基础研究
Expression of lncRNA-XIST in acute ischemia-reperfusion kidney
injury of mice
LI Huan,GUO Tao,WANG Pengbo *
(the Second People's Hospital of Shaanxi Province,Xi'an 710005,China)
ABSTRACT:Objective To investigate the expression of long non -coding RNA -X inactivation specific transcript (lncRNA-XIST)in acute ischemia-reperfusion kidney injury (AIKI)of mice.Methods A total of 90clean grade male C57mice were selected and randomly divided into control group,model group and experimental group,with 30cases in each group.The model group and the experimental group established the AIKI model according to international standards.After the successful modeling,the experimental group was injected with lncRNA -XIST siRNA.After 2weeks of lncRNA-XIST siRNA expression,5mice were killed at 2,24,48,72h and on 7,14d respectively.The expression level of lncRNA-XIST in the renal tissue of mice was detected by real-time quantitative PCR.The blood urea nit
rogen (BUN)and serum creatinine (Scr)levels were detected at 48and 72h after 2weeks of lncRNA -XIST siRNA expression.
Results In the renal cortex and renal medulla,the expression levels of lncRNA-XIST in the model group at 2,24,48,72h and on 7,14d were higher than those in the control group (P <0.05).In the renal cortex,the expression level of lncRNA-XIST was increasing from the 24th h.The BUN and SCr levels in the model group were higher than those in the control group and the experimental group at 48and 72h,and the differences were statistically significant (P <0.05);the BUN and Scr levels in the experimental group were higher than those in the control group at 48and 72h,and the differences were statistically significant (P <0.05).Conclusion lncRNA -XIST is highly expressed in AIKI mice renal tissue,especially in renal cortex.Down regulation lncRNA-XIST can delay early acute renal injury.
KEYWORDS:long chain non-coding RNA-X inactivation specific transcripts;acute ischemia-reperfusion kidney injury;serum creatinine
lncRNA-XIST 在小鼠急性缺血再灌注肾损伤中的 李欢，郭涛，王鹏波
*
去毛刺工具（陕西省第二人民医院，陕西西安，710005）
DOI :10.ki.2096-1413.202118004
作者简介：李欢（1989-），女，汉族，陕西大荔人，主治医师，硕士。研究方向：腹膜纤维化、肾性贫血相关铁代谢。*通讯作者：王鹏波，E -mail :
摘要：目的探讨长链非编码RNA-X 染体失活特异转录本（lncRNA-XIST ）在小鼠急性缺血再灌注肾损伤（AIKI ）
