使用亲水相互作用液相谱纯化和分离合成寡核苷酸的制作方法

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使用亲水相互作用液相谱纯化和分离合成寡核苷酸
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年3月6日提交的名称为“使用亲水相互作用液相谱纯化和分离合成寡核苷酸(purification and isolation of synthetic oligonucleotides using hydrophilic-interaction liquid chromatography)”的美国临时专利申请第62/986,421号的优先权。该专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
3.本公开涉及用于纯化合成寡核苷酸的方法。更具体地，本公开涉及提供经合成制备的寡核苷酸的改进纯化的方法。一般来讲，本公开的方法利用亲水相互作用液相谱(hilic)，并且一些实施方案也包括期望的经合成制备的寡核苷酸的质量靶向分离以实现该改进的纯化。

背景技术：

4.合成寡核苷酸是可以以序列特异性方式起作用来控制基因表达的短核酸链。因此，合成寡核苷酸对生物制药和个人医疗市场很受关注。
5.为了获得期望的寡核苷酸，将构件(例如，a、c、g、u等)以期望的顺序依次偶联到生长的寡核苷酸链。组装完成后，将产物从固相载体释放到溶液(即，反应混合物)中并收集。
6.这种用于制备期望的寡核苷酸的逐步化学过程将许多复杂副产物、加合物和缺失/截短的序列引入反应混合物中。通常，反应混合物中含有的靶向或期望的寡核苷酸需要分离和纯化，然后它们可以用于实验或用于期望的医疗/制药用途。用于纯化此粗反应混合物的常见技术包括凝胶电泳、离子交换谱和反相液相谱。然而，这些技术具有局限性。例如，凝胶电泳纯化技术通常会导致质量损失，因为几乎不可能从凝胶切片中回收所有产物。离子交换谱涉及使用通常含有非挥发性盐的缓冲液，这些盐会增加杂质，并且此过程涉及不可避免的产物损失。
7.通过反相液相谱(rplc)纯化粗反应混合物具有挑战性。首先，存在窄分离空间(例如，通常在整个分离梯度上变化小于10％)，这降低了成功分离产物和杂质峰的概率，这是影响分离纯靶向分子可行性的关键因素。除了窄分离空间之外，用于rplc的常见流动相添加剂具有难闻的气味，并且其毒性使得它们难以处理且成本高昂。rplc的高温要求增加了纯化过程的难度。一般来讲，rplc在60至90摄氏度的温度范围内进行。由于温度分布引起的问题，温度梯度不仅发生在谱柱的入口到出口，也发生在其宽度(例如，直径)上。这些温度梯度影响分离质量，并且因此降低了可能的纯化。并且大型制备柱的有效温度控制不易实现。由于寡核苷酸的反相谱通常需要60至90摄氏度的温度范围，并且对于较大的制备柱的温度控制不易实现，因此在室温下执行制备谱是优选的。

