核酸寡聚物的制造方法与流程

1.本专利申请基于日本专利申请2020-118316号(于2020年7月9日提出申请)主张巴黎公约规定的优先权及利益，上述申请中记载的全部内容通过引用并入本说明书中。
2.本发明涉及核酸寡聚物的制造方法。

背景技术：

3.近年来，对核酸寡聚物在医疗领域的应用的兴趣不断高涨。例如可举出反义核酸、适配体、核酶及sirna等诱导rna干扰(rnai)的核酸等，它们被称作核酸药物。
4.核酸寡聚物可利用固相合成法合成，将在固相载体上使核酸延伸而合成的核酸寡聚物从固相载体切出，接下来，对包含核糖的核酸寡聚物而言，对核糖的2’位的羟基的保护基进行脱保护以将其除去，从而制造作为目标的核酸寡聚物。固相合成法中使用核苷的亚磷酰胺(以下称为“酰胺(amidite)”)作为原料，使用三溶液对5’位的羟基的保护基进行脱保护，这是已知的，但以往使用三溶液所合成的核酸寡聚物的收率并不总令人满意，合成也并非是高效的(专利文献1)。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：国际公开第2006/022323号公报

技术实现要素：

8.发明所要解决的课题
9.本发明的目的在于提供核酸寡聚物的高效的制造方法。
10.用于解决课题的手段
11.本技术发明人为了达成上述目的而反复进行了认真研究，结果提供核酸寡聚物的高效的制造方法，其特征在于，在合成核酸寡聚物时，使用甲醛浓度为一定以下的三溶液，或在提高三的品质后使用。
12.本发明包含以下方式，但不限定于此。
13.项1.式(2)所示的核酸寡聚物的制造方法，其包括使式(1)所示的核酸寡聚物、和甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为11
×
10-5
以下的三溶液反应的步骤，
14.[化学式1]
[0015][0016]
(式中，
[0017]
g2表示羟基的保护基，
[0018]
ba相同或彼此不同，各自独立地表示可被保护基保护的核酸碱基，r1、r2及r3相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子或烷氧基，
[0019]
r相同或彼此不同，各自独立地表示经保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或oq’基，
[0020]
q’相同或彼此不同，各自独立地表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子键合的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子键合的乙叉基，
[0021]
y相同或彼此不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，
[0022]
n表示1～200中的任一整数，
[0023]
w1表示oz基，且x1表示r基，或者
[0024]
w1表示ov基，且x1表示oz基，
[0025]
v表示羟基的保护基，
[0026]
z为具有由固相载体及连接基团组成的结构的基团。
[0027]
并且，n为2以上的整数时，可以在式(1)所示的核酸寡聚物的各核苷酸之间组入非核苷酸接头。)
[0028]
[化学式2]
[0029][0030]
(式中，
[0031]
g2、ba、r、y、x1、w1及n与前述相同，并且，
[0032]
可以以式(1)中所定义的方式，在核苷酸之间组入非核苷酸接头)。
[0033]
项2.式(2’)所示的核酸寡聚物的制造方法，其包括：
[0034]
前项1所述的步骤；
[0035]
进一步从该步骤中生成的式(2)所示的核酸寡聚物除去z所示的基团的步骤；以及
[0036]
除去羟基及核酸碱基的保护基的步骤，
[0037]
[化学式3]
[0038][0039]
(式中，
[0040]
y及n与前述相同，
[0041]bc
相同或彼此不同，各自独立地表示核酸碱基，
[0042]
g4相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子，
[0043]
r’相同或彼此不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或oq’基，
[0044]
q’与前述相同，并且，
[0045]
x3及w3分别各自独立地表示羟基，或者
[0046]
x3表示r’基，且w3表示羟基)。
[0047]
项3.根据前项1所述的制造方法，其还包括：
[0048]
得到式(3)所示的核酸化合物的步骤，前述式(3)所示的核酸化合物是将式(2)所示的核酸寡聚物利用酰胺法任意地延伸链长而成的；以及
[0049]
从式(3)所示的化合物切出式(4)所示的化合物，进一步对式(4)所示的化合物进行脱保护来制造式(5)所示的核酸寡聚物的步骤，
[0050]
[化学式4]
[0051]
[0052]
(式中，
[0053]
g2、ba、r、y、x1及w1与前述相同，
[0054]
g5表示下式所示的羟基的保护基、或氢原子，
[0055]
[化学式5]
[0056][0057]
r1、r2及r3与前述相同，并且，
[0058]
m为满足m≥n的整数)，
[0059]
[化学式6]
[0060][0061]
(式中，
[0062]
g5、r、y及m与前述相同，
[0063]
g4相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子，
[0064]bc
相同或彼此不同，各自独立地表示核酸碱基，
[0065]
x2表示羟基，且w2表示ov基，或者
[0066]
x2表示r基，且w2表示羟基，并且，
[0067]
v表示羟基的保护基)，
[0068]
[化学式7]
[0069][0070]
(式(5)中，
[0071]
g4、bc、y及m与前述相同，r’相同或彼此不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或oq’基，
[0072]
q’与前述相同，并且，
[0073]
x3及w3分别各自独立地表示羟基，或者
[0074]
x3表示r’基，且w3表示羟基)。
[0075]
项4.根据前项1～3中任一项所述的制造方法，其中，非核苷酸接头为包含氨基酸骨架的接头。
[0076]
项5.根据前项4所述的制造方法，其中，包含氨基酸骨架的接头为具有选自由下述式(a14-1)、(a14-2)及(a14-3)组成的组中的结构的接头。
[0077]
[化学式8]
[0078][0079]
(式中，y与前述相同)。
[0080]
项6.根据前项1～5中任一项所述的制造方法，其中，三溶液包含选自由二氯甲烷、乙腈、及芳香族有机溶剂组成的组中的至少1种溶剂。
[0081]
项7.根据前项1～6中任一项所述的制造方法，其中，三溶液中的甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为54
×
10-6
以下。
[0082]
项8.根据前项1～6中任一项所述的制造方法，其中，三溶液中的甲醛与三
的摩尔比(甲醛mol/三mol)为27
×
10-6
以下。
[0083]
项9.根据前项1～8中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为核糖核酸(rna)。
[0084]
项10.根据前项1～8中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为核糖核酸(rna)，其核糖的2’位的羟基的保护基为式(6)所示的保护基。
[0085]
式(6)：
[0086]
[化学式9]
[0087][0088]
(式中，
[0089]
q表示1～5中的任一整数，
[0090]
ra及rb相同或彼此不同，各自独立地表示甲基、乙基或氢原子，
