喹啉噻唑啉酮衍生物Ro-3306在神经退行性疾病中的应用

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喹啉噻唑啉酮衍生物ro-3306在神经退行性疾病中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药领域，特别地涉及喹啉噻唑啉酮衍生物ro-3306在神经退行性疾病中的应用。

背景技术：

2.神经退行性疾病是一类由于神经系统发生退行性病变、特定的神经元细胞功能丧失而引起的疾病。在多种类型的神经退行性疾病中，如阿尔茨海默症、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症等，都检测到细胞自噬活性异常和大量蛋白质聚集体的异常累积。这些发生异常累积的蛋白质聚集体原本应该被细胞自噬所降解，因此在这些神经退行性疾病中，细胞自噬活性的降低被认为是原发的致病机制之一。并且已有很多证据表明，在神经系统中促进自噬活性的升高，对于多种类型的神经退行性疾病的预防和，都是极其有效的一种干预手段。
3.细胞自噬过程是生物体在细胞质中通过形成双层膜结构的自噬小体，包裹自噬底物，如蛋白质聚集体、受损的细胞器等，并将其运送到溶酶体进行降解的过程。因此，增强细胞自噬对底物的识别效率、加速自噬小体的装配和成熟、提高溶酶体的降解活性，都是促进细胞自噬的有效手段。
4.在发明人已经发表的研究工作中，发现了一个调节细胞自噬和溶酶体稳态的转录因子tfeb(transcription factor eb)，其可以在细胞内或生化条件下发生液-液相分离，形成蛋白质液态凝聚体。tfeb形成的蛋白质液态凝聚体与其转录活性存在密切关联。tfeb是一个已知的神经退行性疾病靶点。在一些神经退行性疾病的动物模型中，通过基因操纵手段过表达tfeb以促进其转录活性，可以促进生物体内的自噬水平和溶酶体活性提高，进而有效的缓解退行性表型，延缓疾病发展，提示提高tfeb的转录活性可以作为潜在的人类神经退行性疾病靶点。但是基因操纵手段用于人类疾病的目前尚不可行，因此针对该靶点的小分子新药研发极具必要性。
5.tfeb的转录活性与亚细胞定位存在密切关系。通常情况下，tfeb大量定位于细胞质中，极少量定位于细胞核中，以维持一个基础的转录活性。当细胞处于一些应激条件下，比如饥饿等，tfeb大量入核并呈现升高的转录活性。tfeb的亚细胞定位受到一些信号通路的调控，如mtor、pkc-gsk3β等通过磷酸化tfeb来抑制其入核。但是同样存在一些调节因子，以不依赖于改变tfeb入核的方式直接参与tfeb的转录活性调节，如ipmk、acss2等。鉴于通过改变tfeb入核的方式间接提高其转录活性通常具有较大的副作用，获取不影响tfeb入核而是直接调节tfeb转录活性的药物是更有利的。

技术实现要素：

6.发明人利用tfeb蛋白质的相分离特性开发了一个药物筛选的模型。基于该模型筛选了l4000-bioactivity compound library和l6000-natural compound library
(targetmol)小分子化合物库(共5770个小分子)，获得了一系列候选分子。利用进一步的细胞生物学研究，确认了一个化合物ro-3306，其在细胞系中不改变tfeb入核，而是利用tfeb靶点，在细胞间期促进自噬活性和溶酶体降解活性升高，并且可以促进polyq和p62等蛋白质聚集体的自噬降解。
7.ro-3306是具有式i结构的喹啉噻唑啉酮衍生物，分子式为c18h13n3os2，分子量为351.45：
[0008][0009]
在一个方面，本发明提供了式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于使细胞中的tfeb蛋白液态凝聚体的物理性质发生改变。
[0010]
在另一个方面，本发明提供了式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在细胞间期提高tfeb的转录活性。
[0011]
在另一个方面，本发明提供了式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在细胞间期增加溶酶体数量和活性。
