核酸染剂SYBR-Gold染特性分析
金磊
【摘 要】Objective It is analyse two method for staining DNA fragments in agarosewith SYBR-Gold.Methods It used poststaining and prestaining to dye double strand DNA in agarose gel electrophoresis.The same way is used to stain DNA with EB as a control.And we analysed the results by the gel imaging system.Results We found SYBR-Gold was much more sensitive than EB to detect double strand DNA.But the effect of resolution and the mobility of DNA fragments were affiliated to the concentration of the samples in precasting SYBR-Gold in gels.And it was low accurate in measuring the size of DNA fragments through the agarose gel with adding SYBR-Gold in loading buffer.Conclusion We do not recommend that you stain the sample with SYBR-Gold before agarose gel electrophoresis.It is also not suitable to precast SYBR-Gold in gels when the concentration of samples is too high.However,the poststain with SYBR-Gold is an ideal method.%目的：检测 SYBR-Gold前染与后染的优缺点。方法采用前染、后染的 方法使用 SYBR-Gold对双链DNA进行染检测，EB染作为参照，琼脂糖凝胶电泳为检测手段，凝胶成像系统拍照观察。结果 SYBR-Gold其前染与后染对于双链 DNA检测能力均强于 EB染，但是 SYBR-Gold预混凝胶前染其分辨效果及DNA迁移速度受到DNA浓度的影响；SYBR-Gold预混样品的前染方式对于目的基因的判读误差较大。结论SYBR-Gold 不适合预混样品前染，DNA样品浓度过大（大于250 ng）不适合预混凝胶前染，SYBR-Gold后染是理想的染方式。 【期刊名称】《中国实验诊断学》
【年(卷),期】2015(000)002
【总页数】5页(P194-198)
【关键词】SYBR-Gold;溴化乙锭;核酸染剂;琼脂糖凝胶电泳
【作 者】金磊
【作者单位】徐州医学院 医学生物化学与分子生物学教学实验中心，江苏 徐州 221002
【正文语种】中 文
【中图分类】R392.3
核酸染在基因工程领域应用非常广泛，结合琼脂糖凝胶电泳可以分离、鉴定DNA片段大小，对于DNA浓度也可以根据荧光激发强度进行半定量［1］。目前，对于凝胶染的核酸染剂，溴化乙锭（Ethidium bromide、EB）仍然占据主导地位，EB可以结合双链DNA、单链DNA以及RNA，EB结合双链DNA后荧光强度激发比游离凝胶中的EB发出的荧光强度大20－25倍［2］，具备优越的DNA检测能力，在琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶中可分别检测痕量的双链DNA。但是EB具有致突变性，对于环境安全有一定影响［3］。
随着对核酸染剂研究的深入以及化学合成技术的发展，出现了一些经过改进的花青类核酸染剂，相对于EB具有染灵敏度高、环保、对核酸的结合具有选择性等特点。比如SYBR GreenⅠ结合双链DNA能力远强于单链DNA及RNA，因此可以作为实时定量PCR的核酸染剂，SYBR－Gold可以结合双链DNA、单链DNA及RNA，在结合双链DNA后具有2个荧光激发峰，一个位于300nm处，另一个位于495nm处，且对于核酸的检测能力均高于EB及其他SYBR系列的染剂［4］。而且安全、环保，已有文献报到SYBR Gold在Ames
实验中没有发现至突变性［5］。但是SYBR－Gold试剂价格要远高于EB，为了降低使用成本，使用SYBRGold做前染的优势报道越来越多［6］，尤其是使用SYBR－Gold染样品的前染方式会极大的节约试剂的用量［7，8］，而另有文献报道这种染方式会使得DNA迁移速度发生滞后［4］。因此本文使用EB作为参照，使用后染及前染两种染方式评估SYBR－Gold在检测双链DNA的灵敏度以及染特点，给选择使用SYBR－Gold以及适合这种染剂的染方式提供参考。
1.1 质粒与菌株原核表达载体pXMCB－B2及菌种JM101为为本实验室保存
1.2 主要试剂PCR体系、分析级琼脂糖凝胶、质粒提取试剂盒购自Promega公司、凝胶纯化试剂盒购自生工（上海）生物工程有限公司、1kbDNA ladder、100bpDNA ladder、Gel loading Dye 6x购自NEB公司，SYBR－Gold in DMSO购自invitrogen公司；EB、DMSO购自Sigma公司，1xTBE缓冲液（final concentrations of 45mmol／L Tris－Boric Acid，2mmol／L EDTA PH：8.3）为实验室配置。
1.3 前染及1%凝胶配置称取0.6g琼脂糖溶于60ml 1xTBE缓冲液中，使用65℃水浴加热待琼脂糖全部融化，量筒分别量取30ml凝胶共2份，分别加入SYBR－Gold（10000x）3μl