[0091]
*标记表示与源自核糖的2’位的羟基的氧原子的键合点，并且，ew表示吸电子基团)。
[0092]
项11.根据前项10所述的制造方法，其中，ra及rb同时为氢原子，且ew为氰基。
[0093]
项12.根据前项1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为40链长以上的寡聚物。
[0094]
项13.根据前项1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为50链长以上的寡聚物。
[0095]
项14.根据前项1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为60链长以上的寡聚物。
[0096]
项15.根据前项1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为80链长以上的寡聚物。
[0097]
项16.根据前项1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为100链长以上的寡聚物。
[0098]
项17.三溶液，其中，甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为11
×
10-5
以下。
[0099]
项18.根据前项17所述的三溶液，其中，甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为54
×
10-6
以下。
[0100]
项19.根据前项17所述的三溶液，其中，甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为27
×
10-6
以下。
[0101]
项20.前项17～19中任一项所述的三的制造方法，其包括通过从含有包含甲醛的未纯化三、和与甲醛共沸的溶剂的溶液中共沸蒸馏去除甲醛，从而得到纯化三的步骤。
[0102]
项21.根据前项20所述的制造方法，其中，共沸溶剂的沸点为198℃以下。
[0103]
项22.根据前项20或21所述的制造方法，其中，共沸溶剂为二氯甲烷、乙腈或芳香族有机溶剂。
[0104]
项23.根据前项22所述的制造方法，其中，芳香族有机溶剂为甲苯。
[0105]
项24.核酸寡聚物的制造方法，其包括：前项20所述的三的纯化步骤；及使用该步骤中得到的纯化三的前项1～3中任一项所述的步骤。
[0106]
项25.根据前项1～16及20～24中任一项所述的制造方法，其包括选择前项17、18及19中任一项所述的三溶液作为三溶液的步骤。
[0107]
发明效果
[0108]
本发明提供高效的核酸寡聚物的制造方法。利用本发明的制造方法，可以期待所制造的核酸寡聚物的收率提高。
附图说明
[0109]
图1是示出由式(1)所示的核酸寡聚物制造式(5)所示的核酸寡聚物的典型例的路线a。图中，作为g1，只要能作为羟基的保护基发挥作用就可以没有特别限制地使用，可以广泛地使用酰胺化合物中使用的已知的保护基。另外，g3相同或彼此不同，各自独立地表示烷基，或者也可以2个g3彼此键合形成环状结构。作为g3，相同或彼此不同，各自独立地为烷基，例如优选甲基、乙基、丙基、或异丙基，更优选两者为异丙基。其他符号与前述相同。
具体实施方式
[0110]
对使甲醛浓度为一定以下的三溶液与前述式(1)所示的核酸寡聚物反应而得到前述式(2)所示的核酸寡聚物的方法进行说明。
[0111]
本发明的三溶液中的甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)通常为11
×
10-5
以下，优选为54
×
10-6
以下，更优选为27
×
10-6
以下。作为本发明的三溶液，可示例出在前述的甲醛与三的摩尔比的范围内包含甲醛的溶液。三溶液中的甲醛浓度测定方法中，有高效液相谱法。高效液相谱法中，使甲醛与乙酰丙酮反应，测定所得到的3,5-二乙酰基-1,4-二氢二甲基吡啶的量，计算出甲醛的浓度。如此可以选择前述的甲醛与三的摩尔比的范围的溶液。前述溶液例如可以利用基于下述共沸的方法直接制备，也可以选择所期望的溶液。
[0112]
三溶液中的三的浓度通常为0.1～1.2m，优选0.1～0.6m，更优选0.1～0.3m。
[0113]
作为三的稀释溶剂，只要不参与反应，则没有特别限定，可以举出二氯甲烷、乙腈、芳香族有机溶剂、水或任意的混合溶剂，可优选举出选自由二氯甲烷、乙腈、及芳香族有机溶剂组成的组中的至少1种溶剂，可更优选举出芳香族有机溶剂。作为芳香族有机溶剂，可举出甲苯。
[0114]
上述反应中的反应温度优选为0～40℃，更优选为10～30℃。
[0115]
对于三溶液中的甲醛，可以通过与任意的溶剂或任意的混合溶剂的共沸而除去，减少其量，作为共沸溶剂，只要是沸点低于三的溶剂，则没有特别限定，可以举出二氯甲烷、乙腈、芳香族有机溶剂或任意的混合溶剂，可优选举出二氯甲烷、乙腈、或芳香族有机溶剂，可更优选举出芳香族有机溶剂。作为芳香族有机溶剂，可举出甲苯。
[0116]
共沸溶剂的沸点优选为200℃以下，更优选为198℃以下。
[0117]
三溶液的保存可以使用玻璃制容器、塑料制容器、或金属制容器。作为塑料制容器，可以使用聚乙烯或聚丙烯制等的容器，作为金属制容器，可以使用sus制容器或哈
氏合金制等的容器。
[0118]
可以在空气气氛下或非活性气体气氛下保存氧化溶液，作为非活性气体，可以使用氩气、氮气、二氧化碳或氦气等。
[0119]
作为在5’位的羟基具有保护基的核酸化合物，可示例出前述式(1)的核酸化合物。作为使三溶液反应而生成的核酸化合物，可示例出前述式(2)所示的核酸化合物。
[0120]
前述式(1)及(2)中，作为呈现q’所示的、相同或彼此不同且各自独立地与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子键合的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子键合的乙叉基的化合物，具体而言，可举出下述式(7)的lna-1、lna-2、或lna-3所示的结构。
[0121]
[化学式10]
[0122][0123]
(式中，ba表示可被保护的核酸碱基。)
[0124]
作为z所示的、具有由固相载体、及将固相载体与核酸寡聚物的3’末端的核糖的2’位或3’位的羟基的氧原子连接的连接基团组成的结构的基团，更具体而言，可举出下述式(8)所示的结构。
[0125]
[化学式11]
[0126][0127]
式(8)中，sp表示间隔基。
[0128]
作为间隔基(sp)，例如可示例出具有下式(9)所示的结构式的基团。
[0129]
[化学式12]
[0130][0131]
接头(linker)例如可以是下述式(10)所示的结构，或者也可以是氨基丙基键合于si的结构，该结构在式(10)的结构中不具有六亚甲基氨基部分。或者，linker也可以是下式(11)所示的结构。
[0132]
[化学式13]
[0133][0134]
(式中，
[0135]
a可以是羟基、烷氧基、或烷基中的任一者。作为烷氧基，例如可举出甲氧基及乙氧基。作为烷基，例如可举出甲基、乙基、异丙基、正丙基。si表示与载体表面的羟基的氧键合。)
[0136]
作为固相载体(solid support)，可举出无机多孔质载体、有机系树脂载体等。无机多孔质载体例如可举出可控多孔玻璃(controlled pore glass(cpg))。有机系树脂载体例如可举出由聚苯乙烯形成的载体。
[0137]
作为本发明中使用的核酸寡聚物内所含的核苷(核糖、及脱氧核糖)，可示例出dna、rna、2
’‑
o-moe(2
’‑
o-甲氧基乙基)、2
’‑
o-me、2
’‑
f rna、以及前述的lna，但前述核苷不限定于此。
[0138]
