第一章 原材料的选择
前言
虾青素（Astaxanthin），即 3,3’-二羟基 -4,4’-二酮基-β,β’-胡萝卜素，分子式为C40H52O4，相对分子质量为596，其结构式如下(其中R= CH3)。呈鲜红，在水生动物、鸟类羽毛及植物叶、花、果中广泛存在，具有极强的抗氧化、抗癌变、 增强免疫作用的功能。
一 虾青素的生理功能
虾青素可淬灭单线态氧，清除自由基，阻止脂质过氧化，保护机体免受伤害, 预防癌症发生，
还能促进人体免疫球蛋白的产生，具有更高的免疫调节活性。研究表明，虾青素具有抗氧化活性的类胡萝卜素,虾青素的抗氧化性比β-胡萝卜素高约10倍，比维生素E高约500倍。虾青素已被认为是“超级维生素E”。体外细胞培养试验研究虾青素对鼠免疫活性细胞的繁殖及功能的影响，结果显示虾青素比裸藻酮和β-胡萝卜素具有更高的免疫调节活性。最新研究表明，虾青素具有比β-胡萝卜素更强的抑制癌变的能力。
二 虾青素的商业开发
由于动物本身不能够合成虾青素，而且绝大部分动物也不能把其他类胡萝卜素转化成虾青素，因此必须从食物中摄取虾青素。目前虾青素已经在美国被批准为食品添加剂，并且在三文鱼的养殖中得到了很好的应用。现在市场上虾青素的售价很高，单价达2000-2500美元每公斤（虾青素含量3%），而虾青素软胶囊每瓶140元，每瓶虾青素总量为360mg。在2000年，虾青素的市场容量估计就已经达到了每年2亿美元。因此进一步研究虾青素对人体的作用，开发相关的保健品和保健化妆品，则可以扩大天然虾青素的应用范围和市场。
三 虾青素的来源
一）化学合成
虾青素化学合成法要经过多步化学和生物催化反应才能完成，其化学合成的前体物质为（S-3-乙酸基-4-氧代-β-紫罗酮，它是不同的微生物对（R）萜烯醇醋酸盐不对称水解，经过萃取，反流分布及重结晶等技术处理而得到产物。人工合成的虾青素大多为顺式结构，而生物体合成的虾青素大多为反式结构。动物体对人工合成的虾青素吸收能力较弱，而且人工合成的虾青素的着能力和生物效价远比天然虾青素低。因而目前的虾青素生产主要是从单胞藻、酵母和水产品废弃物中提取天然虾青素。 二）天然虾青素的生产
1 利用藻类生产虾青素
目前报道可生产虾青素的微藻有雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）、湖泊红球藻（Haematococcus lacustris）和湖泊红球藻（Chlorococcum sp.）。雨生红球藻中虾青素含量可达10-40mg/g，是自然界中天然虾青素含量最高的生物。利用大规模养殖红球藻生产虾青素是目前天然虾青素工业化生产的一条重要途径。但是藻类的自养周期长，需要光
照，生产场所在一定程度上受到限制，并且藻类破壁释放虾青素困难，因此进行大规模生产比较困难。
2 利用发夫酵母生产虾青素
已知能生产虾青素的微生物有乳酸分支杆菌（Mycobacterium lacticola）、短杆菌103（Brevibacterium），以及真菌担子纲的发夫酵母属（Phaffia rhodozyma）。其中乳酸分支杆菌只能在烃类培养基上而不能在营养琼脂上产生虾青素，而短杆菌103要在石油上生长，发酵结束时虾青素产量不足0.03mg/g，因此，两者实际应用的意义均不大。酵母作为素开发源具有许多有利的条件，如不需光照，可异养代谢，生长快、可高密度培养等，用廉价的纤维素酶水解产物培养的红发夫酵母中虾青素含量也可达到720-1080μg/g，但相对于红球藻来说，酵母中虾青素的含量仍太低。
