《中国癌症杂志》2019年第29卷第1期 CHINA ONCOLOGY 2019 Vol.29 No.1
19
欢迎关注本刊·论 著·
基金项目：2015年河南省医学科技攻关计划项目（201504H013）。通信作者：魏 蔚 E-mail:
LncRNA ANCR调控miR-331表达影响胃癌 细胞的生物学行为 刘玉华1，魏 蔚1，崔淑萍2
1.平顶山学院医学院，河南 平顶山 467000；
2.河南省肿瘤医院胸外科，河南 郑州 450008
［摘要］ 背景与目的：胃癌是导致癌症死亡的第二大原因，是东亚、东欧及中南美洲部分地区最常见的胃肠道恶性肿瘤。该研究旨在探讨长链非编码RNA （long-chain noncoding RNA ，lncRNA ）抗分化非编码RNA （antidifferentiation noncoding RNA ，ANCR ）靶向miR-331调节胃癌细胞的增殖、侵袭行为
及其机制。方法：河南省肿瘤医院2016年1月1日—2016年12月1日获得60例临床胃癌样本和20例对应的癌旁组织标本（距癌组织2 cm ）。实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ，RTFQ-PCR ）检测ANCR 在胃癌组织和不同胃癌细胞株中的表达情况；分析ANCR 的表达和胃癌患者临床病理学特征之间的关系；平板克隆实验检测ANCR 对胃癌细胞增殖能力的影响；Transwell 侵袭实验检测ANCR 对胃癌细胞侵袭能力的影响；裸鼠成瘤实验检测ANCR 对胃癌细胞肿瘤异种移植的影响；双荧光素酶报告基因检测ANCR 与miR-331之间的相互作用。结果：胃癌组织中ANCR 的表达（4.18±0.28）高于正常组织（1.45±0.15），差异有统计学意义（t =12.36，P =0.045）；与其他胃癌细胞株相比，BGC-823和MGC-803细胞中ANCR 的表达水平较高（9.12±0.52），差异有统计学意义（P =0.019）；抑制ANCR 的表达可以减弱胃癌细胞的增殖能力（98.8±10.4）和侵袭能力（175.9±5.7）；抑制ANCR 的表达后胃癌细胞在裸鼠体内异种移植能力（223.4±13.4）弱于NC 组（115.6±10.7），差异有统计学意义（t =13.28，P =0.014）；双荧光素酶实验证实ANCR 可以直接调控miR-331的表达及荧光活性。结论：ANCR 可以靶向调节miR-331的表达影响胃癌细胞的增殖、侵袭行为，影响胃癌细胞在裸鼠体内的生长情况。［关键词］抗分化非编码RNA ；miR-331；胃癌；增殖；侵袭DOI: 10.ki.1007-3639.2019.01.003
pttptt中图分类号：R735.2 文献标志码：A 文章编号：1007-3639(2019)01-0019-07
LncRNA ANCR regulates the biological behavior of gastric cancer cells through miR-331 expression
LIU Yuhua 1, WEI Wei 1, CUI Shuping 2 (1. School of Medicine ，Pingdingshan University, Pingdingshan 467000, Henan Province, China; 2. Department of Thoracic Surgery, Henan Cancer Hospital, Zhengzhou 450008, Henan Province, China)
Correspondence to: WEI Wei E-mail:
［Abstract ］ Background and purpose: Gastric cancer is the second leading cause of cancer death. It is the most common gastrointestinal malignant tumor in East Asia, Eastern Europe and parts of Central and South America. This study aimed to explore the role of long-chain noncoding RNA (lncRNA) antidifferentiation noncoding RNA (ANCR) targeting miR-331 in regulating the proliferation and invasion of gastric cancer cells and its mechanism. Methods: Sixty cases of clinical gastric cancer samples and 20 cases of corresponding non-tumor tissue specimens were collected in Henan Cancer Hospital from January 1, 2016 to December 1, 2016. The expression levels of ANCR in gastric cancer tissues and different gastric cancer cell lines were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR). The relationship between the expression of ANCR and the clinicopathological features of gastric cancer patients was analyzed. The effect of ANCR on the proliferation of gastric cancer cells was detected by plate clone assay. Transwell assay was used to detect the effect of ANCR on the invasiveness of gastric cancer cells. T