利用包括基于前述三溶液的脱保护步骤的固相合成法进行的核酸寡聚物的合成方法典型地包括以下步骤。
[0139]
(1)对介由接头键合于固相载体的羟基经保护的核苷的5’位的羟基进行脱保护的步骤；
[0140]
(2)使前述步骤中生成的5’位的羟基与亚磷酰胺化合物进行偶联反应而得到亚磷酸三酯化合物的步骤；
[0141]
(3)使前述步骤中生成的亚磷酸三酯氧化转化为磷酸三酯而制造延伸的核酸分子，或者转化为硫代磷酸三酯的任意步骤；
[0142]
(4)反复进行任意次数的下述一系列的反应的循环，在固相载体上合成核酸分子的步骤，前述一系列的反应的循环由前述步骤(1)～(3)、即：生成的核酸分子的5’位的羟基的脱保护步骤、5’位的羟基与酰胺化合物的偶联步骤、以及生成的亚磷酸三酯的氧化步骤构成；以及
[0143]
(5)将步骤(4)中生成的固相载体上的核酸分子供于切出及脱保护的步骤，使其从固相载体上游离，制造除去了保护基的核酸寡聚物的步骤。
[0144]
其中，前述核酸寡聚物的合成方法中，继步骤(2)或(3)之后，可以包括对未进行与亚磷酰胺化合物的偶联反应的5’位的羟基进行加帽的步骤，也可以在构成步骤(4)的一系列的反应的循环的任意步骤之间加入加帽步骤。
[0145]
更具体而言，前述(5)的步骤通过下述方式来实施：将步骤(4)中生成的固相载体上的核酸分子按以下的步骤(5-1)及(5-2)的反应的顺序实施，接着供于步骤(5-3)的反应。此处步骤(5-1)的反应的实施可以是任意的，步骤(5-2)的反应的实施也可以使用日本专利第4705716号公报中记载的方法。其结果，能够制造从固相载体游离的核酸分子中除去了保护基的核酸寡聚物、或者5’末端的羟基经保护的核酸寡聚物。
[0146]
(5-1)对核酸分子的5’末端的羟基的保护基进行脱保护的反应；
[0147]
(5-2)从固相载体上切出核酸分子使其游离的反应；以及
[0148]
(5-3)对构成核酸分子的核糖的2’位或3’末端的3’位的羟基的保护基进行脱保护的反应。
[0149]
图1示出前述步骤(1)至(5)的路线。图1所示的步骤(1)或步骤(4)中的脱保护反应使用前述的三溶液而实施。路线a中的化学式中的取代基的定义与前述定义相同。
[0150]
对于前述式(1)的核酸化合物，可以进一步利用酰胺法使用核苷酸型或非核苷酸型的接头仅延伸任意的链长，并用于制造前述式(3)所示的核酸化合物。也可以从与前述式(3)的固相载体键合的核酸化合物中仅切出核酸化合物，得到前述式(4)所示的核酸寡聚物后，进一步进行脱保护而得到前述式(5)所示的核酸寡聚物。以下，对各式中的取代基进行进一步详细说明。
[0151]
ba所示的可被保护基保护的核酸碱基及bc所示的核酸碱基没有特别限定。作为该核酸碱基，可举出腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、及1-甲基假尿嘧啶等。另外，该核酸碱基也可以利用取代基进行取代。作为这样的取代基，例如可举出氟基、氯基、溴基、碘基这样的卤素原子、乙酰基这样的酰基、甲基、乙基这样的烷基、苄基这样的芳基烷基、甲氧基这样的烷氧基、甲氧基乙基这样的烷氧基烷基、氰基乙基这样的氰基烷基、羟基、羟基烷基、酰氧基甲基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基及硝基等、以及上述中的2种以上的取代基的组合。
[0152]
作为ba所示的可被保护基保护的核酸碱基的保护基，没有特别限定，可以使用已知的核酸化学中使用的保护基，作为这样的保护基，例如可举出苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、4-甲基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、及(二甲基氨基)亚甲基等、以及上述中的2种以上的保护基的组合。
[0153]
更具体而言，ba表示以下任一者所示的基团。
[0154]
[化学式14]
[0155][0156]
(上述式中，
[0157]
r4表示氢原子、甲基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯乙酰基、乙酰基或苯甲酰基，
[0158]
r5表示氢原子、乙酰基、异丁酰基或苯甲酰基，
[0159]
r6表示氢原子、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯乙酰基、乙酰基或异丁酰基，
[0160]
r7表示2-氰基乙基，
[0161]
r8表示氢原子、甲基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基或4-甲基苯甲酰基，并且，
[0162]
r9表示二甲基氨基亚甲基。)
[0163]
作为bc，更具体而言，可举出从上述ba的具体例中除去了保护基的基团。
[0164]
g5优选为以下的基团。
[0165]
[化学式15]
[0166][0167]
(式中，
[0168]
r1、r2及r3相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子或烷氧基。)
[0169]
r1、r2及r3优选1个为氢原子、剩余的2个为相同或彼此不同(优选相同)的烷氧基，作为烷氧基，特别优选甲氧基。更优选g5为4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基(dmtr基)。
[0170]
作为g2，只要能作为羟基的保护基发挥作用就可以没有限制地使用，可以广泛地使用酰胺化合物中使用的已知的保护基。作为g2，例如可举出烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基(cyclylalkyl group)、羟基烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、单烷基甲硅烷基、二烷基甲硅烷基或三烷基甲硅烷基、单烷基甲硅烷氧基烷基、二烷基甲硅烷氧基烷基或三烷基甲硅烷氧基烷基等，这些基团可被1个以上的吸电子基团取代。
[0171]
g2优选为经吸电子基团取代的烷基。作为该吸电子基团，例如可举出氰基、硝基、烷基磺酰基、卤素原子、芳基磺酰基、三卤代甲基、及三烷基氨基等，优选氰基。
[0172]
作为g2，特别优选以下的基团。
[0173]
[化学式16]
[0174][0175]
前述r1、r2、r3及g2的定义中的烷基可以是直链状或支链状中的任意者，优选碳数1～12的烷基、更优选碳数1～6的烷基。作为具体的烷基的例子，例如可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、及己基。构成前述取代基的定义中的烷氧基的烷基部分具有与此处的烷基的定义相同的定义。
[0176]
另外，本发明的方法中，酰胺化合物可以以游离的状态或盐的状态使用。作为酰胺化合物的盐，可举出碱加成盐或酸加成盐，没有特别限制。作为碱加成盐，具体而言，可举出钠盐、镁盐、钾盐、钙盐、铝盐等与无机碱形成的盐；与甲胺、乙胺、乙醇胺等有机碱形成的盐；与赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸等碱性氨基酸形成的盐；及铵盐。作为酸加成盐，具体而言，可举出与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸等有机酸；及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成的酸加成盐。酰胺化合物也包括盐、水合物、溶剂化物、及多晶型等形态。
[0177]
r优选表示经保护的羟基。r表示经保护的羟基时的保护基、或v所示的羟基的保护基只要能用于酰胺法即可，例如，2
’‑
叔丁基二甲基甲硅烷基(tbs基)、2
