文章编号:100123555(2009)0120078205
收稿日期:2008206209；修回日期:2008209220.作者简介：尹春华,(1972-)，博士.3通讯联系人,Email:chyin@sina .
尹春华
1,23
，谭天伟2，刘江帆
1
(1北京科技大学应用科学学院生物技术系，北京100083;2北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029)
摘 要：对根霉脂肪酶储存稳定性(干燥状态)及在水中，甘油微量水中等不同体系的热失活机理进行了研究，并求出了动力学参数.结果表明该酶在不同的外部环境中热失活机理并不一致：干燥酶粉符合一级 失活模型，酶水溶液和酶甘油微水溶液却符合两步串联失活机理，而且证实甘油对该脂肪酶的热稳定性有促进作用.关 键 字：脂肪酶；动力学；失活.中图分类号:Q814.4
文献标识码:A
脂肪酶(三脂酰甘油酰基水解酶,EC3.1.1.3)可用于催化酯化，酯水解，酸解，甘油解等许多有机化学反应中，在食品，化工，医药，造纸，制革，环境保护等工业中具有广阔的应用前景.脂肪酶作为一种重要的生物催化剂，高效，反应条件温和，但也有容易失活的缺点.对脂肪酶失活动力学的研究对于研究酶的性质，充分发挥酶的催化性能至关重要. [1-5]
引起酶的失活因素很多，如温度,pH，化学试剂等，其中酶的热失活是最重要的一种酶失活形式.在过去的几十年中，已有大量有关酶热失活的研究，提出了许多失活机理.常见的热失活机理动力学模型有一步失活模型(One 2step t w o states )，并列失活模型(Parallel deactivati on )，串联失活模型(T wo 2step series deactivati on )，同时失活模型(Si m 2ultaneous deactivati on )和混合多步连续失活(M ixed si m ultaneous 2series deactivati on )
[6-9]
.
酶失活可能是
与活性有关的一系列相关化学键或“敏感结构域”的破坏
[10]
，虽然有些失活机理可以普遍使用.但不
同的酶有各自自己的敏感中心
[11]
.失活形式也各
有不同.而且失活行为还与酶的应用形式有关：如游离酶或固定化酶，酶的固定化方法和载体等因素都会影响酶的失活行为
[12]
.除此之外，酶所处的外
部环境对酶的活性影响也很大.
脂肪酶广泛存在于植物，动物和微生物中，来源不同的脂肪酶发酵活力和催化特性差异很大.根
霉脂肪酶具有1,32位置专一性，对短链，中链和长链的脂肪酸都有很好的催化活性，尤其适合于功能性甘油酯的合成
[13-15]
.本文对实验室自制的根霉
脂肪酶在各种体系下热失活机理进行了研究.
1材料与方法
1.1仪器和试剂
根霉菌株(Rhiz opus s p )，本实验室保藏；聚乙烯醇(P VA,1750±50)，化学纯，北京市旭东化工厂；其它试剂皆为分析纯.Backman 冷冻离心机;SHA 2B 型水浴恒温振荡器，常州金城教学仪器厂;HY A 恒温摇床，中国科学院武汉科学仪器厂;Christ al pha124冷冻干燥仪；高速组织匀浆机，海菱
电器公司.
1.2酶活的定义和测定方法
采用橄榄油乳化法测定脂肪酶活力
[16]
.水解
酶活定义：脂肪酶在37℃、pH 7.0下每分钟产生1μmol 脂肪酸所需的酶量，即为1个脂肪酶活力单位，以U 表示.
1.3根霉脂肪酶的发酵生产条件和酶的提取方法
参看文献[13]1.4酶在不同体系的热处理
1.4.1干燥酶粉 取充分研碎0.6g 酶粉于烧杯
中，置恒温箱中保温，用小烧杯每隔1～2小时取出20mg 左右的酶粉，冰水中快速降温后，充分溶于
水中，测其水解酶活.
第23卷第1期分 子 催 化
Vol .23,No .1 2009年2月
JOURNAL OF MOLECULAR C AT ALYSI S (CH I N A )
Feb . 2009
1.4.2酶水溶液 取0.6g 酶粉溶于20mL 水溶
液，取上层清夜，置恒温箱中保温，每隔1～2h 取出1mL 溶液，冰水中快速降温后，测其水解酶活.1.4.3酶甘油微水溶液 取一系列试管，每个试管中加入200mg 酶粉，加入含水4%(质量百分比)的2.4g 甘油，置恒温箱中保温，每隔1～2h 取出1个试管，冰水中快速降温后，测其水解酶活.