[0012]
在另一个方面，本发明提供了式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在细胞间期促进致病性蛋白质聚集体的自噬降解。
[0013]
在一些实施方案中，致病性蛋白质聚集体可以是聚谷氨酰胺的蛋白质聚集体。
[0014]
在一些实施方案中，致病性蛋白质聚集体可以是含有p62的蛋白质聚集体。
[0015]
在另一个方面，本发明提供了式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或神经退行性疾病。
[0016]
在一些实施方案中，神经退行性疾病可以选自阿尔茨海默症、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化、遗传性共济失调、vici综合征、bpan综合征。
[0017]
本发明的有益效果
[0018]
目前ro-3306及其结构类似物主要被用于抑制细胞周期、诱导细胞凋亡以及尝试用于肿瘤等方面，尚未报道尝试用于神经退行性疾病的推测或实例。根据本发明，ro-3306可以通过直接作用于tfeb的液态凝聚体，在细胞间期促进细胞自噬和溶酶体活性升高。经ro-3306处理的细胞系中，致病性蛋白质聚集体的自噬降解明显增加，毒性聚集体累积减少，因此ro-3306可用于神经退行性疾病的。
附图说明
[0019]
图1示出了药物筛选的示意流程图。
[0020]
图2示出了ro-3306使tfeb液滴融合变大的高内涵成像图。
[0021]
图3示出了ro-3306处理不改变tfeb在hela细胞中的亚细胞定位。图3a和3b分别示出了对照组和ro-3306实验组中的tfeb-gfp蛋白的亚细胞定位；图3c示出了对照组和ro-3306实验组hela细胞的细胞核、细胞质和全细胞裂解液中的内源性tfeb蛋白水平。
[0022]
图4示出了ro-3306处理促进hela细胞系中的溶酶体数量和降解活性增加。图4a-c
分别示出了对照组和ro-3306实验组hela细胞中的lamp1、dq-bsa和magic red点状结构成像图；图4d示出了对照组和ro-3306实验组的每个hela细胞中lamp1、dq-bsa和magic red点状结构数量的统计图。
[0023]
图5示出了ro-3306处理促进hela细胞系中的溶酶体数量和活性增加依赖于tfeb，而非tfe3或cdk1。图5a-e分别示出了对照组和敲低tfeb、tfe3、cdk1实验组，及dinaciclib实验组中，ro-3306对hela细胞中lysotracker点状结构数量和分布的影响；图5f示出了每个细胞中lysotracker点状结构数量的统计图。
[0024]
图6示出了ro-3306促进cos7细胞系中的溶酶体数量和降解活性增加。图6a-c分别示出了对照组和ro-3306实验组cos-7细胞中的lamp1、magic red和lysotracker点状结构成像图；图6d示出了每个cos-7细胞中lamp1、magic red和lysotracker点状结构数量的统计图。
[0025]
图7示出了ro-3306处理提高tfeb下游调控基因的mrna水平。
[0026]
图8示出了ro-3306促进hela细胞系中的溶酶体数量的效应是可逆的。图8a-d分别示出了ro-3306处理24小时，和ro-3306处理24小时后恢复2小时、4小时、8小时的hela细胞中，lysotracker点状结构的数量和分布。
[0027]
图9示出了ro-3306促进hela细胞系中的自噬活性，这种效应依赖于tfeb，而非tfe3或cdk1。图9a-d分别示出了对照组和敲低tfeb、tfe3、cdk1实验组中，ro-3306对hela细胞中lc3点状结构数量和分布的影响；图9e示出了每个细胞中lc3点状结构数量的统计图；图9f示出了对照组、及baf.a1、ro-3306和ro-3306+baf.a1实验组hela细胞中，内源性lc3-i、lc3-ii和p62的蛋白水平。
[0028]
图10示出了ro-3306促进hela细胞系中的早期自噬活性。图10a-d分别示出了对照组和ro-3306实验组中，正常培养或经饥饿处理1小时后的hela细胞中，wipi2和atg13点状结构数量和分布的影响；图10e示出了每个细胞中wipi2和atg13点状结构数量的统计图。