’‑
双(2-乙酰氧基)甲基(ace基)、2
’‑
(三异丙基甲硅烷氧基)甲基(tom基)、2
’‑
(2-氰基乙氧基)乙基(cee基)、2
’‑
(2-氰基乙氧基)甲基(cem基)、2
’‑
对甲苯磺酰基乙氧基甲基(tem基)、2
’‑
emm基(国际公开第2006/022323号公报)之外，还可以使用国际公开第2013/027843号公报及国际公开第2019/208571号公报中记载的基团。v优选为2
’‑
叔丁基二甲基甲硅烷基(tbs基)。另外，利用本发明的方法制造的核酸寡聚物为核糖核酸(rna)的情况等核酸寡聚物内包含核糖的情况下，作为该核糖的2’位的羟基的保护基，可示例出前述式(6)所示的保护基作为优选的保护基。进一步优选示例出具有氰基作为ew所示的吸电子基团的式(12)所示的保护基。
[0178]
[化学式17]
[0179][0180]
(式中，
[0181]
q、ra及rb与前述式(6)中的定义相同。)
[0182]
进一步优选示例出式(12)所示的基中q为1、ra及rb同时为氢原子的基团。
[0183]
式(12)所示的保护基可以依照例如国际公开第2013/027843号公报及国际公开第2019/208571号公报的记载而合成，可以将具有上述保护基的酰胺化合物用于核酸化合物的制造。
[0184]
核酸的延伸反应可使用图1的路线a中记载的式(13)的酰胺化合物。
[0185]
作为非核苷酸接头，可示例出包含氨基酸骨架的接头(例如，日本专利第5157168号公报或日本专利第5554881号公报中记载的包含氨基酸骨架的接头)。具体而言，作为非限定性例子，例如可示例出式(a14-1)或(a14-2)或(a14-3)(例如，记载于国际公开第2019/074110号公报)所示的接头。这些接头之外，可示例出国际公开第2012/005368号公报、国际公开第2018/182008号公报或国际公开第2019/074110号公报中记载的接头。
[0186]
[化学式18]
[0187][0188]
(式中，y与前述相同。)
[0189]
对于式(13)中的r基及式(5)中的r’基为羟基以外的取代基的核苷酸及酰胺，也可以由利用日本专利第3745226号公报等中记载的已知的方法、国际公开第2001/053528号公报或者日本特开2014-221817号公报及这些文献中引用的已知的方法而合成的核苷进行制造，此外，能够使用可作为市售品购入的物质，依照后述的实施例中记载的方法或利用对这些方法加以适当变更的方法进行制造。
[0190]
g4表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子。作为碱金属
离子，例如可举出钠离子、及锂离子。另外，作为烷基铵离子，作为具体的烷基的例子，例如可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、及己基，更具体而言，例如可举出二乙基铵离子、三乙基铵离子、四丁基铵离子、己基铵离子、及二丁基铵离子等。另外，作为羟基烷基铵离子，作为具体的羟基烷基部分的例子，例如可举出羟基甲基、羟基乙基、羟基正丙基、羟基异丙基、羟基正丁基、及三羟基甲基，作为更具体的羟基烷基铵离子的例子，可举出三羟基甲基铵离子等。g4优选表示氢原子。
[0191]
g5表示氢原子、或前述羟基的保护基，表示保护基的情况下，g1也表示相同的保护基。g5在经脱保护的情况下为氢原子，此时的核苷酸化合物也被供于一系列的核酸延伸反应的步骤。
[0192]
y优选为氧原子。
[0193]
w1及x1优选w1表示oz基且x1表示r基。
[0194]
w2及x2优选w2表示羟基且x2表示r基。
[0195]
w3及x3优选分别各自独立地表示羟基。
[0196]
r’优选为羟基。
[0197]
对于基于前述步骤(1)至(5)的酰胺法的核酸化合物的合成而言，图1的路线中的步骤(1)或步骤(5)中的本发明涉及的脱保护步骤之外，可以依照通常已知的方法(例如，前述的日本专利第5157168号公报或日本专利第5554881号公报中记载的方法)进行核酸延伸反应。以下对各步骤进行说明。
[0198]
(核酸延伸反应)
[0199]
本说明书中，所谓“核酸延伸反应”，是指介由磷酸二酯键使核苷酸依次键合，由此使寡核苷酸延伸的反应。核酸延伸反应可以依照通常的亚磷酰胺法的步骤进行。核酸延伸反应也可以使用采用亚磷酰胺法的核酸自动合成装置等来进行。
[0200]
核酸寡聚物的链长例如可以为20mer以上(即，n≥19)、40mer以上(即，n≥39)、50mer以上(即，n≥49)、60mer以上(即，n≥59)、80mer以上(即，n≥79)、100mer以上(即，n≥99)、2～200mer(即，1≤n≤199)、10～150mer(即，9≤n≤149)、15～110mer(即，14≤n≤109)。
[0201]
步骤(1)的脱保护步骤是对担载于固相载体上的寡核苷酸链末端的5’羟基的保护基进行脱保护的步骤。作为通常的保护基，可使用4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基(dmtr基)、4-单甲氧基三苯甲基、4,4’,4
”‑
三甲氧基三苯甲基。脱保护可以使用酸进行。作为脱保护用的酸，例如可举出三氟乙酸、三、三氟甲磺酸、二、甲磺酸、盐酸、乙酸、及对甲苯磺酸等。
[0202]
步骤(2)的缩合步骤是使图1的路线a中记载的下述式(13)所示的核苷亚磷酰胺与通过前述脱保护步骤进行了脱保护的寡核苷酸链末端的5’羟基键合的反应。需要说明的是，作为核酸延伸中使用的亚磷酰胺，使用式(13)或(a9)～(a12)所示的酰胺化合物。另外，作为其他可使用的亚磷酰胺，可举出2
’‑
ome、2
’‑
f、2
’‑
o-叔丁基二甲基甲硅烷基、2
’‑
o-甲氧基乙基、2
’‑
h、及2
’‑
氟-2
’‑
脱氧-β-d-阿拉伯呋喃糖基等。作为前述核苷亚磷酰胺，使用5’羟基被保护基(例如，dmtr基)保护的核苷亚磷酰胺。缩合步骤可以使用激活前述核苷亚磷酰胺的激活剂或缩合剂来进行。作为激活剂或缩合剂，例如可举出5-苄硫基-1h-四氮唑(btt)(也称为5-苄巯基-1h-四氮唑)、1h-四氮唑、4,5-二氰基咪唑(dci)、5-乙硫基-1h-四
氮唑(ett)、n-甲基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(n-mebit)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(bit)、n-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸盐(n-phimt)、咪唑鎓三氟甲磺酸盐(imt)、5-硝基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(nbt)、1-羟基苯并三唑(hobt)或5-(双-3,5-三氟甲基苯基)-1h-四氮唑等。
[0203]
图1的路线a中记载的式(13)所示的核苷亚磷酰胺(以下也称为酰胺)如下所示。
[0204]
由下式所示的化合物：
[0205]
[化学式19]
[0206][0207]
(式中，
[0208]
g1、g2、g3、ba、及r与前述相同)。
[0209]
缩合步骤之后可以适当对未反应的5’羟基进行加帽。加帽可以使用乙酸酐-四氢呋喃溶液、或苯氧基乙酸酐/n-甲基咪唑溶液等已知的加帽溶液来进行。
[0210]
步骤(3)的氧化步骤是将通过前述缩合步骤而形成的亚磷酸基转化为磷酸基或硫代磷酸基的步骤。本步骤是使用氧化剂将三价磷转化为五价磷的反应，可以通过使氧化剂与担载于固相载体上的寡核酸衍生物反应而实施。
[0211]
