利用MSC-miRNA-198-exoNSCLC相关恶性胸腔积液的方法与流程

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利用msc-mirna-198-exonsclc相关恶性胸腔积液的方法
技术领域
1.本发明涉及外泌体技术领域，具体为利用msc-mirna-198-exonsclc相关恶性胸腔积液的方法。

背景技术：

2.外泌体含有多种生物活性物质(核酸、蛋白质、脂质)，是细胞间信息传递的媒介，参与肿瘤细胞增殖、转移、侵袭和血管生成等过程。间充质干细胞(msc)是一种多能成体干细胞，可由骨髓、脐带、脂肪、滑膜及外周血等组织中分离。以干细胞为基础的方法可参与肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)形成，并与肿瘤细胞相互作用促进肿瘤生长，mscs能通过旁分泌发挥其效能，外泌体正是mscs旁分泌的主要物质。外泌体为一类直径在40～160nm之间的胞外囊泡，可在100000g下离心收集，在-80℃的环境中储存3-5年。相比于mscs的全细胞疗法，msc-exo有良好的耐受性，并且免疫原性的不良反应风险更低，且便于获取及操作。外泌体对肿瘤进展的影响已受到广泛关注，msc-exo可通过支持或抑制两种方式影响肿瘤的发展。msc-exo促进乳腺癌细胞的增殖及转移，进一步探索发现msc-exo含多种促进肿瘤的mirnas，如mir-21和mir-34a。在前列腺癌中，脂肪mscs来源的外泌体能够转运mir-na-145，通过降低bcl-xl的活性与caspase-3、caspase-7途径促进肿瘤细胞凋亡来抑制前列腺癌的生长。此外，mirna-122转染的脂肪mscs可以生成含有mirna-122的外泌体来传递mirna-122进入肝癌细胞中，通过基因表达改变和体内外肿瘤增殖提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。由此可见，msc-exo对肿瘤生长和进展的影响可能与其所含mirnas相关的机制有关。mir-198是一类抑癌基因，在肺癌细胞中过表达mir-198，可阻断hgf/c-met信号通路，抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。mir-198和mapk1具有靶向相关性，mir-198上调，显著抑制mapk1的磷酸化，相反，mir-198的抑制显著增加了mapk1的磷酸化，从而调节肿瘤生长和迁移。通过msc-exo合理进行修饰，对肿瘤进行靶向已经获得初步认识，随着对msc-exo研究的深入，以及对外泌体提取、分离方法的完善与提高，外泌体对肿瘤的靶向，可能在未来癌症中发挥重要作用。
3.msc-exo具有低免疫原性、组织相容性、低毒性等优势，是生物信息的天然载体，将是恶性肿瘤细胞的新的手段和措施，但在现有技术中，还未见到以msc-exo为载体，过表达mir-198的msc-exo(msc-mirna-198-exo)细胞方式非小细胞肺癌(nsclc)相关恶性胸腔积液的方法的研究和报道。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供利用msc-mirna-198-exonsclc相关恶性胸腔积液的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：利用msc-mirna-198-exonsclc相关恶性胸腔积液的方法，包括以下步骤：步骤一，转染msc；步骤二，提取msc-mirna-198-exo；步骤三，构建裸鼠mpe模型；步骤四，干预恶性胸腔积液小鼠；步骤五，评估疗效；
6.其中在上述步骤一中，取1ep管加1200μl opti-mem，加入9μgpcl-ampho和15μg pmxs-hsa-mir-198-gfpuro#7质粒，再加入84μllipofectamine
tm