[0029]
图11示出了ro-3306促进hela细胞系中的晚期自噬活性。图11a-d分别示出了对照组和ro-3306实验组中，正常培养或经torin 1处理1小时后的hela细胞中，rfp
+
gfp-‑
lc3状结构数量和分布的影响；图11e示出了每个细胞中rfp
+
gfp-‑
lc3点状结构在总lc3点状结构中所占比例的统计图。
[0030]
图12示出了ro-3306促进hela细胞系中的自噬结构和溶酶体结构数量。图12a和12b分别示出了对照组和ro-3306实验组中，hela细胞的电镜成像图；图12c示出了每个细胞中的自噬小体、自噬内涵体、自噬溶酶体和溶酶体结构的数量的统计图。am：自噬内涵体；al：自噬溶酶体；ly：溶酶体。
[0031]
图13示出了ro-3306促进hela细胞系中嘌呤霉素诱导的p62蛋白质聚集体的自噬降解。图13a-f分别示出了对照组和ro-3306实验组中，正常培养条件及经嘌呤霉素处理2小时和4小时后，hela细胞中p62点状结构的数量和分布；图13g和13h分别示出了每100个细胞中直径大于1μm的p62点状结构的数量，及包含三个以上直径大于1μm的p62点状结构的细胞比例的统计图；图13i-l分别示出了baf.a1和ro-3306+baf.a1实验组中，正常培养条件及经嘌呤霉素处理2小时后，hela细胞中p62点状结构的数量和分布。
[0032]
图14示出了ro-3306促进97q聚集体的自噬降解。图14a和14b分别示出了对照组和ro-3306实验组的hela细胞中，htt97q-gfp蛋白表达10小时后，经历24、48、72小时后，
htt97q-gfp点状结构的数量和分布；图14c和14d分别示出了每100个细胞中htt97q-gfp点状结构的数量，及包含htt97q-gfp点状结构的细胞比例的统计图；图14e示出了各实验组hela细胞中htt97q-gfp的蛋白水平。
[0033]
图15示出了ro-3306改善了epg5缺失细胞系中的自噬降解缺陷。图15a-c分别示出了对照组和敲低epg5、及敲低epg5同时处理ro-3306的实验组hela细胞中，p62和lc3点状结构的数量和分布；图15d示出了每个细胞中lc3和p62点状结构的数量统计图；图15e示出了各实验组hela细胞中内源性lc3-i、lc3-ii和p62的蛋白水平。
具体实施方案
[0034]
本发明利用体外组装的生物大分子液态凝聚体的宏观物理性质，采用高内涵成像的手段筛选小分子化合物库，从中获得若干可以改变生物大分子液态凝聚体的宏观物理性质的候选分子。因而可以进一步在细胞系和动物模型中验证候选小分子化合物的生物学效应，获得了具有特定活性的化学药物(图1)。
[0035]
具体地，筛选改变tfeb蛋白相分离性质的小分子化合物的方法包括以下步骤：
[0036]
1)基于体外重组蛋白质液态凝聚体物理性质的改变利用高内涵成像筛选小分子化合物库；
[0037]
2)利用细胞系检测候选小分子的生物学效应以筛选最优候选小分子，例如利用lysotracker(thermofisher)染料筛选出可以明显增加lysotracker染以及利用半定量荧光pcr技术检测筛选出可以明显增加溶酶体代谢相关基因(tfeb下游基因)的mrna表达量的最优小候选分子。
[0038]
3)利用评价体系评价最优候选小分子的效果，例如在细胞系中利用聚谷氨酰胺(polyq)或含有p62的毒性聚集体的自噬降解效率和累积程度等神经退行性疾病的病理表征来检测候选小分子在细胞系疾病模型中的效果。
[0039]
因此，本发明提供了式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于使细胞中的tfeb蛋白液态凝聚体发生物理性质改变
[0040][0041]
液态凝聚体的物理性质表现为形态、融合特性、絮凝特性、浸润特性等。具体地，相关物理性质现象包括：液滴形状趋向于球形或不规则形状，液滴受挤压后发生形变的程度，液滴絮凝的促进或抑制，(絮凝的)液滴发生融合，液滴对基底介质(例如多孔板板底)的浸润的促进或降低等。
[0042]