在将亚磷酸基转化为磷酸基的情况下，作为“氧化剂”，例如可以使用碘。该氧化剂可以以成为0.005～2m的浓度的方式进行配制而使用。作为氧化的氧源，可以使用水，作为使反应进行的碱，可以使用吡啶、n-甲基咪唑(nmi)、n-甲基吗啉、或三乙胺等。另外，作为溶剂，只要不参与反应，则没有特别限定，可举出乙腈、四氢呋喃(thf)或这些溶剂的任意比例的混合溶剂。例如可以使用碘/水/吡啶/乙腈、或者碘/水/吡啶、或者碘/水/吡啶/nmi、或者碘/水/吡啶/thf。反应温度优选5℃～50℃。反应时间通常为1分钟～30分钟是适合的。相对于担载于固相载体上的化合物1mol，所使用的试剂的量优选为1～100mol，更优选为1～10mol。
[0212]
将亚磷酸三酯基转化为硫代磷酸三酯基的情况下，作为“氧化剂”，例如可以使用硫、3h-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(beaucage试剂)、3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(adtt)、5-苯基-3h-1,2,4-二噻唑-3-酮(pos)、[(n,n-二甲基氨基次甲基)氨基]-3h-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮([(n,n-dimethylaminomethylidene)amino]-3h-1,2,4-dithiazoline-3-thione，ddtt)、及苯乙酰二硫化物(pads)。该氧化剂可以以成为0.001～2m的浓度的方式用适宜的溶剂进行稀释而使用。作为反应中使用的溶剂，只要不参与反应，则没有特别限定，例如可举出二氯甲烷、乙腈、吡啶或它们的任意比例的混合溶剂。氧化步骤可以在前述加帽操作之后进行，反之也可以在氧化步骤之后进行加帽操作，该顺序没有限定。
[0213]
步骤(5-1)中，对于在延伸最后引入的核苷酸的5’位的羟基的保护基，可以在从后
述的固相载体上切出及保护基的脱保护之后，用于以5’位的羟基的保护基为标签的柱纯化，也可以在柱纯化后对5’位的羟基的保护基进行脱保护。
[0214]
步骤(5-2)中，对磷酸保护基进行脱保护的步骤在具有所期望的序列的核酸的合成完成之后，使胺化合物发挥作用以对磷酸部分的保护基进行脱保护。作为胺化合物，例如可举出日本专利第4705716号公报中记载的二乙胺等。
[0215]
对于步骤(5-2)中的在固相载体上延伸至所期望链长的核酸寡聚物从固相载体的切出而言，通常使用浓氨水作为切出剂来实施。
[0216]
进一步使用氨或胺化合物等，例如，从固相载体上切断寡核苷酸链并进行回收。作为胺化合物，例如可举出甲胺、乙胺、异丙胺、乙二胺、或二乙胺等。
[0217]
步骤(5-3)中，步骤(5-2)中从固相载体切出的核酸化合物(4)的核糖的2’位或3’位的羟基的保护基可以依照国际公开第2006/022323号公报)、国际公开第2013/027843号公报、或国际公开第2019/208571号公报中记载的方法除去，从而得到经脱保护的核酸寡聚物(5)。
[0218]
作为可使用本发明的制造方法制造的核酸寡聚物，可举出核酸寡聚物内包含的核苷是rna、dna、以及具有2
’‑
o-moe、2
’‑
o-me、2
’‑
f的rna、及lna的核酸寡聚物，但不限定于此。例如可举出xiulong,shen等人著、nucleic acids research,2018,vol.46,no.46,1584-1600、及daniel o’reilly等人著、nucleic acids research,2019,vol.47,no.2,546-558中记载的各种核苷的例子。利用本发明的方法制造的核酸寡聚物优选为rna。
[0219]
对于本发明的制造方法中可使用的核酸寡聚物的典型的例子，除了实施例中记载的例子之外，还示出下述例子，但不限定于此。
[0220]
以下序列的说明中，u表示尿苷，c表示胞苷，a表示腺苷，且g表示鸟苷。
[0221]
可举出国际公开第2019/060442号公报中记载的、具有下述序列(a)及(b)的核酸寡聚物。
[0222]
序列(a)：5
’‑
auggaaumacucuugguumacdtdt-3’(反义)(序列号1)21mer
[0223]
序列(b)：5
’‑
gumaacmcmaagagumaumumcmcmaumdtdt-3’(正义)(序列号2)21mer
[0224]
序列(a)及(b)中，um表示2
’‑
o-甲基尿苷，cm表示2
’‑
o-甲基胞苷，且dt表示胸苷。
[0225]
可举出daniel o’reilly等人著、nucleic acids research,2019,vol.47,no.2,546-558中记载的核酸寡聚物(参见553页)。作为典型例，可举出具有下述序列(c)的核酸寡聚物。
[0226]
序列(c)：5
’‑
agagccagccuucuuauuguuuuagagcuaugcugu-3’(序列号3)36mer
[0227]
可举出日本专利第4965745号公报中记载的核酸寡聚物。作为典型例，可举出具有下述序列(d)的核酸寡聚物。
[0228]
序列(d)：5
’‑
ccaugagaaguaugacaacagcc-p-ggcuguugucauacuucucaugguu-3’(序列号4、5)49mer
[0229]
序列(d)中，“p”由在以下式(a5)中用波浪线划分的局部结构表示。
[0230]
需要说明的是，序列表中的序列号4的记载表示从序列(d)的5’末端至“p”之前为止的下述序列(d1)的碱基序列，序列号5的记载表示从序列(d)的“p”之后至3’末端为止的下述序列(d2)的碱基序列。
[0231]
序列(d1)：5
’‑
ccaugagaaguaugacaacagcc-3’(序列号4)23mer
[0253][0254]
(测定方法2：寡核苷酸收量的测定)
[0255]
测定前述粗产物的od
260
。所谓od
260
，表示1ml溶液(ph＝7.5)中的每10mm光程的uv260nm的吸光度。通常已知rna为1od＝40μg，因此基于前述od
260
的测定值计算出收量。
[0256]
(测定方法3：甲醛浓度的测定)
[0257]
三溶液中的甲醛浓度测定方法有高效液相谱法。高效液相谱法中，使甲醛与乙酰丙酮反应，测定所得到的3,5-二乙酰基-1,4-二氢二甲基吡啶的量，计算出甲醛的浓度。
[0258]
＜三溶液的制备＞
[0259]
以下的试验中使用的甲醛浓度不同的三溶液是预先制备甲醛浓度低的三溶液，并在所得到的三溶液中添加甲醛水溶液而制备的。
[0260]
＜寡核苷酸的固相合成＞
[0261]
序列(i)：5
’‑
ggcaccgagucggugcuuuu-3’(序列号12)20mer
[0262]
序列(ii)：5
’‑
aaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu-3’(序列号13)50mer
[0263]
序列(iii)：5
’‑
auaacucaauuuguaaaaaaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu-3’(序列号14)100mer
[0264]
前述序列(i)、(ii)及(iii)中，“a”由以下式(a1)中用波浪线划分的局部结构表示。“c”由以下式(a2)中用波浪线划分的局部结构表示。“g”由以下式(a3)中用波浪线划分的局部结构表示。u由以下式(a4)中用波浪线划分的局部结构表示。需要说明的是，3’末端的“u”由以下式(a8)中用波浪线划分的局部结构表示。另外，序列(i)中，5’末端的“g”由以下式(a6)中用波浪线划分的局部结构表示，序列(ii)及(iii)中，5’末端的“a”由以下式(a7)中用波浪线划分的局部结构表示。
[0265]
[化学式20]
[0266][0267]
[化学式21]
[0268][0269]
[化学式22]
[0270][0271]
[化学式23]
[0272][0273]