2000转染试剂，混匀静置15min；200μl质粒-转染试剂混合物加至293t细胞的培养板中，温育2h；加4ml 293t完全培养液，培养过夜；24h后更换为新鲜培养液；48h、72h、96h收集病毒上清，收集的病毒液在35℃，3000
×
g离心10min，再经0.45μm过滤器过滤；过滤的病毒液加入polybrene(工作浓度为2.5ng/μl)，混匀；5ml病毒液加入接种msc的6孔板中，构建过表达mir-198的msc细胞；转然后荧光显微镜及qt-pcr验证转染效率；
7.其中在上述步骤二中，对上述步骤一中所获取的msc-mir-198细胞进行培养，在3代至10代的细胞培融合度达85％左右时，收集细胞培养上清，使用超速离心法提取外泌体；通过电子透射显微镜及粒径分析验证提取的外泌体，通过bca蛋白浓度测定外泌体浓度；
8.其中在上述步骤三中，取balb/c裸鼠，腹腔内注射麻醉，碘伏消毒心前区皮肤，剑突右侧上方约1cm处做一个长约0.5cm的纵行切口，到肋骨及肋间隙，避开血管用1ml胰岛素注射器在肋间隙注入以100ul pbs重悬的6
×
106对数期的a549细胞，注射完毕后缝合伤口，对皮消毒，青霉素粉末涂抹伤口；裸鼠在a549细胞造模后的第14天及第28天进行pet-ct扫描；
9.其中在上述步骤四中，在a549细胞造模后的第5天、7天、9天时胸腔内注射pbs重悬的msc-mir-198-exo；
10.其中在上述步骤五中，观察并检测上述步骤四中的实验小鼠，观察得出：给予msc-mirna-198-exos的小鼠胸膜组织的血管数量减少，胸膜血管渗透性降低，小鼠胸腔内肿瘤的生长和恶性胸腔积液的形成受到明显抑制；elisa检测结果为：msc-mirna-198-exo的小鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子受体(vegf)的表达显著降低；western blot检测结果为：msc-mirna-198-exos的恶性胸腔积液小鼠组织中c-met和p-erk活性均明显被抑制；分析得出：msc-mirna-198-exo对nsclc相关恶性胸腔积液具有良好的效果。
11.优选的，所述步骤二中，msc-mir-198所用培养体系为无血清培基。
12.优选的，所述步骤二中，提取msc-mirna-198-exo的具体步骤为：取细胞上清液1500
×
g，4℃离心15min去除死细胞；4℃，10000
×
g，离心30分钟，去除细胞碎片；4℃，14000
×
g，离心30分钟，取上清；超速离心机4℃，110000
×
g，离心2h，收集沉淀，用dpbs重悬沉淀，再次超速离心机，4℃，110000
×
g，离心1h，弃掉上清，收集沉淀，即为外泌体沉淀，用100μl无菌pbs重悬外泌体，-80℃条件下保存备用。
13.优选的，所述步骤二中，电镜及粒径结果显示，获取的外泌体形态呈杯托样、大小约40-160nm的双膜层囊泡状结构。
14.优选的，所述步骤二中，bca蛋白浓度测定外泌体浓度：每300ml上清可提取120mg/ml-150mg/ml浓度的外泌体。
15.优选的，所述步骤四中，注射剂量为每次250ug/只。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明以msc-exo为媒介，可保护mirna免受rna酶活性的影响，具有低免疫原性和低细胞毒性、且稳定性和生物相容性高等优点，经基因修饰后所构建出的msc-mirna-198-exo能明显抑制胸腔内肿瘤的生长和恶性胸腔积液的形成，在肺癌相关恶性胸腔积液的无细胞中具有广阔的应用前景。
附图说明
17.图1为本发明的方法流程图。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.请参阅图1，本发明提供的一种实施例：利用msc-mirna-198-exonsclc相关恶性胸腔积液的方法，包括以下步骤：步骤一，转染msc；步骤二，提取msc-mirna-198-exo；步骤三，构建裸鼠mpe模型；步骤四，干预恶性胸腔积液小鼠；步骤五，评估疗效；