、EB（0.5μg／ml）3μl混匀后分别灌至6x6cm胶槽中，然后放置于室温约1小时待其凝固。后染凝胶配置同前染，但是凝胶中不加染剂。
1.4 后染电泳结束后将不含染剂凝胶放入1xTBE缓冲液的容器中，使凝胶完全侵入缓冲液，缓冲液中分别含SYBR－Gold：10000x、EB：0.5μg／ml，摇床低速染40min。
1.5 电泳将无染剂凝胶放入同一电泳槽，含染剂凝胶使用单独电泳槽在同一条件下分别电泳。电压1.5V／cm2，时间60min。
1.6 目的基因的扩增与纯化使用实验室保存质粒为模板，使用特异性上游、下游引物扩增长度为711 bp的目的基因，PCR反应程序为94℃预变性2min、94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸1min；变性、退火、延伸共计25个循环；最后72℃延伸5min。测序正确后使用凝胶纯化系统进行纯化。
1.7 PCR产物的浓度测定取2μl的PCR产物，使用Thermo公司的NanoDrop2000系统进行DNA浓度测定，然后将DNA稀释至25ng／μl冻存备用。
1.8 DNA ladder浓度与SYBR－Gold浓度稀释1kb DNA ladder按照每6μl 8ng、16ng、35ng
、63ng、125 ng、250ng、500ng的浓度稀释配置备用；其中500ng从0.5kb到10kb每条带对应质量为42ng、42ng、36ng、48ng、125ng、33ng、42ng、50ng、42ng、42ng，其余浓度按照稀释倍数类推。SYBR－Gold按照1∶167、1∶333、1∶667、1∶1 000稀释于60%DMSO中，染样品后SYBR－Gold被稀释6倍，其终浓度为：1∶1 000 1∶2 000 1∶4 000 1∶6 000。
2.1 EB与SYBR－Gold预混凝胶前染特性分析
如图A、B分别为EB与SYBR－Gold前染，1－7上样量分别为：8ng、16ng、32ng、63ng、125ng、250ng、500ng电泳在同一条件下进行，电泳结束后立即拍照，我们发现：1、EB与SYBR－Gold对于双链DNA最小检测量能力与DNA片段大小相关，对于0.5kb的DNA片段EB最小检测量约为5ng（第4列），而SYBR－Gold最小检测量约为0.6ng（第7列），随着DNA片段的增大，两种染剂的检测能力均有所增强，3－10kb的DNA片段EB的最小检测量约为0.6ng（第1列），而SYBR－Gold染至第一列仍然较清晰，因此SYBR－Gold的前染的最小检测量应小于0.6ng。2、EB染较SYBR－Gold染分辨效果好，SYBR－Gold前染的分辨效果与DNA浓度相关，当DNA总浓度为250ng以上时（
第6列），3－10kb的DNA条带不能分辨。3、SYBR－Gold染当浓度为250ng以上时，3－10kb的DNA条带其迁移速度明显增加。因此SYBRGold预混凝胶前染不适合检测浓度超过250ng的DNA品。
2.2 EB与SYBR－Gold后染特性分析
凝胶后染是电泳完毕后再进行单独染，因此DNA条带在介质中移动不受染剂干扰，对于目的基因判断更准确，DNA也不易产生弯曲、变形、拖尾等现象。后染使用的样品DNA、上样量、电泳条件与前染完全一致，电泳结束后将凝胶分别放入含有EB（0.5μg／ml）与SYBR－Gold（10000x）的1xTBE缓冲液中进行后染，如图2，A为EB后染，B为SYBR－Gold后染。结果显示：后染检测双链DNA的效果较前染更有优势，EB后染对于0.5kb的双链DNA片段最小检测量约为2.7ng（第3列），而3kb之后的双链DNA片段最小检测量至少为0.6ng（第1列），而SYBR－Gold后染每条DNA条带都清晰可见，由此可见SYBRGold后染对于双链DNA检测的灵敏度优于EB染及SYBR－Gold前染。
2.3 SYBR－Gold预混样品前染特性分析
有报道称染样品法的前染可以极大的节省染剂的用量［7，8］，SYBR－Gold是否适合此种染方法，我们进行检测，如图3，1－4分别是将SYBR－Gold按照1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000的终浓度染250ng的DNA样品，并在避光的环境中静止15分钟，然后进行电泳。我们发现随着SYBRGold浓度的稀释，不仅DNA条带的荧光强度发生衰减，而且DNA的迁移速度也逐渐增快。这种现象说明SYBR－Gold稀释浓度会影响DNA的迁移速度。另外有文献报道，SYBR－Gold预混样品前染其迁移速度也会受到DNA浓度影响［9］。
2.4 SYBR－Gold预混样品对目的基因判断的影响
通过上述实验发现SYBR－Gold预混样品的染方式中，其稀释浓度会影响DNA的迁移速度，这种现象对于使用分子量标准DNA来判断目的基因片段大小是否会发生显著影响，我们进一步检测，。如图4－A，1－8为按照比例稀释在DMSO中的SYBR－Gold同时染目的基因（711bp）与分子量标准DNA（100bp DNA ladder，NEB），SYBR－Gold的终浓度为1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000，在避光环境中放置15分钟后电泳检测，我们发现不同浓度稀释的SYBR－Gold对目的基因的判断不尽相同，图中分子量标准DNA
在0.5kb与1kb之间依次为0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb，相同目的基因样品（711bp），其大小在各浓度稀释的SYBRGold染的情况下依次为：约1kb（1∶1 000）、约0.95kb（1∶2 000）、约0.85kb（1∶4 000）、约0.95 kb（1∶6 000）。图4－B为SYBR－Gold后染作为参照。可见在每种SYBR－Gold浓度稀释情况下目的基因的判读与其实际大小均不符，最接近实际大小的0.85bp仍然误差约140bp（约20%），无法达到实验要求，因此我们认为SYBR－Gold不适合预混样品的前染方式。
