1、电子显微镜（electron microscope), 简称电镜, 是使用电子来展示物件的内部或表面结构的显微镜。是显微镜的一种！但电镜是大型精密仪器,其原理、结构与光镜显著不同。
2、原理: 高速运动的电子在电场或磁场的作用下，会发生折射，并且能被聚焦，能聚焦即能成像。高速运行的电子的波长比可见光的波长短（波粒二象性), 电子显微镜的分辨率（约0.1纳米）远高于光学显微镜的分辨率（约200纳米, 光学显微镜的分辨率受其使用波长的限制)。
3、电镜的种类：按目的分：透射电镜、扫描电镜 分析装置：X-rays波谱仪、能谱仪；按用途分：生物医学用电子显微镜、非生物医学用电子显微镜； 按原理分: 场发射、非场发射；
分辨率:显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。其计算公式是σ=λ/NA 式中σ为最小分辨距离；λ为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则σ值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小σ值，可采取以下措施:（1） 降低波长λ值，使用短波长光源。（2） 增大介质n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。（3） 增大孔径角u值以提高
NA值。（4）增加明暗反差。
4、电镜、光镜对比
类别 | 成像部分 | 观察部分 |
LM： | 光子 | 玻璃透镜→虚象（彩像） |
EM： | 电子 | 电磁透镜→荧光屏（黑白像） |
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放大倍数：EM 可高达几百万倍，能看到原子的振动。因为光的衍射，光学显微镜放大倍数到一定程度时就图像模糊，而电子显微镜用电子做光源，可以清晰。
5、常见电镜技术 1平板电脑支撑架、超薄切片技术2、负染技术3、冰冻复型技术4、冷冻超薄切片技术5、电镜酶细胞化学技术体育场馆椅6、免疫电子显微镜技术7、电镜放射自显影技术8、核酸大分子的电镜样品制备技术9、SEM电镜样品制备技术10、电子探针；11、电镜原位杂交技术。
7、EM在医学中的应用 ①在基础医学方面：a.观察细胞的亚微结构：线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器的接构及病理变化。b.观察药物的代谢机理及对亚微结构的影响。 c. 研究病毒的作用机理及作用靶。d.探讨分子病理学的发生机制。e.研究大分子在生理和病理条件下的作用方式。f.其它：如功能蛋白质组的亚细胞定位，纳米药物的研制等。
格兰注塑机射咀头② EM及其技术在临床诊断中的应用： 临床方面：已广泛应用于临床各种疑难病的诊断，如肿瘤cell来源的鉴别，血液病和肾脏病的分型诊断，病毒性疾病因诊断，支原体、衣原体的鉴别，神经系统疑难病和各种代谢性疾病的诊断。
一 、取材、样品制备与课题设计密切相关
１.取材或固定要与课题设计的目的一致
２. 取材、固定：组织取材: 大小(1X1X5mm3)、部位(与要观察的对象有关) 原则:保证样品的超微结构不受损伤及细胞原有的定位. 注意事项:⑴切取组织动作要迅速;⑵低温操作; ⑶取材用的刀具要锋利; ⑷组织块要切小;⑸部位要准确可靠. (6)做好文案工作:标本编号、各项相关资料等
3.各类标本的取材：①实体组织标本的收集：手术标本、穿刺标本；②细胞标本的收集：体液游离细胞:血液、尿液等(抗凝/防溶血)；培养细胞的收集：常规包埋法、原位包埋法
固定: 2.5%-3%的戊二醛或多聚甲醛混合固定液、 灌注固定、浸泡固定
二、超微结构观察与研究中值得注意的问题
1 、局部与整体的关系:EM下:极小的一部分,超薄切片获得的样品厚度只有一个细胞的几百分之一……必须同时进行大体和组织学的观察,才能获得全面的资料.