[化学式24]
[0274][0275]
[化学式25]
[0276][0277]
[化学式26]
[0278][0279]
[化学式27]
[0280][0281]
作为固相载体，使用可控多孔玻璃(cpg)，作为核酸合成仪，使用nts m-4mx-e(nihon techno service co.,ltd.制)，利用亚磷酰胺固相合成法，从3’侧向5’侧合成由前述序列(i)、(ii)及(iii)组成的寡核苷酸。合成以约1μmol规模实施。另外，合成中，使用us2012/0035246的实施例2中记载的尿苷emm酰胺(a11)、实施例3中记载的胞苷emm酰胺(a9)、实施例4中记载的腺苷emm酰胺(a12)、及实施例5中记载的鸟苷emm酰胺(a10)，作为脱保护(deblocking)溶液，使用3％三甲苯溶液，作为缩合剂，使用5-苄巯基-1h-四氮唑，作为氧化剂，使用碘溶液，作为加帽溶液，使用苯氧基乙酸酐溶液和n-甲基咪唑溶液。
[0282]
[化学式28]
[0283]
[0284]
[化学式29]
[0285][0286]
[化学式30]
[0287][0288]
[化学式31]
[0289][0290]
接下来，示出利用本发明的制法制造的寡核苷酸(核酸寡聚物)的具体的制造例。此处，下述的实施例中利用本发明的制法制造的寡核苷酸为具有前述序列(i)、(ii)及(iii)的寡核苷酸。
[0291]
另外，以下的实施例及比较例中记载的尿苷衍生物是指下述的结构式所示的化合物。下述结构式中图示的圆圈示意性地示出了cpg。
[0292]
[化学式32]
[0293][0294]
(实施例1)
[0295]
使用担载了0.99μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(cpg)、和式(a9)、式(a10)、式(a11)或式(a12)所示的酰胺，利用nts m-4mx-e(nihon techno service co.,ltd.制)从3’侧向5’侧自动合成序列(i)所示的核酸寡聚物。自动合成的步骤中，首先，将3％三甲苯溶液送液至cpg，对5’位的三苯甲基保护基进行脱保护。此时，使用的三溶液中的甲醛浓度可以利用测定方法3进行测定，三溶液中的甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为33
×
10-7
。接着，将各种酰胺和作为缩合剂的5-苄巯基-1h-四氮唑送液至cpg，使5’位的羟基进行偶联反应。接着，对包含50mm碘的氧化溶液进行送液，将亚磷酸基转化为磷酸基。接着，作为加帽溶液，使用0.1m苯氧基乙酸酐乙腈溶液和10％n-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液，对未进行偶联的反应位点实施加帽。进一步将这些步骤总计重复19次后，用3％三甲苯溶液将5’末端的碱基中的保护基(dmtr基)脱保护，从而在cpg载体上合成序列(i)所示的序列的核酸寡核苷酸。然后，针对担载了0.99μmol量的寡核苷酸的cpg载体，流入28％氨水1.5ml和乙醇0.5ml，将混合物于40℃保温4小时，由此使核酸寡聚物从固相载体游离，然后通过浓缩除去溶剂。接着将游离寡核苷酸溶解于二甲基亚砜1.5ml中后，加入乙腈1.0ml、硝基甲烷20μl和搅拌子后，在基于搅拌器的搅拌下于室温流入将利用分子筛4a实施了脱水处理的1m的四正丁基氟化铵(tbaf)的二甲基亚砜溶液2.08ml，将混合物于33℃保温4小时，从而进行2
’‑
emm保护基的脱保护。然后，通过沉淀操作得到核酸寡聚物的产物。对于所得到的产物，使用前述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果纯度为72.6％。另外，使用前述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为4369μg，若换算为每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的cpg的收量，则为4413μg。将结果示于表2。
[0296]
(实施例2)
[0297]
实施例1的实验中，使用担载了1.00μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(cpg)、和甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为11
×
10-5
的3％三甲苯溶液，除此以外，利用同样的方法得到序列(i)的核酸寡聚物。使用前述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果产物的纯度为71.4％。另外，使用前述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的cpg的收量为4236μg。将结果示于表2。
[0298]
(参考例1)
[0299]
实施例1的实验中，使用担载了0.97μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(cpg)、和
甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为26
×
10-5
的3％三甲苯溶液，除此以外，利用同样的方法得到序列(i)的核酸寡聚物。使用前述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果产物的纯度为69.7％。另外，使用前述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为3982μg，若换算为每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的cpg的收量，则为4105μg。将结果示于表2。
[0300]
(实施例3)
[0301]
使用担载了1.01μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(cpg)、和式(a9)、式(a10)、式(a11)或式(a12)所示的酰胺，利用nts m-4mx-e(nihon techno service co.,ltd.制)从3’侧向5’侧自动合成序列(ii)所示的核酸寡聚物。自动合成的步骤中，首先，将3％三甲苯溶液送液至cpg，对5’位的三苯甲基保护基进行脱保护。此时，使用的三溶液中的甲醛浓度可以利用测定方法3进行测定，三溶液中的甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为33
×
10-7
。接着，将各种酰胺和作为缩合剂的5-苄巯基-1h-四氮唑送液至cpg，使5’位的羟基进行偶联反应。接着，对包含50mm碘的氧化溶液进行送液，将亚磷酸基转化为磷酸基。接着，作为加帽溶液，使用0.1m苯氧基乙酸酐乙腈溶液和10％n-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液，对未进行偶联的反应位点实施加帽。进一步将这些步骤总计重复49次后，用3％三甲苯溶液将5’末端的碱基中的保护基(dmtr基)脱保护，从而在cpg载体上合成序列(ii)所示的序列的核酸寡核苷酸。然后，针对担载了1.01μmol量的寡核苷酸的cpg载体，流入28％氨水1.5ml和乙醇0.5ml，将混合物于40℃保温4小时，由此使核酸寡聚物从固相载体游离，然后通过浓缩除去溶剂。接着将游离寡核苷酸溶解于二甲基亚砜1.5ml中后，加入乙腈1.0ml、硝基甲烷20μl和搅拌子后，在基于搅拌器的搅拌下于室温流入将利用分子筛4a实施了脱水处理的1m的四正丁基氟化铵(tbaf)的二甲基亚砜溶液2.08ml，将混合物于33℃保温4小时，从而进行2
’‑
