微生物生理生化反应
实验原理
通过测定微生物细胞内某些酶类的有无、对某些底物的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物代谢的多样性。某些细菌产生氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的氨酸，产生吲哚，当吲哚遇到含有对二甲基氨基苯甲醛试剂，形成红的玫瑰红吲哚，为吲哚反应阳性。V-P反应也称乙酰甲基甲醇试验。微生物发酵葡萄糖产生丙酮酸，2分子丙酮酸脱羧形成乙酰乳酸，继续脱羧形成乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下与胍类、肌酸类物质反应，形成红化合物，为V-P反应阳性。有些细菌发酵糖类产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使发酵液的pH下降到4.2以下，当加入甲基红试剂后，使发酵液变红。某种微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。 实验材料和方法：
材料：
培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖和蔗糖）
、酚红半固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基；
菌种：大肠杆菌（E. coli）、金黄葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）； 试剂：V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、抗生素；
仪器及用具：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、试管、移液管、滴管、杜氏小管、记号笔等。 实验方法：
1.V-P反应
取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中，空白对照不接种。置于37℃恒温箱中培养48小时。取出培养物，分别从中取出2.5mL培养液，再加入等量V-P试 剂，充分震荡后放置在37℃培养箱中温育30min。若培养液呈红，记录为V-P试验阳性反应；无者为V-P试验阴性反应；粉红者为弱阳性。
2.甲基红试验
分别从V-P实验中的培养物中取出2.5mL培养液，分别加入2～3滴甲基红指示剂，立即观察培养液颜变化。若培养液变成红，即为阳性反应，橘或黄为阴性反应，橘红为弱阳性。
3.吲哚试验
取5只装有蛋白胨水培养基的试管，以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中，空白对照不接种。置于37℃恒温箱中培养48小时。在通风橱中向培养基中加入乙醚1～2mL，振荡使吲哚尽量被完全萃取至乙醚中，沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂，加入后不能摇动。若乙醚层呈现玫瑰红，即为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。
4.糖发酵试验
取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管个4支，内装有倒置杜氏小管，杜氏小管内充满培养液，每种糖发酵试管中均分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌和普通变形菌，并有空白对照组，置于37℃恒温箱中培养48小时。与对照试管比较，若接种培养液保持原有颜，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖；若培养液呈黄，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，若培养液内地杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气。
5.微生物与氧的关系
在无菌条件下分别向3支酚红半固体培养基中穿刺接种大量枯草杆菌、大肠杆菌、丙酮丁醇梭菌，可进行三次穿刺接种，然后在37℃恒温箱中培养48小时，观察各种菌种生长状况。
6.抗生素抗菌谱及微生物抗药性
用倒平板法制作两个牛肉膏蛋白胨培养基，待冷却后想两培养基中分别接种大肠杆菌和金黄葡萄球菌。然后分别将两培养基划分为6个等大的区域，做好标记，分别在6个区域中放置红霉素、庆大霉素、卡那霉素、四环素、青霉素和链霉素。在37℃恒温箱中培养48小时，根据各种抑菌圈的大小判断各种抗生素的抗性。
