噬菌体ψHAU3的cos位点及其与寄主相互作用的功能位点attP和attB的… f一f6
第1l卷
l995
第2期
年6月
病毒
CHINESEJo【JRNALOFVIROLOGY
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No2
995
噬菌体qoHAU3的COS位点及其与寄主相互作用的
功能位点attP和attB的定位
周秀芬邓子新
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TobiasKieser:Da~.dAHopvaxKI}<，已,,I,/
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摘要HAU3是寄主范围很广的放线菌噬菌体So~hern杂交实验表明.HAU3可整合
到吸水链霉菌应城变种lO一22和变铅青链霉菌66的突变体ZXI 的染体巾，形成溶朦.茸茼 自发释放妒HAU3.不受热激和紫外线照射的诱导通过比较HAU3衍生噬牧pU8300的DNA酶
切片段在加热前后电泳带谱的区别.将HAU3的0∞位点在plJ8300的图谱上得到了定位还 利用Southern杂交的方法定位了HAU3与宿主形成溶原时附着位点(attP).并利用脉冲电泳技
术定位了在变铅青链霉菌ZX7和吸水链霉菌应城变种l0—22中形成溶原的附着位点(attB)这
信息均有利于以妒HAU3为基础的载体的发展和优化
对
关键词噬菌体,0∞.attP,attB
一
王修=2..
三种重要的农用生素的生
[.s便点,,
物合成及其遗传调控进行分子水平的研究，是我们对
吸水链霉菌应城变种10-22的主要兴趣然而，在对该菌种进行遗传操作的过程中.我们
发现链霉菌中常用的以C31衍生的载体不能感染或转染该菌株，使得有必要发展自身有效
的噬菌体载体.以前我们曾经报道了以吸水链霉菌10-22为指示菌从土壤中分离的一个噬
菌体HAU3的部分生物学特性，以及以HAU3为母体的衍生噬粒pU8300和plJ8301
的构建及其限制酶图谱的制作.本文我们将报道这个噬菌体及其与寄主相互作用的某些
特异功能区的定位
材料和方法
l菌株，噬菌体殛其繁殖方法本实验所用的菌株有天蓝链霉菌Ml45㈣.变铅青链霉菌位点特异修饰
突变株ZXI和ZX7I61，吸水链霉菌应城变种10-22：及其衍生菌株QlO5噬菌体有HAU3以受
衍生噬粒plJ83(]O和pD8~l131.细菌和噬菌体繁殖的通用技术见文献”.
2培养基殛试剂通用培养基厦试剂见文献..培养吸水链霉菌应城变种l0—22的液体培葬基为
YEME，但蔗糖的浓度只有l0%
3通用技术链霉菌大肠杆菌及其DNA体内，体外操作的通用技术参照文献㈣,Southern杂交参暇文
献
4脉冲电泳技术参照文献I10).其基本程序是：按文献所描述的通用方法培养链霉菌苗丝体，离心
事项目受到国家自然科学基金和国家教委留学服务中心资助.
1华中农业大学生命科技学院.武汉430070~2JohnInnes研究所，英国1994年3月1日牧稿.12月27日修回.
164病毒卷
收集菌丝体，并用O3mol/L蔗糖溶液洗涤两次.将菌丝体悬浮于TE25SC0.3mo1蔗糖,25rmmollL T 21m0I/kEDTA~pH8))中取50Ⅱl悬浮的菌丝体450~1TE25S和500pJ 灭菌的并于37℃水浴巾保温的
1%低溶.琼脂糖(购自SeplaqFMCRockland,Maine)混匀然后将混合物注人到带有长方体沟槽的 制胶梳中(每十梳子有12个槽，购自Pham’mcia,MiltOnKeyr~s,U.KcaUdognO.80—1102—55)，并置于
4℃水箱，使其凝固成古菌丝体的琼脂块轻轻地从制胶梳中取出琼脂块，置于溶菌酶溶液巾(1mg/mJ溶
菌酶于TE25S中),37℃酶解2小时(其间需要轻轻振荡以使琼脂块中的菌丝体充分接触溶菌酶)停止酶
解后将琼脂块转移到古有lrag/ml蛋白酶K(BoehringerMannheim,,R.K的NDS溶掖
(O5mol[LEDTA,10mmolT1%肛d)十二酰肌氨酸))中，在℃水溶
中.FLpHg,(LaumylSarcosh~e50
酶解20—40小时，再将琼脂块转移到台有0lmmo1皿苯(P}le|lkuⅡbnfluo6dePMSF，购
自Sigma公司)的TE溶液中，在4’C下处理1小时”灭活蛋白酶K，然后用TE洗涤3次，每次至少洗涤1
小时，此时的菌丝体琼脂块可置于TE中长期保存或直接用于限制酶酶解在用限制酶酶解前，将琼脂块置
于台适的酶解缓冲液中浸t5分钟.正式酶解前需要更换新鲜的酶解缓冲液，酶解过程中需加人牛血清白蛋
白用AseI(购自NEB)酶解时，通常在37℃酶解6小时或者过夜电泳时，将酶解好的琼脂块嵌入琼脂糖
凝胶中(通常足制战1%琼脂糖凝胶)，放人0.5×TBE缓冲掖中(45rm’nol/L仉,4I/L硼酸,
lmmo1EDTAfDH8)).电泳过程采用致抟设备提供的循环冷却水保持电泳缓冲液的温度在13℃选用
Asel酶解的天蓝链霉菌M145DNA做为分子量对照脉冲电泳仪为LKB公司产品(Catalogn0.
∞t5—100)
结果
1HAU3的溶原性
在吸水链霉菌lO一22和变铅青链霉菌ZX7中
斑中心可分离出生长的菌落，它们又可以释放出
