课程名称：微生物学检验技术
授课专业：医学检验
学时：2学时
实验十七 结核杆菌检验
(M.Tuberculosis Test)
一、实验目的
⒈掌握结核杆菌的菌落特征，镜下形态、染特性
二、实验器材与试剂
⒈菌种：BCG
⒉试剂：抗酸染液
⒊其他：三脚架、铁片、木夹子等
三、实验内容
㈠微生物学诊断
⒈标本采取
根据病灶器官取材,包括痰, 尿, 脑脊液, 粪便等。
⒉直接涂片抗酸染镜检
浓缩集菌: 无其他杂菌污染的脑脊液、胸腹水等标本, 可直接离心沉淀集菌。有杂菌的标本如痰、尿、粪等标本, 先经4%NaOH或3%HCl或6%H2SO4处理30分钟, 杀死杂菌并使粘稠性有机物溶解之后, 再离心沉淀集菌。
⒊抗酸染
⒋培养鉴定
⒌动物试验(豚鼠): 将集菌后的材料注于豚鼠腹股沟皮下, 3-4 周后若局部淋巴结肿大, 结核菌素试验阳转, 即可进行解剖。观察肺、肝、淋巴结等器官有无结核病变, 并作形态、培养等检查。若6-8周仍不见发病, 亦应进行解剖检查。
⒍结核菌素试验
⑴用途:
测定机体对结核杆菌有无变态反应性─免疫性。
⑵ 方法:
用旧结核菌素(OT)或纯蛋白衍生物(PPD)注射前臂皮内, 48小时-72小时观察有无红肿硬结。
⑶结果:
出现红肿硬结直径大于5mm者为阳性, 说明机体对结核杆菌有免疫性; 反之, 红肿硬结直径小于5mm者为阴性, 说明机体对结核杆菌无免疫性。大于15mm者为强阳性反应, 表明可能 有活动性结核感染, 应进一步追查病灶。
⑷实际应用:
① 选择卡介苗接种对象和测定卡介苗接种后的免疫效果。结核菌素试验阴性者应接种或补种卡介苗。
② 在未接种卡介苗的人中作结核杆菌感染的流行病学调查, 了解人自然感染率。
③ 作为婴幼儿(尚未接种过卡介苗者)结核病的辅助诊断。
④ 测定肿瘤患者的细胞免疫功能。
㈡培养特性（示教）
1.营养要求高 常用的有Lowenstein-Jensen培养基, 内含蛋黄、甘油、 马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑制杂菌生长, 便于;分离和长期培养。蛋黄含脂质生长因子, 能刺激生长。
2.需氧, 加6-8%CO2可促进生长。
3.生长缓慢: 繁殖一代需18小时左右, 形成菜花样菌落需时两周以上。
㈢形态染（示教）
1.形态细长, 着不匀, 排列成分枝或索状。
2.着抗酸性─抗酸性染。
㈣ 抗酸染法(acid-fast stain) ：
⒈原理:
结核分枝杆菌含脂质多,不易着,先用石炭酸复红初染,染时间要稍长,且需要加温。一旦细菌染上颜，由于脂质的存在，即使强脱剂也不能使之脱,其它细菌均脱,经碱性美兰复染,所以结核分枝杆菌呈红,其它呈蓝.
⒉方法：
取痰液→ 涂片（略厚）→干燥→固定 → 5％石炭酸复红染30分钟（冷染）后→用3%的
盐酸酒精脱约1～2分钟，脱时轻摇玻片，直到涂片颜脱去为止→ 水洗后，用碱性美蓝复染1分钟→水洗，待干 → 镜检 ⒊结果：
抗酸杆菌呈红(+)，其他细菌和背景物质为蓝(-)，如下图
⒋萋尼氏染镜检结果分级报告标准
抗酸杆菌阴性 (－)： 连续观察300个不同视野未发现抗酸杆菌。
报告抗酸杆菌菌数： 1～8条/300视野。
抗酸杆菌阳性（1＋）： 3～9条/100视野。
抗酸杆菌阳性（2＋）： 1～9条抗酸杆菌/10视野。
抗酸杆菌阳性（3＋）： 1～9条抗酸杆菌/每视野。
抗酸杆菌阳性（4＋）： ≥10条抗酸杆菌/每视野
⒌注意事项
痰涂片抗酸染检查要注意预防假阳性和假阴性结果的产生。假阳性是指将阴性涂片错误判读为阳性，假阴性是指将阳性涂片错误判读为阴性。属于技术因素的影响要通过一系列实验室内和实验室间的质量控制不断改善。
Ⅰ 假阳性结果的预防措施
⑴必须使用新的载玻片进行痰涂片检查。
⑵每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。
⑶所有染液均经过过滤。
⑷染时玻片彼此之间保持一定距离，相互彻底分隔开。
⑸严禁使用染缸将玻片放置一起染。
⑹染时勿使玻片上的染液干燥。
⑺滴加镜油时，严禁容器滴口直接接触玻片痰膜。
⑻严禁物镜镜头直接接触玻片痰膜。
⑼完整、准确的标注痰盒、玻片和实验室登记本的各项内容。
⑽登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。
⑾认真按照要求读片，准确记录和报告结果。
Ⅱ 假阴性结果的预防措施
⑴确认标本是痰而非唾液。
⑵确认每份标本至少有3 ml。
⑶选择脓样、干酪样、粘液分泌物涂抹制备玻片。
⑷制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。
⑸使用高质量染料、严格按照配方配制染液。
⑹严格按照操作程序完成染过程。
⑺判断结果为“阴性”前，必须阅读规定要求的视野数。
⑻作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染镜检过程。
⑼完整、准确地标注痰盒、玻片和实验室登记本。
⑽登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。
四、实验安排
每人取痰标本做抗酸染，记录结果。
五、实验准备
抗酸染液 2套／教室
三脚架、铁片、木夹子、玻片 若干