7.乳酸发酵（酸奶制作）
在一个干净的纸杯中分别加入180ml纯牛奶、10g蔗糖、两勺酸奶，搅拌均匀后在42～45℃条件下培养3小时，然后放入冰箱中培养45小时。
8.细菌数量的测定
稀释：取大肠杆菌菌液，稀释后待用（浓度约为106~107cfu/mL）
加样：用吸管将大肠杆菌稀释液吹吸均匀，然后吸去少量稀释液，从计数板一侧中间平台边缘处加样，让菌液自行渗入并充满计数室，多余菌液用滤纸吸去。在计数室上方盖上盖玻片。 定位计数室：先在低倍镜下寻计数板大方格网的位置，转换高倍镜后，适当调暗光亮度至菌体和计数室线条清晰为止，再将计数室一角的小格移至视野中。顺着大方格线移动计数板，使计数室位于视野中央。
计数：计数时，使用规格为25*16型的计数板，选取左下、左上、右下、右上、中央的5个
中方格（各16个小格）计数。计数时当遇到中方格分界线上的细菌时，则“计上不计下，计左不计右”。
实验结果：
1-4：
试验项目 | V-P反应 | 甲基红试验 | 吲哚试验 | 糖发酵试验 |
葡萄糖 | 乳糖 | 蔗糖 |
大肠杆菌 | 红 | 黄 | 阳性 | +、○ | +、○ | |
产气肠杆菌 | 红 | 黄 | 阴性 | + | +（微） | |
变形杆菌 | 红 | 黄 | 阴性 | + | +（微） | +、○ |
枯草芽孢杆菌 | 淡红 | 红 | 阳性 | —— | —— | —— |
| | | | | | |
（表一：微生物生理生化的测定结果，+代表产酸，○代表产气）
(V-P反应) （微生物与氧的关系）
（甲基红实验） （吲哚实验）
（糖酵解：葡萄糖，从左至右：大肠杆菌、 （糖酵解：蔗糖，从左至右：大肠杆菌、
产气肠杆菌、变形杆菌、对照组） 产气肠杆菌、变形杆菌、对照组）
（糖酵解：蔗糖，从左至右：大肠杆菌、产气肠杆菌、变形杆菌、对照组）
5.微生物与氧的关系
大肠杆菌：在培养基上下部都生长，上中下均有气泡，基部完全被气体占据；
枯草杆菌：只在培养基表面生长；
丙酮丁醇梭菌：细菌在底部生长，产生大量气体，把培养基顶起。
6.抗生素抗菌谱及微生物抗性
| 氯霉素 | 氨苄霉素 | 卡那霉素 | 链霉素 | 无菌水 |
大肠杆菌 | 3.2 | 1.6 | 2.15 | 3.45 | 0 |
金黄葡萄球菌 | 1.05 | 0.75 | 0.75 | 0.65 | 0 |
| | | | | |
（表二：不同抗生素抑菌圈的直径长度，单位：cm）
7.乳酸发酵（酸奶制作）
自制的酸奶美味可口，但味道比市场上的酸奶稍微甜了一些。可能是蔗糖放多了的原因。
8.细菌数量的测定
视野位置 | 左上 | 左下 | 右上 | 右下 | 中央 | 平均数 |
细菌数目 | 128 | 192 | 180 | 161 | 144 | 161 |
| | | | | | |
（表三：平板计数法数每个中格的菌落数）
每立方毫米的菌落数为：161*25*103=4.03*106
分析讨论：
1.V. P. 试验
从实验结果中可以看出，大肠杆菌、产气肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌都呈阴性，但理论上产气肠杆菌为阳性反应，这可能是实验操作问题，所以原因还待进一步探究。
2.甲基红试验
从实验结果中可以看出，大肠杆菌、产气肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌都呈阳性，理论结果产气肠杆菌为阴性，这可能是实验操作问题。
3.吲哚实验
实验结果显示大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均产生玫瑰红的阳性反应，但理论结果是阳性反应还有变形杆菌。这可能是我们小组实验操作问题。
4.糖发酵试验原理
从实验结果中能够看出，三种细菌（大肠杆菌、变形杆菌、产气肠杆菌）在葡萄糖中发酵都能产酸，只有大肠杆菌能产气(理论上还应该包含产气肠杆菌)；在乳糖中，三种菌能够产酸，只有大肠杆菌能产气；在蔗糖中，只有变形杆菌能够产酸产气。
5.微生物与氧的关系
根据实验结果可以得出：大肠杆菌是兼性厌氧性细菌；丙酮丁醇梭菌是厌氧菌；枯草杆菌是好氧菌，所以它一般长在培养基的上面，仔细观察的话，可看到培养基的表面变颜。
6.抗生素抗菌谱及微生物抗性
通过对抑菌圈直径长度的测量，表明氨苄霉素、氯霉素对大肠杆菌和金黄葡萄球菌有较强的抑制作用，卡那霉素抑制作用要比前两者弱一些，而链霉素的抑制作用更弱。观察抑菌圈时一般把培养基对光观察。有的抑菌圈里有少量菌落的生长，这有可能是其他的杂菌（抗性较强），或是培养基上的菌的突变体。