考虑到酶活的测定有一定的误差，以上的酶活测定都重复3次，取其均值.
2常用酶失活动力学模型简介
下面简单介绍两种常用的酶热失活动力学模型.2.1一步失活模型(One 2step two st a tes)
该模型又称为一级失活模型，失活机理可表示为:
E a
k
E d (1)
式中E a ,E d 和k 分别是酶的活性态，完全失活态和速度常数.由该机理我们可以得到以下的失活动力学方程:
-dA /d t =kE
(2)积分得:A t /A 0=exp (-k t )or ln (α)=-k t (3)k 是失活动力学常数;E 是酶活;A 是t 时的残存酶
活;t 是热处理时间;A t 是热处理时间为t 时的残存
酶活;A 0是初始酶活;α是残存酶活百分数:A t /A 0×100%.从式223可知道在一步两态失活模型中,ln (α)和热处理时间t 呈线性关系.研究表明虽然不同的酶都有其复杂的结构，但许多还是符合简单的一步失活模型.
2.2串联失活模型(two 2step ser i es deacti va ti on)
该模型又称为两步连续失活模型.在“两步连续”失活机理中，酶的失活是经过两个连续的一级反应.模型
包含两个过程,3种状态.从最初的状态到最终的状态(E d2)经过中间态E d1和两个单分子一级反应,k 1,k 2是两步一级失活常数.
E a
k 1
=E d 1
K 2
E d 2(4)
假设酶的状态E a 和E d1活性不同，分别为δ,δ1.而
且酶的最终状态E d2没有活性.设α1=δ1/
δ由式(4)经过简单的数学推导整理可得
:α=1+α1k 1/(k 2-k 1)exp (-k 1t )-α1k 1/(k 2-k 1)exp (-k 2t )
这就是两步连续失活的α与t 的关系.
3结果与讨论
3.1干酶粉失活动力学模型
研究干酶粉的失活可以了解脂肪酶保存特性.图1为R hizopus sp .脂肪酶残余酶活百分数随热处理时间的变化.实验结果表明，干燥R h izopus sp .酶粉储存稳定性很好,50℃下保存一昼夜(24h )水解活力基本没有损失.对剩余酶活百分数的对数与热处理时间作图，并且进行直线拟合(图2)
，求得直线方程，线性相关系数都大于0.9.这说明干燥酶粉的失活动力学符合一级失活动力学模型.表1为失活动力学参数.
图1干燥根霉(Rhizopus sp .)酶粉热失活曲线
Fig
.1Effect of heat 2treat m ent on the activity of
Rhizopus sp .li pase
图2一步失活模型对干燥酶粉失活曲线的拟合
(数据点为实验值，直线为相应数据拟合结果)Fig .2Results (lines )of regressi on analysis of experi m ental data (sy mbols )by the one 2step t w o states deactivati on model
表1干燥酶粉失活模型参数
Table .1L inear regressi on analysis of relati onshi p bet w een
ln (a )and ti m e during the ther mal deactivati on T/℃Trendline equati on R
2
70y =-0.000x +4.5886-60y =-0.0124x +4.62290.9250
y =-0.0293x +4.5075
0.95
9
7第1期 尹春华等：不同体系下根霉脂肪酶失活动力学模型研究
3.2根霉(Rh i zopus sp .)脂肪酶失活动力学研究
酶的应用是离不开水的，脂肪酶催化的重要反应类型之一就是油脂的水解，所以研究脂肪酶在水
溶液中稳定性或失活机理显得特别重要.图3为根霉(Rhiz opus s p.)脂肪酶在水溶液中的失活曲线，用一级失活动力学模型拟合实验结果，线形相关系数很低(数据未列出).对实验数据改用串联失活模型进行非线性拟合.用Matlab (矩陈实验室)语言编程计算，采用Matlab 自带的F m insearch 子函数(求多变量非线性函数的极小值,Nelder 2Mead si m p lex 法)来实现，使计算值与实验值的差值平方和最小，搜索求得失活模型中的参数值(图4为计算框图)，得到了很好的拟合结果(图5).可见根霉(Rhiz opus s p.)脂肪酶在水溶液体系中符合串联失活模型.表2为串联失活动力学模型拟合出来的失活动力学参
数.相对于干燥酶粉，酶在水溶液中热稳定性大大
降低.这主要可能是因为水分子会引起酶分子中天冬酰胺和谷氨酰胺的脱氨基作用、还可能会引起天冬氨酸肽键的水解.半胱氨酸的氧化、二硫键的破坏等，这些都可能破环酶的活性
.