本发明提供了式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于提高tfeb的转录活性。
[0043]
本发明提供了式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在细胞间期增加溶酶体数量和活性。
[0044]
本发明提供了式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于促进致病性蛋白
质聚集体的自噬降解。致病性蛋白质聚集体可以是聚谷氨酰胺的蛋白质聚集体或含有p62的蛋白质聚集体。
[0045]
本发明提供了式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或神经退行性疾病。神经退行性疾病可以选自阿尔茨海默症、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化、遗传性共济失调、vici综合征、bpan综合征。
[0046]
ro-3306及其若干结构类似物是一类已知的细胞周期抑制剂和cdk1抑制剂，并被证明可以促进处于m期的细胞的自噬活性和溶酶体降解活性(参考文献1,synthesis and activity of quinolinyl-methylene-thiazolinones as potent and selective cyclin-dependent kinase 1inhibitors.bioorg med chem lett,17(8):2134-8.(2007)；参考文献2,an mtorc1-to-cdk1 switch maintains autophagy suppression during mitosis.mol cell,77(2):228-240.(2020))。但在之前的研究中没有证据表明ro-3306同样可以促进处于间期的细胞调高自噬活性和溶酶体降解活性。而机体中只有少量细胞处于m期，因此在本发明之前ro-3306及其结构类似物并不被认为是可能的神经退行性疾病药物。本发明利用一套全新的筛选模型筛选到ro-3306，证明其在间期仍然可以通过直接调控tfeb的液相分离，促进细胞的自噬活性，并促进病理性蛋白质聚集体的降解。因此，ro-3306及其结构类似物通过直接作用于tfeb的液态凝聚体而调节tfeb转录活性，进而在细胞间期促进细胞自噬，是一类预防和神经退行性疾病的药物。
[0047]
实施例
[0048]
实施例1
[0049]
首先，克隆人源转录因子tfeb基因(gene id：7942)，构建用于原核表达的质粒。原核表达载体为经改造的pet-32a(69015，sigma-aldrich)载体，将trx标签替换为mbp标签，thrombin蛋白酶切割位点替换为prescission蛋白质切割位点，并且去除s标签。该表达质粒表达mbp和his6标签融合的tfeb蛋白，并且在his6标签和tfeb蛋白之间插入一个蛋白酶prescission的切割位点(氨基酸序列：leu-glu-val-leu-phe-gln-gly-pro)。利用大肠杆菌bl21(de3)菌株(69450，sigma-aldrich)表达系统表达并纯化mbp-tfeb蛋白，并且用cy3-马来酰亚胺荧光染料(41380，lumiprobe)对其进行荧光标记。将荧光标记的mbp-tfeb蛋白最终溶解于20mm hepes(0511-1kg，amresco)ph7.5，500mm nacl(0241-5kg，amresco)缓冲液中。小分子化合物来自l4000-bioactivity compound library和l6000-natural compound library(targetmol.us)，用缓冲液稀释至100μm，最终缓冲液浓度为20mm hepes ph7.5，500mm nacl，1％dmso(d2650，sigma)。在96孔高内涵成像板中混合mbp-tfeb蛋白和小分子化合物，终浓度分别为10μm和40μm，随后加入终浓度为0.2mg/ml的蛋白酶prescission(实验室自行纯化制备)诱导tfeb相分离，所述蛋白酶体系中的最终缓冲液浓度为20mm hepes ph7.5，500mm nacl，1％dmso。室温静置2小时。每块96孔板中设置至少两组阴性对照组，即不含小分子化合物的tfeb相分离体系。
