刘文强1，贾玉萍2，赵宏坤3
(1.聊城大学农学院，山东聊城 252059；2.山东大学生命科学学院，山东济南 252100；3.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018)
摘 要：细菌的16 S 核糖体RNA(ribosome RNA，rRNA)以其在进化上的特征性序列，现已被广泛用于细菌分类和鉴定的分子指标。其具体操作是，以聚合酶链式反应(PCR)分离细菌样本中的16 S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得其序列信息，再与16 S rRNA数据库中的序列数据进行比较，确定其在进化中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。文章综述了16 S rRNA作为微生物系统分子分类鉴定的理论基础和方法，以及在细菌分类鉴定中的应用。 关键词：16 S rRNA；细菌；鉴定；分类
传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定。大量菌种的分
类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。Cai H Y等[1]认为，rRNA基因序列己成为一个分子指标，可以广泛地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究。目前，大量已知微生物的DNA都被测定并输入国际基因数据库，成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统，从而可以通过对未知微生物DNA序列的测定和比较分析，达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的。随着微生物核糖体数据库的日益完善，该技术已应用于海洋、湖泊和土壤、大气微生物菌和病原微生物等环境微生物多样性的分析[2]。
1 16 S rRNA作为细菌分子鉴定的依据
细菌核糖体的RNA含有3种类型，即23 S rRNA、16 S rRNA和5 S rRNA，它们含有的核苷酸分别约为2 900个，1 540个和120个。20世纪60年代末，Woese开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的rRNA特征序列，认为16 S rRNA及其类似
的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。其主要依据为，它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。5 S rRNA虽易分析，但由于核苷酸少，没有足够的遗传信息用于分类研究。而23 S rRNA含有的核苷酸数几乎是16 S rRNA的2倍，分析较困难。与此相比， 16 S rRNA的相对分子质量适中，作为研究对象较理想。
在相当长的进化过程中，rRNA分子的功能几乎保持恒定，而且其分子排列顺序有些部位变化非常缓慢，以致保留了祖先的一些序列。即rRNA结构既具有保守性，又具有高变性。保守性能够反映生物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索；高变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列，是属种鉴定的分子基础。而且rRNA在细胞中含量大，一个典型的细菌中含有10 000个～20 000个核糖体，易于提取，可以获得足够的使用量，供比较研究之用。根据核糖体16 S rRNA结构变化规律，在所测定的区域中包括了V1、V2、V3和V4共 4个高变区，尤其是V2这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息，足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。因此，Johes S W和Neller H F等报道测定16 S rDNA基因的部分序列即可达到对分离物进行分子鉴定的目的[3-5]。
2 16 S rRNA序列分析鉴定细菌的基本原理和方法
通过比较各类生物16 S rRNA的基因序列，从序列差异计算它们之间的进化距离，可以绘出生物进化树。因此，16 S rRNA序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中16 S rRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16 S rRNA序列信息，再与16 S rRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。
2.1 基因组DNA的获得
首先从微生物样品中直接提取总DNA，对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取。另一种选择是提取微生物细胞中的核糖体RNA。一个典型的细菌含有10 000个～20 000个核糖体，而基因组DNA中rrn操纵子(即rDNA序列)的拷贝数相对较少(原核生物一般为1个～10个左右)，因此，rRNA在细胞中的含量很高，易于获得较多的模板，但是RNA易于降解，RNA的提取技术相对于DNA的提取较为复杂，一般研究多采用提取细胞总DNA，但也可根据情况选择提取rRNA。由于rRNA在死亡的细胞中很快降解，提取rRNA通过反转录钓取16 S rDNA序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活体细胞。
2.2 16 S rRNA基因片段的获得
过去常常将提取的总DNA经酶切后克隆到λ噬菌体中建立DNA库，进一步通过16 S rRNA通用探针进行杂交，筛选含有16 S rDNA序列的克隆(鸟法)。由于PCR技术的产生和发展，现在一般采用16 S rRNA引物PCR扩增总DNA中的rRNA序列，或通过反转录PCR获得互补C rDNA序列后再进行分析。采用PCR技术的优点在于不仅一次性从混合DNA或RNA样品中扩增出16 S rRNA序列，而且方便了后面的克隆和测序。但也同样会出现PCR所固有的缺点，尤其是采用16 S rRNA保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增，可能出现嵌合产物(Chimeric product)和扩增偏嗜性现象，影响结果的分析。
