C h i n J C l i n P h a r m a c o l
213
V o l .27N o .3M a r c h 2011(S e r i a l N o .137)
R e s e a r c h M e t h o d
高效液相谱-质谱联用法同时测定、
丙戊酸钠、苯妥英钠和卡马西平的血药浓度
D e t e r m i n a t i o nt h ec o n c e n t r a t i o n s o f p h e n o b a r b i t a l ,s o d i u m v a l p r o a t e ,p h e n y t o i n s o d i u m a n dc a r b a m a z e p i n ei nh u m a n p l a s m af o rs i m u l t a n e o u sq u a t i f i c a t i o n b y H P L C-MS
收稿日期:2010-09-17修回日期:2010-12-20
作者简介：戴博(1982-)，女，药师，主要从事
通讯作者：张华峰，副主任药师
T e l :(010)66928552E-m a i l :m 0530@s i n a .c o m
戴 博，张华峰，宋 青，徐方楚
(解放军空军总医院药学部，北京 100142)
D A I B o ,Z H A N GH u a -f e n g ,
S O N GQ i n g ,X UF a n g -c h u
(D e p a r t m e n t o f P h a r m a c y ,A i r F o r c e G e n e r a l H o s p i t a l o f P L A ,B e i j i n g 100142,C h i n a )
摘要：目的 建立高效液相谱-质谱联用法以便同时测定人血浆中、丙戊酸钠、苯妥英钠和卡马西平(均为抗癫痫药物)的血药浓度。方法 以霉酚酸为内标，血浆样品经乙腈直接沉淀蛋白后，采用Z o r b a x E c l i p s e X D B-C 18谱柱(2.1m m×150.0m m ,3.5μm )进行分离，以0.05%乙酸铵-甲醇(47∶53)为 板式换热器选型流动相，流量0.2m L ·m i n -1
，柱温30℃；通过电喷雾离子源(E S I )，正负离子同
时检测。结果 、丙戊酸钠、苯妥英钠和卡马西平线性范围分别为
0.5～80.0,2.5～200.0,0.5～40.0和0.2～24.0μg ·m L -1；最低检测限分别为
0.05,0.20,0.10和0.01μg ·m L -1;γ均大于0.99。高、中、低3个浓度的日内精密度小于3%，日间精密度小于15%，绝对回收率均大于70%。结论 本方法简便、快速、灵敏、重现性好，能够有效地检测人血浆中4种药物的含量。关键词：高效液相谱-质谱；；丙戊酸钠；苯妥英钠；卡马西平；血药浓度中图分类号:R 971.6;R 969.1 文献标识码:A
文章编号:1001-6821(2011)03-0213-03
A b s t r a c t :O b j e c t i v e T oe s t a b l i s hal i q u i dc h r o m a t o g r a p h y -m a s s s p e c t r o m e t r y (H P L C -M S )m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f p h e n o b a r b i t a l (P
B ),s o d i u mv a l p r o a t e (V P A ),p h e n y t o i n s o d i u m (D P H )a n d c a r b a m a z e p i n e (
C B Z )i nh u m a np l a s m a .Me t h o d s M y c o p h e n o l i c a c i d w a s u s e d a s i n t e r n a l s t a n d a r d .A f t e r o n e s t e p p r o t e i np r e c i p i t a t i o n ,t h e a n a l y t e s w e r e c h r o m a t o g r a p h e do na X
D B-C 18(2.1m m ×150.0m m ,3.5μm ).A n i s o c r a t i c m o b i l e p h a s e c o n s i s t i n g o f 0.05%a m m o n i u m a c e t a t e i n w a t e r m e t h a n o l (47∶53),f l o wv e l o c i t y i s 0.2m L ·m i n -1
,c o l -u m n t e m p e r a t u r e i s 30℃.E S I e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n s o u r c e i n b o t h n e g -a t i v e a n d p o s i t i v e m o d e s .R e s u l t s T h e c a l i b r a t i o n c u r v e s o f e a c hd r u g s h o w e d a g o o dl i n e a r i t y i na r a n g e o f c o n c e n t r a t i o n b e t w e e n 0.5-80.0μg ·m L -1
f o r p h e n o b a r b i t a l ,2.5-200.0μ
g ·m L -1
f o r s o d i u m v a l -p r o a t e ,0.5-40.0μ
g ·m L -1
f o r p h e n y t o i ns o d i u m ,a n d 0.2-24.0μ
g ·m L
-1
f o r c a r b a m a z e p i n e ,a l l γ>0.99.I n t r aa n di n t e r p r e c i s i o n
(R S D %)w e r el e s st h a n 3%a n d 15%,r e s p e c t i v e l y .T h er e c o v e r i e s w e r e a b o v e 70%.C o n c l u s i o n T h em e t h o dw a s s u i t a b l et od e t e r m i n e t h e s e f o u r d r u g s i n h u m a n p l a s m a .