emm保护基的脱保护。然后，通过沉淀操作得到核酸寡聚物的产物。对于所得到的产物，使用前述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果纯度为43.1％。另外，使用前述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为9941μg，若换算为每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的cpg的收量，则为9843μg。将结果示于表2。
[0302]
(实施例4)
[0303]
实施例3的实验中，使用担载了1.01μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(cpg)、和甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为11
×
10-5
的3％三甲苯溶液，除此以外，利用同样的方法得到序列(ii)的核酸寡聚物。使用前述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果产物的纯度为36.5％。另外，使用前述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为9710μg，若换算为每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的cpg的收量，则为9614μg。将结果示于表2。
[0304]
(参考例2)
[0305]
实施例3的实验中，使用担载了1.02μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(cpg)、和甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为26
×
10-5
的3％三甲苯溶液，除此以外，利用同样的方法得到序列(ii)的核酸寡聚物。使用前述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果产物的纯度为33.2％。另外，使用前述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为9158μg，若换算为每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的cpg
的收量，则为8978μg。将结果示于表2。
[0306]
(实施例5)
[0307]
使用担载了1.00μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(cpg)、和式(a9)、式(a10)、式(a11)或式(a12)所示的酰胺，利用nts m-4mx-e(nihon techno service co.,ltd.制)从3’侧向5’侧自动合成序列(iii)所示的核酸寡聚物。自动合成的步骤中，首先，将3％三甲苯溶液送液至cpg，将5’位的三苯甲基保护基进行脱保护。此时，使用的三溶液中的甲醛浓度可以利用测定方法3进行测定，三溶液中的甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为33
×
10-7
。接着，将各种酰胺和作为缩合剂的5-苄巯基-1h-四氮唑送液至cpg，使5’位的羟基进行偶联反应。接着，对包含50mm碘的氧化溶液进行送液，将亚磷酸基转化为磷酸基。接着，作为加帽溶液，使用0.1m苯氧基乙酸酐乙腈溶液和10％n-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液，对未进行偶联的反应位点实施加帽。进一步将这些步骤总计重复99次后，用3％三甲苯溶液将5’末端的碱基中的保护基(dmtr基)脱保护，从而在cpg载体上合成序列(iii)所示的序列的核酸寡核苷酸。然后，针对担载了1.00μmol量的寡核苷酸的cpg载体，流入28％氨水1.5ml和乙醇0.5ml，将混合物于40℃保温4小时，由此使核酸寡聚物从固相载体游离，然后通过浓缩除去溶剂。接着将游离寡核苷酸溶解于二甲基亚砜1.5ml中后，加入乙腈1.0ml、硝基甲烷20μl和搅拌子后，在基于搅拌器的搅拌下于室温流入将利用分子筛4a实施了脱水处理的1m的四正丁基氟化铵(tbaf)的二甲基亚砜溶液2.08ml，将混合物于33℃保温4小时，从而进行2
’‑
emm保护基的脱保护。然后，通过沉淀操作得到核酸寡聚物的产物。对于所得到的产物，使用前述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果纯度为32.8％。另外，使用前述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的cpg的收量为15722μg。将结果示于表2。
[0308]
(实施例6)
[0309]
实施例5的实验中，使用担载了1.01μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(cpg)、和甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为11
×
10-5
的3％三甲苯溶液，除此以外，利用同样的方法得到序列(iii)的核酸寡聚物。使用前述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果产物的纯度为30.9％。另外，使用前述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为14754μg，若换算为每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的cpg的收量，则为14608μg。将结果示于表2。
[0310]
(参考例3)
[0311]
实施例5的实验中，使用担载了0.97μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(cpg)、和甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为26
×
10-5
的3％三甲苯溶液，除此以外，利用同样的方法得到序列(iii)的核酸寡聚物。使用前述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果产物的纯度为26.7％。另外，使用前述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为13283μg，若换算为每担载了1.00μmol的尿苷衍生物的cpg的收量，则为13694μg。将结果示于表2。
[0312]
(实施例7)
[0313]
在甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为25
×
10-5
的三30g中加入甲苯300ml，使用蒸发器于40℃将甲苯和甲醛进行共沸蒸馏而除去，得到无油状的三溶液34g。利用测定方法3中记载的方法对所得到的三溶液中包含的甲醛进
行分析，结果甲醛与三的摩尔比为25
×
10-7
。
[0314]
[表2]
[0315]
表2
[0316][0317]
根据上述表2的结果，与使用参考例1、参考例2及参考例3的三溶液的情况相比，使用甲醛浓度为一定以下的本发明的三溶液的情况下，以高收率得到了核酸寡聚物。
[0318]
产业上的可利用性
[0319]
本发明提供高效的核酸寡聚物的制造方法。另外，可期待依照核酸寡聚物的制造方法制造的核酸寡聚物的收率提高。
[0320]
序列表自由文本
[0321]
序列表的序列号1～14表示依照本发明的制造方法制造的寡核苷酸的碱基序列。