[0050]
用高内涵成像仪(opera phenix，perkinelmer)对96孔成像板进行拍照，分析数据，利用tfeb液滴的融合现象筛选获取改变tfeb液滴相分离性质的小分子化合物。
[0051]
筛选小分子化合物库l4000-bioactivity compound library和l6000-natural compound library(targetmol)，共5770个小分子，获得ro-3306等23个可以使tfeb液滴明显变大的小分子化合物(图2)。
[0052]
实施例2
[0053]
在hela细胞系中检测ro-3306的生物学效应。用10μm ro-3306处理hela细胞24小时，并不会改变tfeb在细胞中的定位，仍然只有少量tfeb定位于细胞核中(图3a-c)。用10μm ro-3306处理hela细胞24小时，用lamp1抗体免疫荧光标记溶酶体，发现ro-3306处理明显促进溶酶体的数量增加(图4a和4d)。用dq-bsa和magic red染料检测溶酶体的降解活性，发现ro-3306处理明显促进溶酶体的降解能力(图4b-d)。溶酶体的酸化对于其降解活性至关重要。用lysotracker染料标记酸化的溶酶体，发现ro-3306处理明显促进酸化溶酶体的数量增加；用rna干扰技术敲低tfeb蛋白表达，发现ro-3306对溶酶体的促进作用明显降低；敲低tfeb同家族蛋白tfe3的表达量，发现ro-3306对溶酶体的促进作用不受影响，表明ro-3306对溶酶体的促进作用是特异性依赖于tfeb而非tfe3的(图5a-c和5f)。ro-3306存在另外一个已知的抑制靶点cdk1，敲低cdk1的表达量，或者利用另外一个cdk1的抑制剂dinaciclib处理hela细胞，不会增加溶酶体的数量，而ro-3306处理可以进一步增加cdk1敲低细胞中的溶酶体数量，表明cdk1不是ro-3306促进溶酶体增加的作用靶点(图5d-f)。在cos7细胞系中进行上述实验获得类似的结果(图6a-d)。荧光半定量pcr实验显示，经ro-3306处理的hela细胞系中，tfeb下游靶点基因的表达量明显增加，说明tfeb的转录活性被ro-3306增强(图7)。用10μm ro-3306处理hela细胞24小时后去除ro-3306，升高的溶酶体数量在8小时内降低至处理前的水平，表明ro-3306的生物学效应是可逆的(图8a-d)。
[0054]
以上结果证明ro-3306可以在细胞间期通过提高tfeb的转录活性，增加细胞中的溶酶体数量和活性。
[0055]
实施例3
[0056]
在hela细胞系中检测ro-3306对细胞自噬活性的影响。用自噬标记物lc3的抗体免疫染细胞中的自噬结构，发现ro-3306明显促进lc3点状结构的数量增加，并且这种效应是依赖于tfeb，而非依赖于tfe3或cdk1(图9a-e)。在细胞自噬过程中，lc3蛋白会和脂质分子pe交联，形成lc3-pe分子(lc3-ii)；p62是细胞自噬的受体蛋白，可以与细胞质中多泛素化的蛋白形成p62聚集体，并被自噬降解。用10μm ro-3306处理hela细胞24小时，lc3-ii的蛋白水平升高，而p62的蛋白水平降低，表明细胞自噬被激活(图9f)。细胞自噬起始后，lc3标记的自噬结构开始增加，逐步组装成包裹底物的自噬小体，并最终与内吞运输过程中的酸性的囊泡结构(如溶酶体)融合，以降解其中的底物。wipi2和atg13是细胞自噬早期发挥功能的蛋白，在诱导细胞自噬后形成点状结构。利用wipi2和atg13抗体免疫荧光标记早期自噬结构，发现ro-3306处理的hela细胞中wipi2和atg13的结构增加，表明ro-3306促进自噬早期过程活性(图10a-e)。自噬小体与内吞运输过程中的囊泡融合的过程称作自噬小体的成熟过程。gfp-rfp-lc3实验可用于检测自噬小体的成熟，gfp信号在酸性环境(如溶酶体中)被淬灭，因此rfp
+
gfp-的lc3点状结构表征成熟的自噬结构，如自噬溶酶体等。在ro-3306处理的细胞中，rfp
+