K e y w o r d s :H P L C -M S ;p h e n o b a r b i t a l ;s o d i u mv a l p r o a t e ;p h e n y t o i n s o -d i u m ;c a r b a m a z e p i n e ;p l a s m a c o n c e n t r a t i o n
DOI :10.13699/j ki .1001-6821.2011.03.018
214
第27卷 第3期 2011年3月(总第137期)
癫痫是一种常见的神经系统慢性发作性疾病，也是我国神经系统的疾病中仅次于脑血管疾病的第2大顽症。本研究建立了高效液相谱-质谱联用法同时测定人血浆中(P B)、丙戊酸钠(V P A)、苯妥英钠(D P H)和卡马西平(C B Z)4种抗癫痫药物的浓度[1-3]。
材料、对象和方法
1 药品、试药与仪器
苯妥英钠、、卡马西平及丙戊酸钠，均购于中国药品生物制品检定所的标准品；内标：霉酚酸为国产分析纯。流动相乙酸铵为国产分析纯；乙腈，甲醇均为谱分析纯。
液质联用仪L C M S-2010E V，包括自动进样器、二元梯度泵、在线真空脱气机、恒温柱箱、电喷雾(E S I)接口、P D A检测器及岛津工作站，日本岛津公司的产品;T G L-16G台式高速离心机，上海医用分析仪器厂产品；漩涡混合器M V S-1，北京金紫光科技发展有限公司产品。配制高纯度的氮气。
2 临床病人血样的获取
对正在服用、卡马西平2种药物合用的癫痫患者(男性,25岁,75k g)和服用丙戊酸钠、苯妥英钠
2种药物合用的癫痫患者(男性,30岁,70k g)，分别精密量取其血浆各0.5m L，精密加入500μg·m L-1的内标霉酚酸10μL。
3 测定方法[4-6]
用C18谱柱(Z o r b a xE c l i p s eX D B,2.1m m×150.0m m,3.5μm)，以甲醇-0.5m g·m L-1乙酸铵(53∶47)为流动相；使用前，经0.45μm微孔滤膜过滤，柱温30℃，流量0.2m L·m i n-1，进样量2μL；氮气流量1.5L·m i n-1。
电喷雾离子源(E S I)，正负离子同时检测。、苯妥英钠、卡马西平和丙戊酸钠的检测离子分别为231,251,237和143；内标霉酚酸的检测离子为321。水田打浆机
4 样本处理
4.1 标准品配置
精密称取40.85m g、苯妥英钠52.07 m g、卡马西平30.71m g、丙戊酸钠25.68m g分别置于10,25,25,25m L的容量瓶中，用纯化水配置浓度分别为4000,2000,1200,1000μg·m L-1作标准储备液。内标霉酚酸精密称取50m g置100m L容量瓶中，用甲醇定容至刻度，为500μg·m L-1储备液。所有的溶液放置在4℃冰箱中，保存。
4.2 血样的处理方法
精密量取血浆0.5m L，置2m L离心管中，精密加入500μg·m L-1霉酚酸内标液10μL，精密加入乙腈1m L，漩涡混匀2m i n,1.5×104r·m i n-1离心10 m i n，吸取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，进样分析。
结 果
1 方法学评价
1.1 专属性
空白血浆、空白血浆加4种对照品和空白血浆加内标霉酚酸标准溶液的谱图，见图1。
由图1可知，血浆中内源性杂质不干扰在血浆中同时存在、苯妥英钠、丙戊酸钠和卡马西平的测定，内标霉酚酸响应稳定
。
图1. 、丙戊酸钠、苯妥英钠、卡马西平和霉酚酸的谱图
F i g u r e1.T h e c h r o m a t o g r a m o f p h e n o b a r b i t a l,s o d i u m v a l p r o a t e,
