一种鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法与流程

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1.本发明涉及中药的含量测定方法领域，具体涉及一种鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法。

背景技术：

2.鱼腥草芩蓝合剂为常见中药制剂，由鱼腥草、黄芩、板蓝根、连翘、金银花五味中药材经水提醇沉工艺精制而成，具有清热解毒的功效。临床常用于外感风热引起的咽喉肿痛、急性咽炎、扁桃体炎等疾病。鱼腥草芩蓝合剂收录于国家药品监督管理局国家中成药标准中，然而现行标准中只有鱼腥草、黄芩、连翘和金银花的薄层谱鉴别项和黄芩苷含量的测定项。
3.目前中成药的质量控制体系由药材质控、制药过程质量控制和成品质检构成。制药过程质量控制中包括重要中间体质量控制、辅料质量控制、过程参数控制、过程状态控制和制药设备状态控制等多个方面。现有技术中，有文献公开了利用symmetry shield rp18谱柱(4.6mm
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250mm，5μm)，以乙腈
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0.1％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱同时测定鱼腥草芩蓝合剂中绿原酸、连翘酯苷a、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素和汉黄芩素含量的高效液相谱法(昝珂,周颖,郑成.高效液相谱法同时测定鱼腥草芩蓝合剂中7种成分[j].化学分析计量,2021.)，还有文献公开了利用kromasil-100 c18谱柱(4.6mm
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250mm，5μm)，流动相为甲醇-0.2％磷酸，梯度洗脱同时测定鱼腥草芩蓝合剂中绿原酸，黄芩苷和黄芩素的含量的高效液相谱法(邓茂芳,程维明.hplc同时测定鱼腥草芩蓝合剂中3种活性成分的含量[j].中国现代应用药学,2015,32(5):3.)。但是，上述方法均是对鱼腥草芩蓝合剂的成品进行检测和质量控制，并不适用于鱼腥草芩蓝合剂中间体的质量控制。
[0004]
水提浓缩液是鱼腥草芩蓝合剂生产中的重要中间体，其化学成分含量波动体现了药材批次间质量差异和提取浓缩等工艺对化学成分的综合影响。同时，水提浓缩液又是醇沉工艺的原料，其质量波动会对醇沉效果产生影响。所以，有必要开发鱼腥草芩蓝合剂水提浓缩液的液相谱质量检测方法。
[0005]
现有技术中报道了几种中成药中间体的质量控制方法，如公开号为cn113237913a的中国专利文献公开了一种丹参注射液工艺中间体的1h nmr一测多评法，该方法通过测定外标样品与和丹参注射液工艺中间体制得的供试样品，测定其1h nmr图谱，进行1h nmr指纹图谱构建与分析，完成含量测定与全面质量评价，该发明可同时测定多类别化合物(包括核苷类化合物)，检测速度快，但是对仪器的要求高；公开号为cn114563496a的中国专利文献公开了一种生姜姜半夏渗漉液中成分的定量指纹图谱分析方法，生姜姜半夏渗漉液是小柴胡胶囊的重要中间体，该方法通过高效液相谱方法分析对照品混合溶液和供试品溶液，得到生姜姜半夏渗漉液中成分的定量指纹图谱。但该方法中渗漉液是动态浸出的醇提液，组分和水提浓缩液差别较大，且该方法的分析时间较长。