umor formation assay in nude mouse models detected effect of ANCR on xenograft. The dual luciferase reporter assay detected the interaction between ANCR and miR-331. Results: The expression of ANCR in gastric cancer tissues was significantly
20
胃癌是导致癌症死亡的第二大原因［1］，是东亚、东欧及中南美洲部分地区最常见的胃肠道恶性肿瘤［2］。尽管诊断手术技术和新型分子靶向药物有了较快的发展，但胃癌患者的5年总生存率仍较低［3-4］。长链非编码RNA （long-chain noncoding RNA ，lncRNA ）抗分化非编码RNA （antidifferentiation noncoding RNA ，ANCR ）是调节性RNA 成员之一，长度大于200个核苷酸，并且不具有蛋白质编码能力［5-6］。有研究表明，lncRNA ANCR 参与广泛的生物学过程，其失调涉及多种人类疾病的发生、发展［7-8］。本研究通过对胃癌组织和细胞株的研究，探讨其对胃癌进展和体内转移的影响及其机制。
1 材料和方法
1.1 细胞培养和临床标本
人胃癌细胞系BGC-823、MGC-803、AGS 、SGC-7901和正常胃上皮细胞GES-1购自武汉大学中国
典型培养物保藏中心，胃癌细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM 培养基中培养，正常胃上皮细胞在1∶1混合精制的KSFM 培养基中培养。河南省肿瘤医院2016年1月1日—2016年12月1日获得60例临床胃癌样本和20例对应的癌旁组织标本（距癌组织2 cm ）。患者年龄38~74岁，中位年龄59岁。si-ANCR 和si-NC （阴性对照）购自上海吉玛制药技术有限公司。患者参与前均签署知情同意书，标本收集符合伦理委员会的要求（伦理编号：SYXK （豫）2015－0009）。
1.2 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）分析
上海吉玛制药技术有限公司设计A N C R
higher than that in normal tissues (4.18±0.28 vs 1.45±0.15, t =12.36, P =0.045). Compared with other gastric cancer cell lines, the expression levels of ANCR in BGC-823 and MGC-803 cells were significantly higher (9.12±0.52, t =14.51, P =0.019). Inhibiting the expression of ANCR attenuated the proliferation (98.8±10.4) and invasive ability (175.9±5.7) of the gastric cancer cells. The ability of gastric cancer cells to form xenograft in nude mice was inhibited by suppressing the expression of ANCR (223.4±13.4 vs 115.6±10.7, t =13.28, P =0.014). Dual luciferase assay results confirmed that ANCR could directly regulate the expression of miR-331 and its fluorescence activity. Conclusion: A
NCR can regulate the expression of miR-331 and affect the proliferation and invasion of gastric cancer cells.
［Key words ］ Antidifferentiation noncoding RNA; miR-331; Gastric cancer; Proliferation; Invasion