p h e n y t o i n s o d i u m,c a r b a m a z e p i n e a n dm y c o p h e n o l i c a c i d
A.B l a c kp l a s m a;
B.B l a c kp l a s m a w i t hp h e n o b a r b i t a l,p h e n y t o i n,c a r b a m a z-e p i n e;
C.B l a c kp l a s m a w i t hm y c o p h e n o l i c;1.P h e n o b a r b i t a l;2.S o d i u m v a l-p r o a t e;3.P h e n y t o i ns o d i u m;4.C a r b a m a z e p i n e;5.M y c o p h e n o l i ca c i d
1.2 线性关系及最低检测限
分别精密量取、丙戊酸钠、苯妥英钠和卡马西平标准品储备液各10μL，加入内标液10μL 和空白血浆0.5m L，按照“血样处理方法”，配制成系
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V o l.27N o.3M a r c h2011(S e r i a l N o.137)
列血浆标准曲线，浓度如下。分别为80.0,
48.0,24.0,8.0,4.0,1.0,0.5μg·m L-1；丙戊酸钠分
别为200.0,120.0,80.0,40.0,25.0,5.0,2.5μg·
m L-1；苯妥英钠分别为40.0,24.0,16.0,8.0,4.0,usb暖手鼠标垫
pgd678
1.0,0.5μg·m L-1；卡马西平分别为24.0,16.0,8.0,
4.0,2.0,0.4,0.2μg·m L-1。
以各药物峰面积与内标峰面积之比值Y对浓度
X进行线性回归。用加权(权重系数:1/X2)对4种药
磁石电话机物进行线性回归运算，得到标准曲线方程如下。苯巴
比妥为Y=7.00×10-4X-3.16×10-2(γ=0.9992);
丙戊酸钠为Y=9.00×10-4X+3.14×10-2(γ=
0.9933)；苯妥英钠为Y=7.00×10-4X-1.00×10-3
(γ=0.9987)；卡马西平为Y=9.90×10-3X+0.40
(γ=0.9950)。
、丙戊酸钠、苯妥英钠和卡马西平分别
在0.5～80.0,2.5～200.0,0.5～40.0和0.2～24.0
μg·m L-1具有良好的线性定量关系，其相关系数(γ)
均大于0.99。、丙戊酸钠、苯妥英钠和卡马
西平的最低定量限分别为0.05,0.20,0.10,0.01μg
﹒m L-1。
1.3 精密度与回收率
空白血浆加入对照品储备液各10μL，制成含4
种抗癫痫药物均为高、中、低3个浓度的标样，按“血
样处理方法”处理后进样，每个样本处理6份，在不同
天内连续制备并测定3个分析批，计算日内、日间精
密度。测得日内标准偏差均少于3%，日间标准偏差
均少于15%。结果表明，方法精密度良好，见表1。
表1. 血浆中(P B)、丙戊酸钠(V P A)、苯妥英钠
(D P H)和卡马西平(C B Z)的精密度及回收率
T a b l e1.T h e p r e c i s i o na n dr e c o v e r y o f p h e n o b a r b i t a l(P B),p h e-