技术实现要素：

[0006]
本发明提供了一种鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法，该方法可以弥补现有技术中对于药效成分和中间体质量控制的不足的缺陷，且该方法分析时间短、仪器要求低、易于实施、准确可靠，有利于更加全面地控制鱼腥草芩蓝合剂质量。
[0007]
具体采用的技术方案如下：
[0008]
一种鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法，所述的鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分包含尿苷和鸟苷，包括以下步骤：
[0009]
(1)取鱼腥草芩蓝合剂中间体配制供试品溶液；取尿苷对照品和鸟苷对照品配制混合对照品溶液；
[0010]
(2)将混合对照品溶液和供试品溶液进行液相谱分析测定，液相谱条件为：谱柱：waters atlantis t3谱柱，100mm
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2.1mm，3μm；以水作为流动相a，以乙腈作为流动相b进行梯度洗脱；洗脱程序：0-5min，0％-5％b；5-10min，5％b；10-15min，5％-8％b；
[0011]
(3)记录谱图，按外标法以峰面积计算，得到供试品溶液中核苷类成分含量。
[0012]
本发明以尿苷和鸟苷这两种核苷类药效成分作为指标来检测鱼腥草芩蓝合剂中间体的质量，尿苷和鸟苷这两种成分有着抗病毒和抗氧化的药理活性，而这与鱼腥草芩蓝合剂急性咽炎和扁桃体炎等临床作用有着密切的关系。
[0013]
鱼腥草芩蓝合剂中间体的制备方法通常为：按照处方量取鱼腥草、黄芩、板蓝根、连翘和金银花五味药材，加水煎煮两次，每次2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20(60℃～80℃)的清膏(水提浓缩液)，即为鱼腥草芩蓝合剂中间体。
[0014]
优选的，供试品溶液的制备方法为：将鱼腥草芩蓝合剂中间体加入至体积百分比为5％的甲醇溶液中，摇匀，离心，过0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0015]
优选的，混合对照品溶液的制备方法为：将尿苷对照品和鸟苷对照品分别溶于体积百分比为5％的甲醇溶液中得到尿苷溶液和鸟苷溶液，混匀尿苷溶液和鸟苷溶液制成混合对照品溶液。
[0016]
所述的液相谱条件还包括：检测波长260nm，进样体积10-20μl，流速0.3ml/min。
[0017]
优选的，所述的液相谱条件还包括：检测波长260nm，进样体积10μl，流速0.3ml/min，柱温：25℃。在上述检测条件下，谱峰分离较好，基线较为平稳，峰面积较大响应较好。
[0018]
优选的，液相谱分析过程中，采用dad检测器。
[0019]
本发明还提供了所述的鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法在评价鱼腥草芩蓝合剂产品质量中的应用。
[0020]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0021]
(1)本发明建立了鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法，填补了现有方法对鱼腥草芩蓝合剂中间体质量检测的空白，应用本发明中方法，可以更全面地评价鱼腥草芩蓝合剂中间体的质量；本发明着眼于鱼腥草芩蓝合剂中间体中的核苷类药效成分，以尿苷和鸟苷作为指标来检测鱼腥草芩蓝合剂中间体的质量，尿苷和鸟苷这两种成分有着抗病毒和抗氧化的药理活性，作为药效成分，在生产过程中对其进行含量检测有助于鱼腥草芩蓝合剂的质量控制。
[0022]
(2)相比中等极性的药效成分，核苷类药效成分对谱分离条件要求特殊，且中成
药及其中间体的组分成分复杂，不同的前处理方法以及检测条件无法通用；本发明采用特定的前处理方法制备得到供试品溶液，采用waters atlantis t3谱柱以及特定的梯度洗脱条件，15min即可实现供试品溶液中的尿苷和鸟苷含量测定，分析时间短，仪器要求低，易于实施，准确可靠。
附图说明
[0023]
图1为混合对照品溶液的谱图，其中，1为尿苷的谱峰，2为鸟苷的谱峰。
[0024]
图2为批号为220314鱼腥草芩蓝合剂中间体制成的供试品溶液的谱图，其中，1为尿苷的谱峰，2为鸟苷的谱峰。
具体实施方式
[0025]
下面结合附图与实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
[0026]
1.实验仪器与材料
[0027]
1.1仪器
[0028]
aglient1100高效液相谱仪(美国安捷伦科技公司)，配置dad检测器、在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱以及chemstation工作站谱工作站。谱柱为waters atlantis t3谱柱，100mm
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2.1mm，3μm。电子天平(ab204-n，mettler toledo公司)。小型高速离心机(ab204-n，mettler toledo公司)。
[0029]
1.2试剂
[0030]
乙腈(谱纯，德国merck公司)，甲醇(谱纯，德国merck公司)，水为mili-q超纯水。尿苷对照品(纯度98％，上海旭硕生物科技有限公司，批号：dc17812)，鸟苷对照品(纯度98％，上海旭硕生物科技有限公司，批号：dc17810)。鱼腥草芩蓝合剂中间体由浙江惠松制药有限公司制备，批号为220314。
[0031]
2.实验条件
[0032]
2.1对照品混合溶液的制备
[0033]
精密称定尿苷和鸟苷对照品，置于容量瓶中，用5％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，制成含66.7μg/ml尿苷、45.1μg/ml鸟苷的混合对照品溶液。
[0034]
2.2供试品的制备
[0035]
鱼腥草芩蓝合剂中间体的制备方法通常为：按照处方量取鱼腥草、黄芩、板蓝根、连翘、金银花五味药材，加水煎煮两次，每次2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20(60℃～80℃)的清膏(水提浓缩液)，即为鱼腥草芩蓝合剂中间体。
[0036]
取鱼腥草芩蓝合剂中间体1ml于10ml容量瓶中，加入5％甲醇溶液定容至刻度线，摇匀，离心，过0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0037]
2.3谱条件
[0038]
谱柱：waters atlantis t3谱柱，100mm