中的表达情况。方法选取清洁级雄性C57小鼠90只，将其随机分为对照组、模型组与实验组，各30只。模型组与实验组均根据国际标准建立小鼠AIKI 模型，实验组建模成功后注射干扰腺相关病毒lncRNA-XIST siRNA 。于lncR -NA-XIST siRNA 表达2周后的第2、24、48、72小时及第7、14天各处死5只小鼠，采用实时定量PCR 法检测小鼠肾组织中lncRNA-XIST 的表达水平，于lncRNA-XIST siRNA 表达2周后的第48、72h 检测小鼠的血尿素氮（BUN ）及血肌酐（Scr ）水平。结果在肾皮质及肾髓质中，模型组第2、24、48、72小时及第7、14天的lncRNA-XIST 表达水平均高于对照组（P <
0.05）。在肾皮质中，从第24小时开始，lncRNA-XIST 表达水平呈不断升高趋势。模型组第48、72小时BUN 、Scr 水平高于对照组及实验组，差异具有统计学意义（P <0.05）；实验组第48、72小时血清BUN 、Scr 水平高于对照组，差异具有统计学意义（P <0.05）。结论lncRNA-XIST 在AIKI 小鼠肾组织中高表达，特别是在肾皮质中，下调lncRNA-XIST 有助于延缓早期急性肾损伤。关键词：长链非编码RNA-X 染体失活特异转录本；急性缺血再灌注肾损伤；血肌酐中图分类号：R774文献标志码：A 文章编号：2096-1413(2021)18-0010-03
急性缺血再灌注肾损伤（AIKI ）的病理特征为肾小管上皮细胞损伤、炎症与血管功能障碍[1]。研究表明，长链非编码RNA （lncRNA ）可调控多种疾病的进展，其是一种有别于microRNA 的分子，长度大于200nt ，保守性较低[2-4]。研究证实，lncRNA-X 染体失活特异转录本（lncRNA-XIST ）基因位于染体8q24.21上，其不仅可参与调控食
管癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、宫颈癌等多种疾病[5-6]，还可通过microRNA-93-5p 介导抑制CDKN1A 表达，进而抑制糖尿病肾病肾间质纤维化[7]。体外实验一般选用动物模型，具有取样方便、可快速检测等特点。RNA 在离体组织中降解较快，若收集临床样本，一是患者肾组织样本不易采集，二是一般取到的活检样本为肾皮质，取到髓质的概率较小。
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临床医学研究与实践2021年6月第6卷第18期
表2两组小鼠肾髓质中不同时间点lncRNA-XIST 的表达水平比较
（n=5，x ⎺
±s ）组别
第2小时第24小时第48小时第72小时
第7天
第14天
对照组1.00±0.04 1.13±0.06 2.56±1.12 1.01±0.14 3.61±0.13 4.57±2.06模型组4.57±0.15*4.31±1.48*4.21±1.10*4.23±1.46*5.93±2.18*5.17±1.46*
注：与对照组同一时间点比较，*
P <0.05。
表1两组小鼠肾皮质中不同时间点lncRNA-XIST 的表达水平比较
（n=5，x ⎺
±s ）注：与对照组同一时间点比较，*
P <0.05。
组别
第2小时第24小时第48小时第72小时
第7天
第14天
对照组1.00±0.05 5.67±1.15 6.71±1.437.13±2.35 6.98±0.988.91±1.56模型组16.84±2.31*15.64±2.45*17.32±4.08*19.44±4.54*29.76±3.11*41.18±3.81*
因此，本研究选择在动物模型中进行。C57小鼠是目前研究应用较多的动物模型，且得到国际学者的广泛认可。体外实验可选择细胞系，但肾组织为多细胞器组织，体外实验尚不能完全体现整个肾组织中lncRNA-XIST 的表达水平。基于此，本研究主要分析lncRNA-XIST 在AIKI 小鼠肾组织中的表达水平，并通过注射干扰腺相关病毒lncRNA -XIST siRNA ，
探讨下调lncRNA -XIST 对AIKI 小鼠相关临床指标的影响。现将具体内容报道如下。1材料与方法1.1实验动物
选取清洁级雄性C57小鼠90只，8~10周龄；体质量
外加电流阴极保护20~25g ，将其随机分为对照组、模型组、实验组，各30只。
实验动物由第四军医大学实验动物中心提供，本研究严格遵循国际动物伦理审查要求。1.2试剂与仪器湿度传感器芯片
Trizol 、反转录试剂盒与实时定量PCR 试剂盒均购自
宝日医生物技术（北京）有限公司，动物全自动生化分析仪
购自上海玉研科学仪器有限公司；实时定量PCR 仪购自Bio-Rad 公司。lncRNA-XIST 实时定量引物购自上海生物工程科技有限公司。XIST 正向引物：
CTCTC -CATTGGGTTCAC ，反向引物：GCGGCAGGTCTTAAGA -GATGAG ；GAPDH 正向引物：CGGATTTGGTCGTATTGGG ，反向引物：GATTTTGGAGGGATCTCGC 。lncRNA -XIST
siRNA 购自武汉汉恒生物科技有限公司。1.3方法
（1）构建AIKI 模型。模型组、实验组小鼠按国际标准构建AIKI 模型，实验组建模成功后第1天尾静脉注射lncRNA-XIST siRNA 0.05mg/kg 。对照组不进行处理。
（2）lncRNA-XIST 表达水平测定。于lncRNA-XIST siRNA 表达2周后的第2、24、48、72小时及第7、14天采