引物的正义链：ACAGGACTCCATGGCAA ACG ，反义链：ATGAAGAAAGCCTGGTGC A G T ；G A P D H 的正义链：A C C A C A G T C C ATGCCATCAC ，反义链：TCCACCACCCT GTTGCTGTA 。使用TRIzol 试剂从组织或细胞中分离总RNA ，并按照制造商的说明书用反转录酶［购自宝生物工程（大连）有限公司］和寡核苷酸（dT ）合成cDNA 。使用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒进行RTFQ-PCR 。RTFQ-PCR 的条件如下：94 ℃ 10 s ；94 ℃ 5 s ，52 ℃ 30 s 退火，72 ℃ 15 s ，40个循环。1.3 平板克隆实验
蒸压砖设备 将胃癌细胞以5×103个细胞/孔的密度接种到6孔板上并再培养2周，中间每隔1周更换新鲜培养液，2周后使用考马斯亮蓝染细胞形成菌落，并在显微镜下计数，对比两组之间的差距。1.4 Transwell侵袭试验
将胃癌细胞转染后24 h ，将无血清培养基中的1×105个细胞接种在Transwell 迁移室中。Transwell 的上室用基质胶涂覆。含有20%胎牛血清的培养基加入到下室中。24 h 后，用棉绒除去未侵入的细胞。位于小室下表面的侵袭性细胞用结晶紫染液染，然后用显微镜计数并统计。1.5 荧光素酶报
告基因测定
从正常人基因组D N A 扩增含有l n c R N A ANCR 互补位点的miR-331，并克隆到荧光素酶报告基因载体psi-CHECK 载体中，将该结合位点作为miR-331野生型。使用miR-331突变体重组质粒。在转染不同质粒组合后48 h ，根据制造商的说明使用双荧光素酶测定试剂盒检测荧光素酶活性，共转染的海肾荧光素酶质粒用作确定转染效率的内部对照，使用双荧光素酶报告分析系统检测荧光强度。实验重复
刘玉华，等 LncRNA ANCR调控miR-331表达影响胃癌细胞的生物学行为低压注塑热熔胶
《中国癌症杂志》2019年第29卷第1期
21
3次。miR-331克隆的引物如下：5’-GCTCTAG AGCTTCGGCTGGGACCTT-3’；3’-ATAAG AATGCGGCCGCGGGCCTCTTCTG-5’。1.6 裸鼠肿瘤异种移植模型
从河南中医药大学第一附属医院购买12只雌性裸鼠，在SPF 级屏障系统中饲养［SYXK （豫）2017—0001］。将1×106浓度的si-NC 组和ANCR-si 组MGC-803细胞分别注射到12只4周龄裸鼠的腋窝中。饲养5周后检测裸鼠肿瘤异种移植物的体积和质量生长情况。异体移植物大小根据以下公式测量：
体积=1/2（最短直径）2×（最长直径）。1.7 统计学处理
用SPSS 17.0对记录数据进行统计学分析，计量资料以x±s 表示，采用Student’s t 检验进行分
梭式止回阀表 1 LncRNA ANCR在不同组织与细胞株中的表达情况Tab. 1 Expression of lncRNA ANCR in different tissues and cell lines
Item Expression c B /(μmol·L -1)
t value P value Tissue
12.36
0.045
Normal tissues adjacent to cancer 1.45±0.15Gastric cancer tissue 4.18±0.28
Cell line
12.96
0.024
Tumor cell lines (BGC-823, MGC-803, AGS and SGC-7901)8.36±0.21Normal gastric epithelial cell GES-1 3.26±0.19
Tumor cell line
14.51
0.019
BGC-823, MGC-803 cell lines 9.12±0.52Other cell lines (AGS, SGC-7901)
4.32±0.24析；所有数据符合正态分布检验，计数资料采用χ2检验进行分析，P <0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 LncRNA ANCR在胃癌组织和细胞株中的 表达
RTFQ-PCR 结果见表1，lncRNA ANCR 在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（t =12.36，P =0.045）；LncRNA ANCR在肿瘤细胞株中的表达显著高于正常胃上皮细胞GES-1
（t =12.96，P =0.024），而且lncRNA ANCR在BGC-823和MGC-803细胞中的表达高于其他细胞株（t =14.51，P =0.019）。所以本研究选择lncRNA ANCR 表达较高的BGC-823和MGC-803细胞做进一步实验。
2.2 LncRNA ANCR的表达与胃癌患者临床病理资料的相关性
本研究分析了60例胃癌患者的临床病理资料及其lncRNA ANCR 的表达，结果见表2，ANCR 的表达水平以所收集数据总体水平的70%为对应分界线，分为高表达和低表达。在肿瘤体积、临床病理分期及淋巴结转移与否上，患者的lncRNA ANCR 表达差异有统计学意义（P 均<0.05）。2.3 LncRNA ANCR对胃癌细胞株MGC-803和BGC-823增殖能力的影响
本实验通过平板克隆实验检测l n c R N A ANCR 对胃癌细胞MGC-803与BGC-823增殖能
力的影响。在MGC-803细胞中，si-ANCR 组的细胞克隆数（98.8±10.4）显著少于si-NC 组（175.9±5.7），差异有统计学意义（t =14.16，P =0.013，图1A ）。类似的结果在BGC-823细胞中也得到证实，si-ANCR 组的细胞克隆数（67.3±9.2）显著也少于si-NC 组（142.1±6.6），差异有统计学意义（t =11.93，P =0.026，图1B ）。这提示lncRNA 能促进胃癌细胞株MGC-803和BGC-823的增殖。