20.其中在上述步骤一中，取1ep管加1200μl opti-mem，加入9μg pcl-ampho和15μg pmxs-hsa-mir-198-gfpuro#7质粒，再加入84μl lipofectamine
tm
2000转染试剂，混匀静置15min；200μl质粒-转染试剂混合物加至293t细胞的培养板中，温育2h；加4ml 293t完全培养液，培养过夜；24h后更换为新鲜培养液；48h、72h、96h收集病毒上清，收集的病毒液在35℃，3000
×
g离心10min，再经0.45μm过滤器过滤；过滤的病毒液加入polybrene(工作浓度为2.5ng/μl)，混匀；5ml病毒液加入接种msc的6孔板中，构建过表达mir-198的msc细胞；转然后荧光显微镜及qt-pcr验证转染效率；
21.其中在上述步骤二中，采用无血清培基对上述步骤一中所获取的msc-mir-198细胞进行培养，在3代至10代的细胞培融合度达85％左右时，收集细胞培养上清，使用超速离心法提取外泌体，具体步骤为：取细胞上清液1500
×
g，4℃离心15min去除死细胞；4℃，10000
×
g，离心30分钟，去除细胞碎片；4℃，14000
×
g，离心30分钟，取上清；超速离心机4℃，110000
×
g，离心2h，收集沉淀，用dpbs重悬沉淀，再次超速离心机，4℃，110000
×
g，离心1h，弃掉上清，收集沉淀，即为外泌体沉淀，用100μl无菌pbs重悬外泌体，-80℃条件下保存备用；通过电子透射显微镜及粒径分析验证提取的外泌体，电镜及粒径结果显示：获取的外泌体形态呈杯托样、大小约40-160nm的双膜层囊泡状结构；通过bca蛋白浓度测定外泌体浓度：每300ml上清可提取120mg/ml-150mg/ml浓度的外泌体；
22.其中在上述步骤三中，取balb/c裸鼠，腹腔内注射麻醉，碘伏消毒心前区皮肤，剑突右侧上方约1cm处做一个长约0.5cm的纵行切口，到肋骨及肋间隙，避开血管用1ml胰岛素注射器在肋间隙注入以100ul pbs重悬的6
×
106对数期的a549细胞，注射完毕后缝合伤口，对皮消毒，青霉素粉末涂抹伤口；裸鼠在a549细胞造模后的第14天及第28天进行pet-ct扫描；
23.其中在上述步骤四中，在a549细胞造模后的第5天、7天、9天时胸腔内注射pbs重悬的msc-mir-198-exo，注射剂量为每次250ug/只；
24.其中在上述步骤五中，观察并检测上述步骤四中的实验小鼠，观察得出：给予msc-mirna-198-exos的小鼠胸膜组织的血管数量减少，胸膜血管渗透性降低，小鼠胸腔内肿瘤的生长和恶性胸腔积液的形成受到明显抑制；elisa检测结果为：msc-mirna-198-exo的小鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子受体(vegf)的表达显著降低；western blot检测结果为：msc-mirna-198-exos的恶性胸腔积液小鼠组织中c-met和p-erk活性均明显被抑
制；分析得出：msc-mirna-198-exo对nsclc相关恶性胸腔积液具有良好的效果。
25.基于上述，本发明的优点在于，本发明中的mcs-exo是mirna的天然富集体，可保护mirna免受rna酶活性的影响，具有低免疫原性和低细胞毒性、且稳定性和生物相容性高等优点；本发明中的mir-198是一类抑癌基因，可抑制hgf/c-met信号通路激活，抑制mapk1的磷酸化，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，而恶性肿瘤的胸膜侵袭和转移又是mpe产生的主要机制；故本发明以mcs-exo为媒介，过表达mir-198可以抑制c-met基因的表达，且会抑制hgf/c-met信号通路下游mapk活性，抑制nsclc的迁移和侵袭，降低血管通透性，抑制mpe发生。
26.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