用颈椎脱臼法处死各组小鼠5只，采集肾组织样本，分离肾皮质、髓质，匀浆后利用Trizol 提取肾组织总RNA ，利用逆转录试剂盒合成cDNA 模板。实时定量PCR 反应体系为25.0μL ，包括2.0μL 的cDNA 模板，上下游引物各0.5μL 、12.5μL 的反应缓冲液，9.5μL 的超纯水。反应条件为93℃变性30s 、55℃退火并延伸40s 扩增42个循环。
（3）血清生化指标水平测定。于lncRNA-XIST siRNA 表达2周后的第48、72小时采用二乙酰一肟法测定血尿素氮（BUN ）水平；采用改良法测定血肌酐（Scr ）水平。1.4统计学方法
采用SPSS22.0统计学软件分析数据，计量资料用x ⎺
±s 表示，用t 检验，以P <0.05为差异具有统计学意义。2结果
2.1两组小鼠肾皮质中不同时间点lncRNA-XIST 的表达水平比较
在肾皮质中，模型组第2、24、48、72小时及第7、14天的lncRNA-XIST 表达水平均高于对照组，差异具有统计学意义（P <0.05）；且从第24小时开始，lncRNA-XIST 表达水平呈不断升高趋势。见表1。
2.2两组小鼠肾髓质中不同时间点lncRNA-XIST 的表达水平比较
在肾髓质中，模型组第2、24、48、72小时及第7、14天的lncRNA-XIST 表达水平均高于对照组，差异具有统计学意义（P <0.05，表2）。
2.3三组小鼠不同时间点的BUN 、Scr 水平比较
模型组第48、72小时的BUN 、Scr 水平高于对照组及
实验组，差异具有统计学意义（P <0.05）；实验组第48、72小时的BUN 、Scr 水平高于对照组，差异具有统计学意义（P <0.05）。见表3。
3讨论
目前已发现的lncRNA 在人体中约有30000个，长度大于200nt 。lncRNA 可通过RNA 聚合酶Ⅱ转录，结合DNA 、RNA 、蛋白质发挥生物学功能，在基因的调控和DNA 重建中发挥着重要的作用[8-9]。
本研究结果显示，在肾皮质及肾髓质中，模型组第2、24、48、72小时及第7、14天的lncRNA-XIST 表达水平均
高于对照组，差异具有统计学意义（P <0.05）。在肾皮质中，
表3
三组小鼠不同时间点的BUN 、Scr 水平比较（n=5，x ⎺
±s ）注：与模型组同一时间点比较，*P <0.05；与对照组同一时间点比较，#P <0.05。
拐角
组别BUN （mmol/L ）
Scr （μmol/L ）
对照组 4.32±1.21* 4.87±1.07*
37.62±2.74*
35.71±2.52*
实验组10.76±1.94*#10.65±1.25*#39.15±4.11*#44.24±4.61*#模型组
17.81±2.11
19.45±1.4892.19±5.6282.61±6.2411--
临床医学研究与实践2021年6月第6卷第18期
从第24小时开始，lncRNA-XIST表达水平呈不断升高趋势。下调lncRNA-XIST后，小鼠BUN、Scr水平均显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。
有研究发现，AIKI早期有炎症应激反应、细胞凋亡参与，并随着时间延长上述反应逐渐加重，肾脏严重损伤。lncRNA-XIST是否可以通过调控某种机制参与AIKI的早期反应，尚需进一步的研究证明。
研究发现，敲除lncRNA-XIST可以靶向下调HOXC8表达，抑制胃癌细胞的上皮间充质转分化进程[3]。那本研究是否可以假设在机体肾脏急性缺血性损伤早期，lncRNA-XIST高表达可以一定程度上反映损伤的严重程度，给予药物靶向调控该分子的表达可以延缓肾脏早期的炎症反应。由于肾脏有别于其他脏器，其主要功能在厚度约1cm 的肾皮质，对机体进行毒素和水电解质的代谢。肾皮质中最重要的是肾小球，肾小球的结构包括上皮细胞、基底膜、内皮细胞、系膜细胞，其中内皮细胞会因为早期的低灌注引起缺氧刺激，发生内皮细胞向间皮细胞的转分化，并导致大量纤维化相关胶原蛋白沉积，导致肾脏功能降低。因此，本研究设想下调lncRNA-XIST对早期小鼠这种可逆性损伤的保护是否缘于抑制
内皮细胞早期上皮间充质转分化进程。本研究需要进一步在动物模型、细胞系中去验证。lncRNA-XIST高表达可促进AIKI的早期进展，那么下调lncRNA-XIST是否可以延缓小鼠的AIKI进程有待进一步研究。
本研究回顾已有文献发现：①目前使用广泛的研究方法为预测lncRNA下游“海绵效应”结合的microRNA[10-11]，在此基础上预测microRNA下游的靶蛋白，在体内、体外实验中验证该通路的表达，针对脏器中单一细胞染分辨较为清晰，若在肾组织中，可以采取单细胞测序方法，分析不同肾组织细胞中的lncRNA，除了定量分析，还需要进一步量化不同细胞中的表达，进一步分清每种细胞的作用程度；但针对lncRNA在活体组织和离体组织中的差异是否会影响分子机制的验证尚待明确；②另一种研究思路是可以在活体细胞或动物中使用基因工程技术，利用质谱分析发现lncRNA相关疾病中下游的靶蛋白基因，导入表达Cas9酶的基因，并引导基因在细胞基因组的特定区域进行切割，也可在插入基因的末端加用可视化荧光标记，这样有利于进一步追踪活体组织中目标基因的表达[12-14]。除此之外，目前研究发现，TGF-b/Smad3信号通路、Wnt信号通路、细胞自噬、铁死亡、TLR信号通路也可参与调控lncRNA在疾病中的作用[15-18]。
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