gfp-的lc3的点状结构所占的比例大幅上升(图11a-e)，表明ro-3306促进了自噬小体的成熟过程。透射电镜成像分析表明，在ro-3306处理的细胞中，自噬小体、自噬溶酶体和自噬溶酶体等结构的数量明显增加(图12a-c)。嘌呤霉素通过修饰正在核糖体进行翻译合成的蛋白质多肽链，诱导产生大量的错误折叠蛋白质。这些错误折叠蛋白被泛素化修饰，并与p62组装成聚集体，最终被自噬降解。ro-3306明显促进嘌呤霉素诱导的p62聚集体的降解；溶酶体酸化抑制剂baf.a1引起溶酶体降解能力缺陷，可以抑制ro-3306对嘌
呤霉素诱导的p62聚集体降解的促进作用，表明ro-3306通过诱导细胞自噬促进嘌呤霉素诱导的p62聚集体的降解(图13a-l)。
[0057]
以上结果证明ro-3306可以促进细胞自噬活性和对蛋白质聚集体底物的降解。
[0058]
实施例4
[0059]
聚谷氨酰胺(polyq)是一种具有高度聚集倾向性的低复杂度序列蛋白，很容易在细胞质中装配成纤维状的蛋白质聚集体，并且具有很高的细胞毒性。polyq聚集体的异常组装和过度累积是亨廷顿舞蹈症等神经退行性疾病的重要致病机制。在携带tet-on polyq(97q)-gfp的hela细胞中，用多西环素(doxycycline)诱导97q-gfp蛋白质表达，在一定比例的细胞中可以观察到97q聚集体的形成。已知polyq蛋白质聚集体可以通过细胞自噬进行降解。ro-3306可以促进97q聚集体的降解。在ro-3306处理的hela细胞中，97q聚集体的形成明显减少(图14a-e)。
[0060]
epg5基因是目前已知的导致神经退行性疾病vici综合征的唯一病理靶点。epg5基因的突变或功能缺失会引起细胞自噬缺陷，导致毒性蛋白质p62聚集体的异常累积，是引发vici综合征的主要病理机制之一。自噬降解缺陷会引起p62和lc3-ii的蛋白质水平升高，以及p62聚集体和lc3标记的自噬结构在细胞质中异常累积。在hela细胞中，利用rna干扰技术敲低epg5基因的表达量，会引起细胞自噬缺陷，导致p62聚集体和lc3点状结构在细胞质中异常增多，以及p62和lc3-ii的蛋白质水平升高。ro-3306可以促进epg5敲低细胞系中的p62聚集体和lc3标记物的自噬降解，同样可以降低p62和lc3-ii的蛋白质水平(图15a-e)。
[0061]
以上结果提示ro-3306可以促进毒性蛋白质聚集体的自噬降解，因此可以用于神经退行性疾病的。

技术特征：

1.式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于使细胞中的tfeb蛋白液态凝聚体物理性质发生改变2.式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在细胞间期提高tfeb的转录活性。3.式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在细胞间期增加溶酶体数量和活性。4.式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在细胞间期促进致病性蛋白质聚集体的自噬降解。5.根据权利要求4所述的用途，其中所述致病性蛋白质聚集体是聚谷氨酰胺的蛋白质聚集体和含有p62的蛋白质聚集体。6.式i的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或神经退行性疾病。7.根据权利要求6所述的用途，其中所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默症、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化、遗传性共济失调、vici综合征、bpan综合征。

技术总结

本发明涉及喹啉噻唑啉酮衍生物Ro-3306在神经退行性疾病中的应用。本发明提供了Ro-3306(式I)在制备药物中的用途，所述药物用于预防或神经退行性疾病。Ro-3306可以直接作用于TFEB蛋白液态凝聚体，在细胞间期提高TFEB的转录活性，增加溶酶体数量和活性，促进致病性蛋白质聚集体的自噬降解，用于预防和神经退行性疾病。疗神经退行性疾病。疗神经退行性疾病。