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2.1mm，3μm；以水作为流动相a，以乙腈作为流动相b进行梯度洗脱；洗脱程序为：0-5min，0％-5％b；5-10min，5％b；10-15min，5％-8％b；流速：0.3ml/min；柱温：25℃；检测波长：260nm，进样体积为10μl。
[0039]
3.含量测定方法学验证
[0040]
3.1实验方法
[0041]
本发明的方法学验证包括各含量测定成分的线性、精密度、稳定性、重复性和加样回收实验的考察。
[0042]
线性考察：取系列不同浓度的混合对照品溶液，分别进样10μl分析。以各成分测定的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标制作标准曲线，得到线性回归方程与分析范围。根据峰信噪比约为3:1与10:1时各成分的浓度分别确定检测限与定量限。
[0043]
进样精密度实验：取同一份供试品溶液以及与原药液浓度相同的混合对照品溶液，连续进样6次，计算得到各成分峰面积以及保留时间的rsd值。
[0044]
重复性实验：取六份平行制备的供试品溶液，分别进样分析，计算得到各成分含量的rsd值。
[0045]
溶液稳定性实验：取同一份供试品溶液以及与原药液浓度相同的混合对照品溶液，于0，3，6，9，12，18，24h进样分析，计算得到各成分峰面积的rsd值。
[0046]
加样回收实验：分别取已知含量的样品溶液9份，分为3组。设高、中、低三个浓度水平，控制对照品加入量与供试品中待测成分量之比分别在1.5:1.0，1.0:1.0，0.5:1.0左右，每种浓度平行制备3份供试品溶液进行测定。精密加入0.5ml鱼腥草芩蓝合剂中间体与适量尿苷和鸟苷对照品，用5％甲醇定容至10ml容量瓶，摇匀，离心，过0.22μm滤膜后取续滤液进样分析。
[0047]
3.2实验结果
[0048]
尿苷和鸟苷的回归方程、线性范围以及检测限、定量限结果见表1，进样精密度实验结果见表2-3，重复性实验结果见表4，溶液稳定性实验结果见表5，其中精密度、重复性、稳定性rsd均小于5％，符合中国药典的要求，说明该方法线性良好，且供试品溶液在室温下24h内稳定。加样回收实验结果见表6，各成分平均回收率均满足要求，且rsd值均小于7％，证明该优化得到的方法准确可靠，可用于鱼腥草芩蓝合剂中间体中核苷类成分的含量测定。
[0049]
表1各成分的回归方程、相关系数和线性分析范围
[0050][0051]
表2进样精密度结果(峰面积)
[0052][0053]
表3进样精密度结果(保留时间)
[0054][0055]
表4重复性实验结果
[0056][0057]
表5溶液稳定性实验结果
[0058][0059]
表6加样回收实验结果
[0060][0061]
3.3样品含量测定结果
[0062]
含66.7μg/ml尿苷、45.1μg/ml鸟苷的混合对照品溶液的谱图如图1所示；批号为220314鱼腥草芩蓝合剂中间体制成的供试品溶液的谱图如图2所示；将峰面积带入至尿苷和鸟苷的标准曲线中计算得到，批号为220314鱼腥草芩蓝合剂中间体中尿苷含量为66.9
±
1.22μg/ml，鸟苷的含量为50.7
±
1.10μg/ml。
[0063]
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取鱼腥草芩蓝合剂中间体配制供试品溶液；取尿苷对照品和鸟苷对照品配制混合对照品溶液；(2)将混合对照品溶液和供试品溶液进行液相谱分析测定，液相谱条件为：谱柱：waters atlantis t3谱柱，100mm
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2.1mm，3μm；以水作为流动相a，以乙腈作为流动相b进行梯度洗脱；洗脱程序：0-5min，0％-5％b；5-10min，5％b；10-15min，5％-8％b；(3)记录谱图，按外标法以峰面积计算，得到供试品溶液中核苷类成分含量。2.根据权利要求1所述的鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法，其特征在于，所述的鱼腥草芩蓝合剂中间体为鱼腥草芩蓝合剂制备过程中的水提浓缩液；所述的鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分包含尿苷和鸟苷。3.根据权利要求1所述的鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法为：将鱼腥草芩蓝合剂中间体加入至体积百分比为5％的甲醇溶液中，摇匀，离心，过0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。4.根据权利要求1所述的鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法，其特征在于，混合对照品溶液的制备方法为：将尿苷对照品和鸟苷对照品分别溶于体积百分比为5％的甲醇溶液中得到尿苷溶液和鸟苷溶液，混匀尿苷溶液和鸟苷溶液制成混合对照品溶液。5.根据权利要求1所述的鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法，其特征在于，所述的液相谱条件还包括：检测波长260nm，进样体积10-20μl，流速0.3ml/min。6.根据权利要求1或5所述的鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法，其特征在于，所述的液相谱条件还包括：检测波长260nm，进样体积10μl，流速0.3ml/min，柱温：25℃。7.根据权利要求1所述的鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法，其特征在于，液相谱分析过程中，采用dad检测器。8.根据权利要求1-7任一所述的鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法在评价鱼腥草芩蓝合剂产品质量中的应用。

技术总结

本发明公开了一种鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法，所述的鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分包含尿苷和鸟苷，包括以下步骤：(1)取鱼腥草芩蓝合剂中间体配制供试品溶液；取尿苷对照品和鸟苷对照品配制混合对照品溶液；(2)将混合对照品溶液和供试品溶液进行液相谱分析测定，液相谱条件为：谱柱：Waters Atlantis T3谱柱；以水作为流动相A，以乙腈作为流动相B进行梯度洗脱；(3)记录谱图，按外标法以峰面积计算，得到供试品溶液中核苷类成分含量。本发明方法分析时间短、仪器要求低、易于实施、准确可靠，可以弥补现有技术中对于药效成分和中间体质量控制的不足的缺陷。的缺陷。的缺陷。