2 、静态和动态的关系:在常规电镜技术中,不能观察活细胞,故细胞结构是瞬间静态的图象,实际上,细胞是运动和变化,细胞超微结构也是动态的.防止单纯的形态描述。
3.半薄切片:补充上述缺陷.生物样品的普通石蜡切片厚度为5微米左右,其观察深度远比超薄切片为大,即在石蜡切片和超薄切片之间不仅有观察范围大小的区别,也有观察厚度大小的显著差异.半薄切片厚度为1微米左右,一方面可为超薄切片定位,以选取电镜下观察部位,另一方面可供光镜观察标本的整体面貌. 通过LM 观察半薄切片可以检见通常在石蜡切片难以检见的形态结构,并据此可做出诊断.因为制作半薄切片的材料和技术操作过程不同于石蜡切片,
而切片又较普通石蜡切片为薄,故其中某些组织成分得以较好保存和得以显示加热片,有利于诊断.
4.电子显微镜的分辨本领虽已远胜于光学显微镜，但电镜因需在真空条件下工作，所以很难观察活的生物，而且电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。其他的问题，如电子亮度和电子透镜质量的提高等问题也有待继续研究。
医 学 电 镜 样 品 的 制 备
电镜生物样品制备技术包括：超薄切片技术、电镜细胞化学技术、电镜免疫细胞化学技术、电镜放射自显影技术、冷冻制样技术、冷冻蚀刻技术、负染技术、真空喷涂技术
由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本切成厚度小于0.1μm以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切切片。常用的超薄切片的厚度是50nm。在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。
基本过程：取材、固定、脱水、浸泡、包埋、切片及染等技术。
取 材：基本要求：快――动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（争取在1分钟内）投入固定液。
小――所取组织的体积要小，一般不超过1mm×1mm×5mm。
细――机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。
准――取材时选取部位应准确可靠，电镜观察范围有限，部位不准则难以诊断。
冷――操作最好在低温（0～4℃）下进行，以降低酶活性，防止细胞自溶。
取材方法 ：器官组织取材；游离细胞收集法：血浆凝集法、琼脂预包埋法
固定目的：⑴ 尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。⑵ 保护样品在以后一系列的处理过程中不被溶解、提取或移位。
（一）几种常用的固定剂及其特征：
锇酸（OsO4）――强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，对细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用；与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。（此外还对脂蛋白、变性的DNA以及核蛋白有固定作用） 锇酸有强烈的电子染作用，样品图像的反差较好。缺点：①渗
透能力较弱（0.1~0.3mm/h）②长时间固定在锇酸中会引起一些脂蛋白复合物的溶解和其他细胞成分的丢失；组织内部出现黑小颗粒金属锇沉淀的人工假；使组织变脆而影响切片。③易挥发，对皮肤、呼吸道粘膜、角膜有伤害。④见光或受热易氧化，故应保存与避光和阴凉处。
戊二醛（C5H8O2）――使用广泛对糖原、蛋白、糖蛋白、微管、内质网等有较好的固定作用，对组织＆细胞的穿透力比锇酸强，还能保存某些酶的活力。长时间的固定不会使组织变脆。缺点：不能保存脂肪，没有电子染作用，对细胞膜的显示较差。
锇酸与戊二醛固定效果的比较。
| 对组织的 渗透速度 | 对细胞物质的保存程度 蛋白质 核蛋白微型超级电容器 脂质 糖原 核酸 |
锇酸 | 慢 | 好 很好 实名认证系统良好 很差 很差 |
戊二醛 | 快 | 尚好 很差 很差 很好 较好 |