图3酶在水溶液中的失活曲线
Fig .3Effect of heat 2treat m ent on the activity of
Rhizopus sp .li pase in water
表2酶水溶液失活动力学参数
Table .2Kinetic para meters of ther mal deactivati on for
R h izopus sp .L i pase in water
T/℃α1
k 1k 2×10
2
300.7290.1270.0859350.6700.3350.413400.6690.9620.67045
0.551
1.275
1.
921
图4非线性拟合求失活动力学参数计算框图
Fig .4Iiustrati on of the regressi on analysis by
t w o 2step series deactivati on
model
图5失活模型对实验数据的拟合
(数据点为实验值，曲线为相应数据拟合结果)Fig .5Results (cures )of regressi on analysis of experi m ental data (sy mbols )by t w o 2step series deactivati on model .
3.3体系R h izopus sp .L i pa se 失活动力学模型研究
R hizopus sp .L i pase 有很好的甘油脂催化合成
特性[1]
，所以有必要对该脂肪酶在甘油水体系的失活特性进行研究.图6为酶在甘油微水(含水4%)溶液的失活曲线.实验结果表明，甘油微水体系中的脂肪酶活性相对于水体系，稳定性有所提高.如在45℃时，酶在水溶液中的半衰期为5.8h，而在甘油微水体系中为8h .表明甘油对脂肪酶有稳定作用，这可能是与甘油具有多个羟基，有利于维持酶蛋白中氢键的稳定性.在甘油中具有较高的稳定性，这也从另一方面说明该脂肪酶适合于甘油酯的合成.C .B rady et at 在研究固定化Candida li pase
08 分 子 催 化 第23卷
也发现甘油对酶有稳定作用，在甘油存在下，酶的
半衰期大大延长[17]
.图7为串联失活模型对失活曲线的拟合结果，拟合结果很好，可见Rhiz opus s p.L i pase 在甘油微水体系中的失活特性与在水中一样符合串联失活模型.表3为拟合出来的串联失活模型失活动力学参数
.
图6Rhizopus sp .在甘油微水体系中的失活曲线
Fig .6Effect of heat 2treat m ent on the activity of
Rhizopus sp .li pase in glycer ol 2water
.
图7失活模型对实验数据的拟合
(数据点为实验值，曲线为相应数据拟合结果)Fig .7Results (curves )of regressi on of experi m ental data
(sy mbols )by t w o 2step series deactivati on model
表3酶甘油微水溶液失活动力学参数
Table .3Kinetic para meters of ther mal deactivati on for
Rhizopus sp .L i pase in glycer ol 2water syste m
T/℃α1
k 1k 2×10
2
300.7340.0980.0663350.6390.2620.117400.5790.8930.43345
0.549
1.086
1.330
4结 语
研究了根酶脂肪酶储存稳定性(干燥状态)及在水中，甘油微水中的热失活行为，求出了相应的失活动力学参数.结果表明，不同的体系中，该酶热失活机理不一样：干燥时符合一级失活模型，酶水溶液和酶甘油微量水溶液却符合串联失活机理，而且甘油对该脂肪酶的热稳定性有一定的促进作用，可能与甘油含有多羟基有关.参考文献:
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Ther mal I nacti vati on Ki n eti cs of the Rhi zopus sp.L i pase
YI N Chun2hua1,2,T AN Tian2wei2,L I U J iang2fan1
(1.School of A pplied Science,U niversity of Science and Technology B eijing,B eijing100083,China;
2.College of L ife Science and Technology,B eijing U niversity of Che m ical Technology,B eijing100029,China)
Abstract:Ther mal inactivati on behavi ors of the Rhiz opus s p.L i pase in several syste m s were investigated.Ther mal inactivati on kinetics depend on the envir onment ar ound the li pase:the dry powder f or m of the li pase foll ows a si m2 p le One2step t w o stateswhile both the li pase in water
and the li pase in glycer ol containing m inor a mount of water(4 wt.%)p r operly fit T wo2step series deactivati on.Glycer ol was confir med t o be in favor of the stabilizati on of the li2 pase.Further more,kinetics para meters of the inactivati on models were calculated by statistically linear or non2line2 ar regressi on.
Key words:L i pase;Kinetic;Deactivati on.
28 分 子 催 化 第23卷