3 从水产品废弃物中提取虾青素
在自然界中，虾青素主要以酯的形式大量存在于软体动物(如虾及蟹)的壳内，虽然含量低，甲壳中的灰分和甲壳质也限制了虾青素的提取，但由于目前还没有到更好的方法。
目前，挪威等国家采用的青贮技术的回收率较高 ( 180 μ g/g 废弃物) , 且纯度也较其他处理方法高。国内外的虾蟹加工业每年有1000万吨的甲壳类废弃物，资源丰富。
目前，主要是从甲壳类水产品的废弃物中提取虾青素。全世界每年有几百万吨的虾壳作为甲壳质生产的原料，工业上用酸碱交替法制备甲壳质后会产生大量的含有虾青素和蛋白质的酸碱废水，对环境造成了污染。如果能在生产甲壳质的同时又能提取出虾青素和蛋白质，不仅可以使企业获得更大的经济利益，而且有利于提高甲壳质的质量，减少废水的度，对废水治理具有积极的作用。
四 水产废弃物来源
长江三角洲等地的人喜欢吃龙虾(本文所指的龙虾学名克氏原赘虾，俗称淡水小龙虾)。每只小龙虾的可食比率为20%一30%，还有70%一80%的部分(主要为虾头和虾壳)被废弃。而在这些被废弃掉的虾壳和虾头里，蕴藏着巨大的经济价值。如果能对废弃的虾头、虾壳形成产业化、规模化的深加工和综合利用，其衍生的高附加值产品有近100项，转化增值的直接效益将逾1000亿元。
目前，虾蟹壳大多被当作废物丢弃，既污染环境，又造成浪费。若能抓住这个商机，变废为宝，会得到巨大收获，前景非常好。
目前，龙虾壳收购有很大的市场空间，被收购的只占1/5，很多餐馆和家庭都把龙虾壳当垃圾倒掉。南京人每年要消费掉1000一2000吨龙虾。800吨螃蟹，扔掉龙虾蟹壳1500吨;合肥人l年消费龙虾4.2万一5.4万吨，扔掉龙虾壳2万吨以上。
第二章 提取实验方案设计
一 碱液提取法
甲壳加工下脚料中的虾青素是以结合蛋白的形式存在的。当用酸溶解甲壳上的CaCO3 后，再用碱法(NaOH＋Na2CO3)煮下脚料时，其中的蛋白质溶出，而与蛋白质结合的虾青素也随之溶出，从而达到提取虾青素的目的。Mikalsen的专利中最早报道了这种方法：将虾壳等置于沸碱液中使虾青素溶出，然后加酸沉淀或冷却将虾青素分离出来。丁纯梅等先将龙虾壳用1 mol/L HCl 浸泡24 h，后用2mol/LNaOH回流10h，过滤后滤液用酸调pH 至2，析出沉淀，然后再过滤，沉淀物即为富含虾青素的提取物。
提取步骤：新鲜虾壳洗净破碎→浸泡→去液→清水洗净→调pH→低温稀碱浸提→过滤→ 冷却→ 调pH → 过滤→ 砖红膏状物。
新鲜虾壳的预处理: 虾壳在提取之前需进行机械破碎, 以增大溶剂与壳的接触面积, 从而提高提取率。常用的破碎方法有组织捣碎、研磨等。
1 mol/LHCl浸泡: 虾壳上部分素与碳酸钙结合紧密, 需对甲壳进行脱钙处理, 以减少虾青素与钙的结合,从而提高虾青素的提取率。
2 mol/LNaOH回流:甲壳加工下脚料中的虾青素大多与蛋白质结合, 以素结合蛋白的形式存在。当用热碱液煮下脚料时,其中的蛋白质结合的虾青素也随之溶出,从而达到提取虾青素的目的。
调pH : 将提取液pH值调为2, 沉淀虾青素。
最佳的提取条件为固液比1：4(m/V)、氢氧化钠浓度0.5 mol/L、提取温度50℃,该条件下虾青素的提取率为9. 31%。
二 有机溶剂法
有机溶剂是一种提取虾青素的有效试剂, 通常提取后可将溶剂蒸发, 从而将虾青素浓缩, 得到浓度较大的虾青素油, 同时溶剂也可回收循环利用。常见的溶剂有丙酮、 乙醇、 乙醚、 石油醚、 氯仿、 正己烷等,不同的溶剂提取效果不同。在研究发现, 丙酮的提取效果最好,而乙醇最差,并且从提取液的吸收波谱看,不同提取剂提取的素中其具体成分也有所差异。有机溶剂法提取可采用浸提和回流提取的方法,但资料报道较多的主要是浸提法。
