，从而促进了HD的发生［19］。Spear⁃man相关分析显示，病变结肠组织GAP-43mRNA和蛋白相对表达量与MEF2mRNA和蛋白相对表达量均呈正相关关系，提示GAP-43、MEF2可能共同参与HD的发病过程。
综上所述，HD患儿病变结肠组织GAP-43、MEF2低表达，并且二者表达呈正相关关系，二者可能共同参与HD的发病过程。但由于本研究样本量较小，也没有直接证实GAP-43、MEF2与神经信号传导的关系，故其结论仍需进一步验证。
参考文献：
［1］GUNNARSDOTTIR A，WESTER T.Modern treatment of Hirschsprung's disease［J］.Scand J Surg，2011，100（4）：243-249.
［2］HEUCKEROTH R O.Hirschsprung disease-integrating basic sci⁃ence and clinical medicine to improve outcomes［J］.Nat Rev Gas⁃
troenterol Hepatol，2018，15（3）：152-167.
［3］陈钦明，吴凯，王健俊，等.先天性巨结肠组织中SOX-10、GDNF表达及意义［J］.医学临床研究，2019，36（2）：227-
229，233.
［4］KAWASAKI A，OKADA M，TAMADA A，et al.Growth cone phosphoproteomics reveals that GAP-43phosphorylated by JNK
is a marker of axon growth and regeneration［J］.iScience，2018，4：190-203.
［5］MOREIRA M D，BREHMER A，DE OLIVEIRA E C，et al.
Regenerative process evaluation of neuronal subclasses in chagas⁃
ic patients with megacolon［J］.Hum Immunol，2013，74（2）：181-188.
［6］李力，金先庆，滕银平，等.先天性巨结肠患儿肠道组织内DPF3、Smarcd3和MEF2的表达［J］.中华小儿外科杂志，2016，37（4）：262-266.
［7］朱林，陶凯，冯达云，等.MEF2A在创伤后应激障碍小鼠内侧前额叶皮质中的变化及功能研究［J］.中华神经医学杂志，2020，19（3）：247-252.
［8］夏慧敏，余家康，钟微，等.新生儿先天性巨结肠的诊断与［J］.中华普通外科杂志，2003，18（11）：660-662.
［9］谢崇，潘伟康，高亚，等.我国大陆地区先天性巨结肠症诊疗情况调查［J］.中华小儿外科杂志，2018，39（6）：411-418.
［10］SREEDHER G，GARRISON A，NOVAK R，et al.Congenital intestinal hypoganglionosis：a radiologic mimic of Hirschsprung′s
disease［J］.Radiol Case Rep，2018，14（2）：171-174.
［11］费贵军，胡福境，樊文娟，等.便秘型肠易激综合征大鼠结肠黏膜下神经元的变化［J］.基础医学与临床，2018，38（9）：1239-
1243.
［12］莫优炼，杨六成，胡小华，等.不同年龄段先天性巨结肠患儿齿状线上神经节细胞、神经纤维分布的意义［J］.现代医学，2018，46（10）：1093-1098.
［13］RAMOS-ALVAREZ I，JENSEN R T.P21-activated kinase4in pancreatic acinar cells is activated by numerous gastrointestinal
hormones/neurotransmitters and growth factors by novel signal⁃
ing，and its activation stimulates secretory/growth cascades［J］.
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2018，315（2）：G302-
G317.
［14］张双喜，张相安，安永康.济川煎对老年慢性功能性便秘患者胃肠功能、血清肠神经递质及肠道菌的影响［J］.中国实验
方剂学杂志，2018，24（22）：169-174.
［15］毕佳琦，陈崇，李政，等.基于PI3K/PTEN/AKT信号途径探讨褪黑素对脊髓损伤大鼠突触可塑性的影响［J］.现代生物医学
进展，2019，19（6）：1001-1005.
［16］DI GIORGIO E，HANCOCK W W，BRANCOLINI C.MEF2and the tumorigenic process，hic sunt leones［J］.Biochim Biophys
Acta Rev Cancer，2018，1870（2）：261-273.
［17］卢丽娜，梁赵文，罗建华，等.益母草碱对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大p38MAPK信号通路和miRNA-1表达的影响
［J］.中国实验方剂学杂志，2019，25（3）：81-86.
［18］雷颉，蔡峰，逯芳芳，等.肌细胞增强因子2C在胶质母细胞瘤中表达及其影响研究［J］.神经解剖学杂志，2018，34（2）：170-174.
［19］蒋锐达，赵敏，赵三军，等.胚胎发育中神经嵴细胞迁移机制的研究进展［J］.基因组学与应用生物学，2018，37（9）：3799-
3809.
（收稿日期：2020-10-20）
《山东医药》杂志诚邀审稿专家
《山东医药》是山东省卫生健康委员会主管、山东省立医院主办的综合性医学学术期刊，1957年创刊，
旬刊，ISSN1002-266X，CN37-1156/R，邮发代号24-8。现为中国科技核心期刊、中国生物医学核心期刊、RCCSE中国核心学术期刊、《中国学术期刊影响因子年报》统计源期刊等，连续多次入选《中文核心期刊要目总览》，2020期刊影响力指数（CI）1014.395、排序4/212，位于Q1区，期刊即年影响因子1.136。
随着我国医学科研水平不断提升，医学论文的科研设计、统计分析愈加复杂，《山东医药》的自然投稿量持续增加，导致目前在库审稿专家的审稿工作量越来越大。为了严格执行同行评议制度，保证期刊学术质量，规范学者学术行为，进一步充实审稿专家队伍，现面向全国公开招聘审稿专家，诚邀您的加入。：0531-********/88516158/88581200，E-mail：sdyy_************。
59