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普遍采用双重固定法――戊二醛作前固定，锇酸作后固定。
甲醛――穿透速度快，固定迅速，许多种酶在甲醛固定后仍然保持其活性。故多用于电镜组化研究或快速固定。但对细胞精细结构的保存不如戊二醛。
多聚甲醛－戊二醛混合固定液：固定的标本既适合做光镜检测也可作电镜观察。
（二）影响固定效果的因素：固定液的穿透速度及样品的大小、渗透压、PH值与缓冲液、温度与时间、固定液的浓度等
（三）固定的方法 浸泡固定：2~4%戊二醛（0～4℃固定2－4h）――缓冲液漂洗―― 1%锇酸（0～4℃固定1－2h）――缓冲液或蒸馏水漂洗。
灌注固定：（2～5％戊二醛或4％多聚甲醛） 适应于取材修快困难的软组织或难以浸透、死后变化快的组织＆器官。（如CNS、肾脏、视网膜等）
N.S冲洗血管---注入固定液--取下所需组织---切块--浸入同类固定液再固定1～2h
脱 水:目的――为保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即
用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水。常用的脱水剂是乙醇和丙酮。
急骤的脱水会引起细胞的收缩，故脱水应逐步进行：50%--70%--80%--90%--100%（2次）每步更换新液一次，每次10~15分钟。（在70%脱水剂中可延长时间或过夜） 注意：脱水要彻底、过度的脱水不仅引起更多物质的抽提，且会使样品发硬，造成切片困难。更换液体时动作要迅速，不要使样品干燥了，否则样品内易产生小气泡。
浸 泡 ＆ 包 埋:目的---利用包埋剂渗透道组织内部取代脱水剂，将生物组织块浸泡包埋起来，使其具有足够的硬度便于切割成超薄切片。目前常用包埋剂――环氧树脂。
理想的包埋剂应具有以下性质：⑴粘度低，能够渗入组织；⑵聚合均匀而充分，聚合前后体积变化小；⑶有良好的切割性能；⑷能耐受电子束轰击，高温下不变形；⑸对细胞成分抽提少，微细结构保存良好；⑹在电镜的高倍放大下，本身不显示任何结构；⑺材料来源丰富、易得，价格低廉，对人体无害。
浸泡与包埋方法：浸泡操作：样品经脱水剂脱水后 ---100％乙醇或丙酮一份＋包埋剂一份（30′～几小时）---- 纯包埋剂（几小时）
包埋操作： 多孔橡胶板（做好标记）----置烤箱烘干---- 将纯树脂包埋液到满包埋孔，用牙签将浸泡好的组织块移入包埋孔槽的一端 ----40℃烤箱12～24h---- 60℃烤箱 12～24h
特殊的包埋法：石蜡块重包埋、细胞原位包埋；注意：①所有试剂要防潮；②所有器皿要烤干；③配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；④动作轻，防止气泡产生；⑤皮肤尽量不要接触包埋剂；⑥盛放过包埋剂的容器及时用丙酮洗干净。
超 薄 切 片
（一）超薄切片前的准备工作
1、修块：手工修块 修块机
超薄切片机：机械推进式切片机－－微动螺旋及微动杠杆提供微小推进；热胀冷缩式切片机－－金属杆在加热或冷却时长度的微小变化提供推进
2、切片厚度：切片产生的反射光干涉来判定
干涉 | 切片厚度 |
暗灰 灰 银白 金黄 紫 | ＜40nm 40～50nm 50～70nm 70～90nm ＞90nm |
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3、超薄切片的步骤:安装包埋块 --安装玻璃刀--调节刀与组织块的距离---调节水槽液面高度与灯光位置----调节加热电流及切片速度---切片---捞片；
切片过程中主要故障及排除方法
故障 | 原因 | 解决方法 |
切片厚薄不一 刀痕 切片皱缩不平 颤纹 | 样品或刀安装不好；块聚合不好 刀刃有锯齿；包埋介质不干净 块软；水槽液面未平刀刃；面积太大 太硬或太软 | 重安60℃ 1－2h 换刀；重新修块 60℃1－2h调整液面；重新修块 重包 |
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染 目的：增加样品反差，提高分辨率－－标本中的不同结构成分对重金属盐的结合量不同，因而对电子束中电子的散射程度也不同，在荧光屏上观察到的颜深浅不同