提取步骤：虾头和虾壳混合物→有机溶剂一次提取→抽滤→有机溶剂二次提取→抽滤→合并滤液→稀释→测定含量
常用乙酸乙酯、异丙醇、丙酮、石油醚、乙醇、二氯甲烷为提取溶剂，常温，浸提时间2 h，浓缩后用石油醚溶解，在468 nm 处测吸光值（虾青素在石油醚中的最大吸收波长为468 nm）。
提取pH4.0，温度为50 ℃，时间2.5 h，此工艺条件下得到的虾青素含量最大，为49.1 μg/g 原料。提取温度为主要因素，其次为提取时间，提取pH 值。
三 超临界CO2 萃取法
虾壳粉碎→稀酸处理→冲洗至中性→干燥→装料、密封→超临界静态萃取1h→超临界循环萃取1h →收集→皂化→液相谱分离纯化→包装→冷冻保藏
超临界CO2 萃取法提取虾青素的最佳：萃取压力为40MPa，萃取温度为60℃,稀酸处理能够促使虾青素的提取率高。
四 酶处理提取流程
虾壳5g→加缓冲液混合→恒温水浴振荡酶解→冰水浴冷却→布氏漏斗双层滤纸抽滤→并反复用水冲洗(除去矿物质) →沉淀物加入丙酮25mL→置入超声波清洗池10min→摇床常温振荡1h→冷冻离心机在10000r/min→4℃下离心10min→取上清液→理化测定。
最佳工艺条件为：固液比为1:2，酶解温度48.5℃，酶解pH值5.8，水解时间63min，酶与底物比为2522U/g，提取总类胡萝卜素11576ug/g；高效液相检测其虾青素浓度达到达到13.06％，比用有机溶剂直接提取法的释放率有显著提高。
五 方法的比较优劣及实验方法的选择
碱液提取法在工过程需消耗大量酸碱, 碱提的过程需消耗大量的酸、碱，其废水对环境污染严重，而且虾青素通过在碱性环境下的高温处理，虾青素已被氧化成为鲜红的虾红素。
有机溶剂法：虾青素在乙醇等强极性溶剂中的溶解性差，为了提高效率，常需在高温条件下操作，而虾青素热稳定性差。
超临界CO2 萃取法：该法可以避免虾青素的降解，得到高品质的产品，又可以有效地提取虾青素，但原料体积大，含量低，生产成本高，难适应于工业化生产。
本实验选用酶法提取虾青素。酶法提取虾青素，此法较其他方法温和，避免使用强酸强碱物质，生产废水对环境污染小，对实验设备要求低，且提取率较高。本方法为虾的废弃物的利用提供了新的思路和方法。
六 单因素实验
通过单因素实验确定虾壳酶解的五个因素水解时间、酶与底物比、温度、pH和物液比的最适条件。
一）水解时间的确定
为了确定水解时间对水解度的影响，准确称取虾头30g，在pH9.0、固液比1:1.5、温度60℃、酶与底物比为2000u/g的情况下分别水解1h、2h、3h、4h、5h、6h，观察不同酶解时间对酶水解效果的影响，绘制趋势线。
二）酶与底物比的确定
为了确定酶与底物比对水解效果的影响，准确称取虾头浆30g，在pH9.0、固液比1:1.5、温度60℃、水解3h条件下，分别按酶与底物比500U/g、1000U/g、1500U/g、2000U/g、2500U/g、3000 U/g、3500u/g加入酶，观察不同酶与底物比对酶水解效果的影响，绘制趋势线。
三）水解温度的确定
为了确定水解温度对水解效果的影响，准确称取虾头浆30g，在pH9.0、固液比l：1．5、酶与底物比2000u/g、水解时间3h，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下进行水解，观察不同酶解温度对酶水解效果的影响，绘制趋势线。