2.3 通过16 S rRNA基因片段分析对微生物进行分类鉴定
16 S rRNA基因片段的分析方法主要包括以下3种：①将PCR产物克隆到质粒载体上进行测序，与16 S rRNA数据库中的序列进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类，该方法获得的信息最全面，但在样品成分复杂的情况下需要大量的测序工作。②通过16 S rRNA种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组成信息。此外，探针也可以直接与样品进行原位杂交检测，通过原位杂交不仅可以测定微生物的形态特征和丰度，而且能够分析它们的空间分布。该方法简单快速，主要应用于快速检
测，但可能出现假阳性或假阴性结果。③对PCR产物进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)分析，通过观察酶切电泳图谱、数值分析，确定微生物基因的核糖体型，再同核糖体库中的数据进行比较，分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系。
3 以16 S rRNA为基础建立的各种方法及其应用
细菌培养、免疫学方法等虽广泛应用于对病原菌的检测，但都存在一定的不足，如所需时间长、敏感度低等。随着分子生物学及基因诊断技术的进步，在分子水平检测微生物，为感染性疾病诊断提供了新的检测手段。16 S rRNA为所有细菌共有，是细菌进化过程中最为保守的基因，有些基因序列在长期进化过程中始终保持稳定，另外，基于其在细菌染体上存在多个拷贝，现已作为标记基因广泛应用于细菌分类学和细菌的分子流行病学研究中。以16 S rRNA基因为基础，建立的PCR、套式PCR、多重半套式PCR、RT-PCR以及寡核苷酸探针已应用于临床细菌的鉴定，序列分析，细菌的分子分类，确定系统发育等[6-7]。
Greisen等设计了细菌共同引物对176种菌株进行16 S rRNA基因高度保守序列PCR，均获
阳性结果。以16 S rRNA的基因片段作探针，检测其在不同弧菌菌株中由于染体DNA序列的变异而致杂交谱带差异的分子流行病学方法也有很多应用。以16 S rRNA的基因片段作探针对弧菌部分菌株(包括EVC流行株和VCO 139)进行了16 S rRNA基因分型[8]。细菌16 S rRNA基因兼有保守性和变异性，闫志勇等[9]建立了多重半套式聚合酶链扩增(multiplexsemi nested PCR)的方法，对脑脊液标本中细菌的感染进行检测。以16 S rRNA作为引物，利用PCR技术来诊断麻风病，在20世纪90年代初期开始出现在国外有关杂志中。熊俊浩等利用麻风分支杆菌的特异性分子片段16 S rRNA作引物，采用PCR技术，对16 S rRNA分子片段PCR诊断麻风病的特异性方面进行研究。吴雪琼等发现16 S rRNA基因123 275位核苷酸附近是原核生物高度变异的区域，通过PCR-SSCP方法分析分支杆菌16 S rRNA基因片段，根据其电泳图谱与标准株的相似性进行菌种的初步鉴定。用16 S rRNA并结合限制性内切酶消化，获得的限制性片段长度多态性资料已广泛用于亲缘关系分析。从20世纪70年代开始，Woese和他的同事们用16 S rRNA寡核苷酸序列分析技术对400多株原核生物和真核生物进行分析。以细菌特异的引物扩增16 S rRNA，构建质粒文库，用限制性内切酶消化获得16 S rRNA基因型，用基因型的种类及频率对细菌进行鉴定[6-7]。刘文强等[10]对奶牛链球菌、葡萄球菌和附红细胞体的16 S rRNA进行了PCR扩增
和序列分析，并应用于相应疾病的诊断。
4 问题和展望
环境中的细菌无处不在，所以在试验中如何控制细菌污染是一个关键问题。通过各个环节的严格无菌操作，选择恰当的扩增循环次数，DNA提取、扩增和产物分析的隔离措施，以及使用一次性吸头等，可提高诊断的正确性和可靠性。一般PCR通常仅对特定病原体进行检测，而在病原体未明时，需用多种不同引物对多种病原微生物分别进行PCR扩增，往往费时费力，而临床上根本不可能用PCR逐一探测每种可能的病原菌来判断感染的病因，使得PCR技术在临床病原体检测中的应用受到了限制。核糖体rRNA对所有生物的生存都是必不可少的。其中16 S rRNA在细菌及其他微生物的进化过程中高度保守，被称为细菌的“分子化石”，同时其保守性又是相对的，在保守区之间存在着9个～10个变异区(V1～V10)，不同细菌的科、属、种间都有不同程度的差异，故16 S rRNA既可以作为细菌分类的标志，又可作为临床病原菌检测和鉴定的靶分子。以细菌核糖体16 S rRNA基因为靶分子的PCR，可早期判断细菌感染的存在，并通过对扩增产物的进一步分析对病原菌的种属作出鉴定，弥补了以上不足，是感染性疾病诊断的一个重要突破口，并已成为国内外细菌学家
的主要研究方向之一。但是由于16 S rRNA基因内所含的多态性位点较少，即使与SSCP或RFLP分析相结合，也只能将细菌鉴定至种。一些可能含有相同或相似序列的菌种或亚种，往往需测序才能鉴定，这就限制了其应用于临床快速鉴定病原菌的广泛性。为解决以上问题，国内外利用16 S rRNA设计的检测方案主要是：将两条引物设计在保守区成为通用引物，而在中间的特异区中选择序列做探针进行进一步鉴定。由于16 S rRNA序列的保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的稳定性，序列分析的重现性极高，基于当今分析技术的改进，应用16 S rRNA作为分子指标，可以实现快速、微量、准确简便的对微生物进行分类鉴定。分子分类正是在从研究的目的过渡到研究的手段。随着分子分类的理论和方法的日趋成熟，其已逐步成为微生物资源调查和环境生态研究的一种强有力的工具。16 S rRNA基因PCR扩增与计算机分析相结合已被证明是鉴定病原菌快速、有效、准确的方法，再加上生物芯片的不断开发，相信感染性疾病病原菌的检测将迈上更高的台阶。