n y t o i ns o d i u m(D P H),s o d i u mv a l p r o a t e(V P A)a n dc a r b a m a z e p i n e
(C B Z)i nh u m a n p l a s m a
D r u g C o n c e n t r a t i o n
(μg·m L-1)
R e c o v e r y
(%)
W i t h i n-d a y
R S D(%,n=6)
I n t e r-d a y
R S D(%,n=18)
P B4882.12.814.1
2491.92.39.3
888.21.811.8 D P H24103.92.612.4
1682.11.512.4
894.52.319.9 V P A12079.42.37.0
8070.22.510.2
4071.62.811.9 C B Z16104.31.52.8
895.92.614.1
492.42.76.5 空白血浆加入对照品储备液各10μL，制成含4种抗癫痫药物均为高3个浓度的血浆质控样本，按“血样处理方法”提取，另取4种药物不同浓度的标准溶液和内标，用50%甲醇配制成与血浆浓度相同的高、中、低标准品溶液，进样分析，分别获得血浆样品和标准品的峰面积，将加入高、中、低3个浓度标准品的血浆样品的峰面积与相同浓度的标准品的峰面积进行比较所得到的百分数即为绝对回收率，结果表明，高、中、低3个浓度的4种标准品的绝对回收率都可以达到50%以上，见表1。
1.4 稳定性
空白血浆加入对照品储备液10μL，制成含4种抗癫痫药物3个浓度的样品，分别室温放置24h、-80℃冰箱冷冻保存30d和-80℃冰箱反复冻融3次，按上述条件测定，结果表明测定值的R S D均小于15%，表明4种药物在室温、长期冷冻及反复冻融情况下，稳定性均较好。
2 临床应用
选择以下2种方式服用的癫痫患者各3例:①和卡马西平2药合用;②丙戊酸钠和苯妥英钠2药合用。
测得分析物血药浓度，分别为①19.13μg·m L-1、卡马西平6.36μg·m L-1;②丙戊酸钠89.01μg·m L-1、苯妥英钠19.29μg·m L-1。结果显示：本文方法能检测到待分析物的谷浓度。
讨 论
本课题参照国内外文献报道，试采用了高氯酸、乙腈、三沉淀剂。但在实际操作中，三虽然对高浓度的样品回收率合格，但是对中低浓度的样品回收率并不合格。而高氯酸处理血浆不干净，达不到本课题的进样要求。故选用乙腈沉淀法，虽处理血浆略带颜，但是并不影响分析结果，选用乙腈沉淀法杂质峰于样品峰完全分离，峰形良好。
目前国内外监测、苯妥英钠、卡马西平及丙戊酸钠，常用高效液相谱法，此方法灵敏度较低，样品处理比较复杂，需消耗过多的样品。而H P L C-M S 法，将H P L C的强分离能力与M S的高灵敏和强专属性结合，用乙腈沉淀蛋白，取上清液过滤直接进样，大大简化了样本处理的过程，同时取血量少，实用性较好[7]。
参考文献:
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志,2005;11:57-59.(下转第222页)
222
中国临床药理学杂志
第27卷 第3期 2011年3月(总第137期)
肝功能受损(10%)和口腔溃疡(8%)。尽管90% M T X通过肾脏以原型排泄，由于水化和碱化尿液充分，通常不会造成肾功能损害。本研究只有1例患者发生Ⅱ度肾功能损害，经对症后恢复。本次研究最严重的不良反应是2例次Ⅲ度骨髓抑制，通常在连续化疗的时候发生，应注意2次化疗间隔的时间。所有出现不良反应患者通过心理疏导、口腔护理、预防感染、抗过敏等可迅速恢复[14,15]，未发现不可逆转的损害。
参考文献:
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