2.4 LncRNA ANCR对胃癌细胞株MGC-803和BGC-823侵袭能力的影响
Transwell 侵袭结果显示，在MGC-803细
22
表 2 LncRNA ANCR的表达与胃癌患者临床病理特征的关系
Tab. 2 Relationship between LncRNA ANCR expression and clinicopathological features of gastric cancer patients
Clinicopathological feature N
High expression of ANCR n (%)
Low expression of ANCR n (%)
χ2P value Gender 0.06
0.809
Male 3215 (46.88)17 (53.12)Female 28
14 (50.00)
14 (50.00)
Age/year 0.49
0.484
≤602512 (48.00)13 (52.00)>60
35xoy2
20 (57.14)
15 (42.86)
Tumor volume V /cm 3
14.36
<0.001
≤21915 (78.95) 4 (11.05)>241
燃料乙醇
11 (26.83)
30 (73.17)
Clinical staging 0.015
Ⅰ13 6 (46.15)7 (53.85)Ⅱ108 (80.00) 2 (20.00)Ⅲ3226 (81.25)7 (18.75)Ⅳ
5
4 (80.00)
1 (20.00)
Lymph node metastasis 5.28
0.022
Without 2411 (45.83)13 (54.17)With
36
27 (75.00)
9 (25.00)
图1 LncRNA ANCR对胃癌细胞株MGC-803与BGC-823增殖能力的影响
Fig. 1 Effect of lncRNA ANCR on the proliferation of gastric cancer cell lines MGC-803 and BGC-823
A: Effect of LncRNA ANCR on the number of MGC-803 cell clones; B: Effect of LncRNA ANCR on the number of BGC-823 cell clones; **: P
<0.05
刘玉华，等 LncRNA ANCR调控miR-331表达影响胃癌细胞的生物学行为
《中国癌症杂志》2019年第29卷第1期
23
胞中，si-NC 组通过Matrigel 基质胶的细胞数量为（231.5±23.2），明显多于si-ANCR 组（165.4±81.1），差异有统计学意义（t =13.64，P =0.028，图2A ），提示抑制lncRNA ANCR 的表达可以减弱胃癌MGC-803细胞的侵袭能力；在BGC-823细胞中，si-NC 组（223.4±13.4）的细胞侵袭能力也显著高于s i -A N C R 组（115.6±10.7），差异有统计学意义（t =13.28，P =0.014，图2B ），提示lncRNA ANCR 能提升胃癌细胞株MGC-803和BGC-823的侵袭能力。2.5 LncRNA ANCR对裸鼠成瘤的影响
通过裸鼠成瘤实验检测LncRNA ANCR 对
裸鼠成瘤的影响（图3A ）。5周后裸鼠内移植瘤的重量与NC 组［（1.52 ±0.14）g ］相比， s i -A N C R 组的裸鼠体内肿瘤的质量［（0.61±0.11）g ］缩小，差异有统计学意义（t =12.32，P =0.043，图3B ）；si-ANCR 组的肿瘤体积的增长［（1.58±0.21）cm 3］也随着时间的推进小于si-NC 组［（0.63±0.09）cm 3］，差异有统计学意义（t =13.31，P =0.016，图3C ）。结果表明，抑制ANCR 的表达后在裸鼠体内肿瘤抑制模型得到同样的实验验证，抑制ANCR 后可以
有效减少胃癌细胞在体内的增殖。
图 2 LncRNA ANCR对胃癌细胞株MGC-803与BGC-823侵袭能力的影响
Fig. 2 Effect of lncRNA ANCR on the invasion of gastric cancer cell lines MGC-803 and BGC-823
A: Effect of lncRNA ANCR on invasion ability of MGC-803 cells (×40); B: Effect of lncRNA ANCR on invasion ability of BGC-823 cells (×40); **: P <0.05
图 3 LncRNA ANCR 对裸鼠成瘤的影响
Fig. 3 Effect of lncRNA ANCR on tumor formation in nude mice
A: Effect of lncRNA ANCR on tumor formation in nude mice; B: Comparison of tumor quality between si-NC group and si-ANCR group; C: Effect of lncRNA ANCR on tumor volume in nude mice; **: P <0.05