技术特征：

1.式(2)所示的核酸寡聚物的制造方法，其包括使式(1)所示的核酸寡聚物、和甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为11
×
10-5
以下的三溶液反应的步骤，[化学式1]式(1)中，g2表示羟基的保护基，b
a
相同或彼此不同，各自独立地表示可被保护基保护的核酸碱基，r1、r2及r3相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子或烷氧基，r相同或彼此不同，各自独立地表示经保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或oq’基，q’相同或彼此不同，各自独立地表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子键合的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子键合的乙叉基，y相同或彼此不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，n表示1～200中的任一整数，w1表示oz基，且x1表示r基，或者w1表示ov基，且x1表示oz基，v表示羟基的保护基，z为具有由固相载体及连接基团组成的结构的基团，并且，n为2以上的整数时，可以在式(1)所示的核酸寡聚物的各核苷酸之间组入非核苷酸接头，[化学式2]
式(2)中，g2、b
a
、r、y、x1、w1及n与前述相同，并且，可以以式(1)中所定义的方式，在核苷酸之间组入非核苷酸接头。2.式(2’)所示的核酸寡聚物的制造方法，其包括：权利要求1所述的步骤；进一步从该步骤中生成的式(2)所示的核酸寡聚物除去z所示的基团的步骤；以及除去羟基及核酸碱基的保护基的步骤，[化学式3]式(2’)中，y及n与前述相同，b
c
相同或彼此不同，各自独立地表示核酸碱基，g4相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子，r’相同或彼此不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或oq’基，q’与前述相同，并且，x3及w3分别各自独立地表示羟基，或者x3表示r’基，且w3表示羟基。3.根据权利要求1所述的制造方法，其还包括：得到式(3)所示的核酸化合物的步骤，所述式(3)所示的核酸化合物是将式(2)所示的核酸寡聚物利用酰胺法任意地延伸链长而成的；以及从式(3)所示的化合物切出式(4)所示的化合物，进一步对式(4)所示的化合物进行脱保护来制造式(5)所示的核酸寡聚物的步骤，[化学式4]
式(3)中，g2、b
a
、r、y、x1及w1与前述相同，g5表示下式所示的羟基的保护基、或氢原子，[化学式5]r1、r2及r3与前述相同，并且，m为满足m≥n的整数，[化学式6]式(4)中，g5、r、y及m与前述相同，g4相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子，b
c
相同或彼此不同，各自独立地表示核酸碱基，x2表示羟基，且w2表示ov基，或者
x2表示r基，且w2表示羟基，并且，v表示羟基的保护基，[化学式7]式(5)中，g4、b
c
、y及m与前述相同，r’相同或彼此不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或oq’基，q’与前述相同，并且，x3及w3分别各自独立地表示羟基，或者x3表示r’基，且w3表示羟基。4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，非核苷酸接头为包含氨基酸骨架的接头。5.根据权利要求4所述的制造方法，其中，包含氨基酸骨架的接头为具有选自由下述式(a14-1)、(a14-2)及(a14-3)组成的组中的结构的接头，[化学式8]式中，y与前述相同。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，三溶液包含选自由二氯甲烷、乙腈、及芳香族有机溶剂组成的组中的至少1种溶剂。7.根据权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其中，三溶液中的甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为54
×
10-6
以下。8.根据权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其中，三溶液中的甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为27
×
10-6
以下。9.根据权利要求1～8中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为核糖核酸(rna)。10.根据权利要求1～8中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为核糖核酸(rna)，其核糖的2’位的羟基的保护基为式(6)所示的保护基，式(6)：[化学式9]式(6)中，q表示1～5中的任一整数，r
a
及r
b
相同或彼此不同，各自独立地表示甲基、乙基或氢原子，*标记表示与源自核糖的2’位的羟基的氧原子的键合点，并且，e
w
表示吸电子基团。11.根据权利要求10所述的制造方法，其中，r
a
及r
b
同时为氢原子，且e
w
为氰基。12.根据权利要求1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为40链长以上的寡聚物。13.根据权利要求1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为50链长以上的寡聚物。14.根据权利要求1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为60链长以上的寡聚物。15.根据权利要求1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为80链长以上的寡聚物。16.根据权利要求1～11中任一项所述的制造方法，其中，核酸寡聚物为100链长以上的寡聚物。17.三溶液，其中，甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为11
×
10-5
以下。18.根据权利要求17所述的三溶液，其中，甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为54
×
10-6
以下。19.根据权利要求17所述的三溶液，其中，甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为27
×
10-6
以下。20.权利要求17～19中任一项所述的三的制造方法，其包括通过从含有包含甲醛的未纯化三、和与甲醛共沸的溶剂的溶液中共沸蒸馏去除甲醛，从而得到纯化三的步骤。
21.根据权利要求20所述的制造方法，其中，共沸溶剂的沸点为198℃以下。22.根据权利要求20或21所述的制造方法，其中，共沸溶剂为二氯甲烷、乙腈或芳香族有机溶剂。23.根据权利要求22所述的制造方法，其中，芳香族有机溶剂为甲苯。24.核酸寡聚物的制造方法，其包括：权利要求20所述的三的纯化步骤；及使用该步骤中得到的纯化三的权利要求1～3中任一项所述的步骤。25.根据权利要求1～16及20～24中任一项所述的制造方法，其包括选择权利要求17、18及19中任一项所述的三溶液作为三溶液的步骤。

技术总结

本发明的目的在于提供核酸寡聚物的高效的制造方法。本发明的目的在于提供式(2)(式中，符号具有说明书中记载的含义)所示的核酸寡聚物的制造方法，其包括使式(1)(式中，符号具有说明书中记载的含义)所示的核酸寡聚物、和甲醛与三的摩尔比(甲醛mol/三mol)为11

技术研发人员：

田中雄树 奥村英贵 加纳俊史

受保护的技术使用者：

住友化学株式会社

技术研发日：

2021.07.08

技术公布日：

2023/3/28