技术特征：

1.利用msc-mirna-198-exonsclc相关恶性胸腔积液的方法，包括以下步骤：步骤一，转染msc；步骤二，提取msc-mirna-198-exo；步骤三，构建裸鼠mpe模型；步骤四，干预恶性胸腔积液小鼠；步骤五，评估疗效；其特征在于：其中在上述步骤一中，取1ep管加1200μl opti-mem，加入9μg pcl-ampho和15μg pmxs-hsa-mir-198-gfpuro#7质粒，再加入84μl lipofectamine
tm
2000转染试剂，混匀静置15min；200μl质粒-转染试剂混合物加至293t细胞的培养板中，温育2h；加4ml 293t完全培养液，培养过夜；24h后更换为新鲜培养液；48h、72h、96h收集病毒上清，收集的病毒液在35℃，3000
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g离心10min，再经0.45μm过滤器过滤；过滤的病毒液加入polybrene(工作浓度为2.5ng/μl)，混匀；5ml病毒液加入接种msc的6孔板中，构建过表达mir-198的msc细胞；转然后荧光显微镜及qt-pcr验证转染效率；其中在上述步骤二中，对上述步骤一中所获取的msc-mir-198细胞进行培养，在3代至10代的细胞培融合度达85％左右时，收集细胞培养上清，使用超速离心法提取外泌体；通过电子透射显微镜及粒径分析验证提取的外泌体，通过bca蛋白浓度测定外泌体浓度；其中在上述步骤三中，取balb/c裸鼠，腹腔内注射麻醉，碘伏消毒心前区皮肤，剑突右侧上方约1cm处做一个长约0.5cm的纵行切口，到肋骨及肋间隙，避开血管用1ml胰岛素注射器在肋间隙注入以100ul pbs重悬的6
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106对数期的a549细胞，注射完毕后缝合伤口，对皮消毒，青霉素粉末涂抹伤口；裸鼠在a549细胞造模后的第14天及第28天进行pet-ct扫描；其中在上述步骤四中，在a549细胞造模后的第5天、7天、9天时胸腔内注射pbs重悬的msc-mir-198-exo；其中在上述步骤五中，观察并检测上述步骤四中的实验小鼠，观察得出：给予msc-mirna-198-exos的小鼠胸膜组织的血管数量减少，胸膜血管渗透性降低，小鼠胸腔内肿瘤的生长和恶性胸腔积液的形成受到明显抑制；elisa检测结果为：msc-mirna-198-exo的小鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子受体(vegf)的表达显著降低；western blot检测结果为：msc-mirna-198-exos的恶性胸腔积液小鼠组织中c-met和p-erk活性均明显被抑制；分析得出：msc-mirna-198-exo对nsclc相关恶性胸腔积液具有良好的效果。2.根据权利要求1所述的利用msc-mirna-198-exonsclc相关恶性胸腔积液的方法，其特征在于：所述步骤二中，msc-mir-198所用培养体系为无血清培基。3.根据权利要求2所述的利用msc-mirna-198-exonsclc相关恶性胸腔积液的方法，其特征在于：所述步骤二中，提取msc-mirna-198-exo的具体步骤为：取细胞上清液1500
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g，4℃离心15min去除死细胞；4℃，10000
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g，离心30分钟，去除细胞碎片；4℃，14000
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g，离心30分钟，取上清；超速离心机4℃，110000
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g，离心2h，收集沉淀，用dpbs重悬沉淀，再次超速离心机，4℃，110000
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g，离心1h，弃掉上清，收集沉淀，即为外泌体沉淀，用100μl无菌pbs重悬外泌体，-80℃条件下保存备用。4.根据权利要求3所述的利用msc-mirna-198-exonsclc相关恶性胸腔积液的方法，其特征在于：所述步骤二中，电镜及粒径结果显示，获取的外泌体形态呈杯托样、大小约40-160nm的双膜层囊泡状结构。5.根据权利要求4所述的利用msc-mirna-198-exonsclc相关恶性胸腔积液的方法，其特征在于：所述步骤二中，bca蛋白浓度测定外泌体浓度：每300ml上清可提取120mg/ml-150mg/ml浓度的外泌体。
6.根据权利要求1所述的利用msc-mirna-198-exonsclc相关恶性胸腔积液的方法，其特征在于：所述步骤四中，注射剂量为每次250ug/只。

技术总结

本发明公开了利用MSC-miRNA-198-exoNSCLC相关恶性胸腔积液的方法，包括以下步骤：步骤一，转染MSC；步骤二，提取MSC-miRNA-198-exo；步骤三，构建裸鼠MPE模型；步骤四，干预恶性胸腔积液小鼠；步骤五，评估疗效；所述步骤二中，MSC-miR-198所用培养体系为无血清培基；所述步骤二中，电镜及粒径结果显示，获取的外泌体形态呈杯托样、大小约40-160nm的双膜层囊泡状结构；所述步骤三中，注射剂量为每次250ug/只；本发明以MSC-exo为媒介，可保护miRNA免受RNA酶活性的影响，具有低免疫原性和低细胞毒性、且稳定性和生物相容性高等优点，经基因修饰后所构建出的MSC-miRNA-198-exo能明显抑制胸腔内肿瘤的生长和恶性胸腔积液的形成，在肺癌相关恶性胸腔积液的无细胞中具有广阔的应用前景。的应用前景。的应用前景。