技术实现要素：

8.需要一种解决方案来克服与用于纯化经合成制备的寡核苷酸的常见技术(例如，
rplc、离子交换谱和凝胶电泳)相关联的挑战，并且也在总体上改进纯化过程(例如，成本更低、效率更高、纯化时间更短、纯度更高、量更大)。在一些示例中，对质荷比落在仪器质量范围内的靶向产物使用质量导向纯化可减少伴随仅使用紫外(uv)检测执行的分离的不确定性。在一些示例中，使用较短的谱柱用于制备型寡核苷酸纯化可提高生产能力并降低成本。在一些实施方案中，在室温下分离和纯化靶向寡核苷酸提供改进和/或可重复的结果。通过使用这些解决方案，并且在一些示例中结合其他解决方案，使用hilic方法减少或消除了与用于寡核苷酸分析/纯化的常见技术相关联的挑战。
9.在一个方面，该技术涉及一种使用亲水相互作用液相谱(hilic)分离包含合成寡核苷酸的反应混合物的方法。该方法包括(1)用hilic分离反应混合物中的靶向寡核苷酸；以及(2)用质量导向技术纯化所分离的靶向寡核苷酸，其中所分离的靶向寡核苷酸具有落在指定质量范围内的质荷比。
10.在另一方面，该技术涉及一种使用亲水相互作用液相谱(hilic)分离包含合成寡核苷酸的反应混合物的方法。该方法包括(1)用hilic分离反应混合物中的靶向寡核苷酸；以及(2)将所分离的靶向寡核苷酸纯化至大于或等于95.0％的最终纯度。
11.在另一方面，该技术涉及一种使用亲水相互作用液相谱(hilic)在反应混合物内纯化靶向寡核苷酸的方法。该方法包括(1)用hilic筛选反应混合物内的靶向寡核苷酸以产生初始反应混合物分布；(2)确定该靶向寡核苷酸的洗脱百分比；(3)将hilic洗脱梯度聚焦在该靶向寡核苷酸的该洗脱百分比周围；以及(4)在室温下使用所聚焦的洗脱梯度用hilic纯化该靶向寡核苷酸。
12.在另一方面，该技术涉及一种分离包含合成寡核苷酸的反应混合物的方法。该方法包括(1)用长度在50mm至100mm之间的谱柱分离反应混合物中的靶向寡核苷酸；以及(2)用质量导向技术纯化所分离的靶向寡核苷酸，其中所分离的靶向寡核苷酸具有落在指定质量范围内的质荷比。
13.上述方面的实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。例如，在一些实施方案中，纯化所分离的靶向寡核苷酸包括纯化至大于或等于95.0％的最终纯度。在一些实施方案中，纯化寡核苷酸包括纯化至大于或等于99.0％的最终纯度。在一些实施方案中，使用质量导向技术包括使用在指定质量范围内具有检测能力的质谱仪(ms)。在一些实施方案中，使用质量导向技术包括使用具有质谱仪和紫外(uv)检测器的系统。在一些实施方案中，寡核苷酸的分离在室温下执行，并且室温可在约20℃至约25℃的范围内。在一些实施方案中，用hilic分离包括用ph大于约5的流动相洗脱。在一些实施方案中，在纯化之后执行附加步骤。附加步骤包括对靶向寡核苷酸执行正交方法技术以进行级分分析。
附图说明
14.通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：
15.图1为示出根据本公开的方法的流程图。
16.图2a为通过hilic进行16聚体寡核苷酸纯化的谱图。
17.图2b为通过hilic进行30聚体寡核苷酸纯化的谱图。
18.图2c为通过hilic进行57聚体寡核苷酸纯化的谱图。
19.图3a为16聚体寡核苷酸级分的uv谱图。
20.图3b为16聚体寡核苷酸级分的tic谱图。
21.图4a为30聚体寡核苷酸级分的uv谱图。
22.图4b为30聚体寡核苷酸级分的tic谱图。
23.图5a、图5b和图5c提供57聚体寡核苷酸级分的数据处理结果。
具体实施方式
24.寡核苷酸的合成可以产生复杂副产物、加合物和截短的序列。含有废物以及靶向寡核苷酸的反应混合物在使用前需要分离和纯化。也就是说，为了在产物(例如，生物制药或个性化医学等)中使用合成寡核苷酸，需要分离粗反应混合物以分离和纯化寡核苷酸(例如，从靶向寡核苷酸中去除废物)。
25.如所论述，rplc提供窄分离空间。在一些示例中，该分离空间可为3％-5％的有机梯度变化。当拉开靶向寡核苷酸距离并且也用于维持高纯度时，窄分离可能会产生困难。在一些示例中，不需要的产物可以与期望的产物(例如，靶向寡核苷酸)共洗脱。不需要的产物对靶向寡核苷酸的纯度产生不利影响。除窄分离空间之外，rplc还具有其他缺点/挑战。例如，rplc的缓冲液、改性剂和添加剂(例如，三甲胺(tea)和1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(hfip))可能有毒，这使得处理成本高昂且有风险。此外，无论处理问题如何，hfip都是昂贵的。这些成本可使rplc成本过高，需要其他解决方案。一般来讲，使用rplc的寡核苷酸分离需要高温。例如，rplc通常可需要60至90摄氏度的柱温，以发生分离。rplc还需要长柱，诸如150mm-250mm。长柱可以增加级分体积的大小，这可增加级分干燥时间和及时处理样品的能力。rplc的时间长度可影响与rplc相关联的过程和成本。此外，rplc通常仅与紫外(uv)检测配合用于分离步骤。uv检测导致非特异性分析。也就是说，uv吸收不是特异性的——质量分析(ms检测器)的特异性更高，并且可提供更高的靶向分离能力。
26.hilic减轻了与反相谱分离和纯化寡核苷酸相关联的挑战。图1为示出根据本公开的方法100的流程图。方法100包括如图1中虚线所示的任选步骤。用于采用质量导向纯化的hilic谱的方法100包括在粗反应混合物中筛选靶向寡核苷酸(102)，确定靶向寡核苷酸的洗脱百分比(104)，将hilic洗脱梯度聚焦在所确定的洗脱百分比周围(106)，分离该靶向寡核苷酸(108)，纯化该靶向寡核苷酸(110)，以及任选地运行正交方法以用于进一步分析，诸如级分分析(112)。
27.在一些示例中，筛选靶向寡核苷酸(102)可以被称为检测运行。检测运行可以帮助确定用于分离靶向寡核苷酸的适当梯度。利用寡核苷酸的hilic分离，几乎消除了rplc经历的窄分离空间问题。尽管在rplc技术中可获得3％-5％的总筛选分离空间(例如，7％-12％的梯度)，但在本公开的方法中，5％-50％或更多(即，总共45％)的宽空间可用于筛选靶向寡核苷酸(102)。具有宽洗脱液范围的筛选梯度为本发明的方法提供了足够宽的粗反应混合物分布以确定靶向寡核苷酸的洗脱百分比(104)。寡核苷酸产物的保留时间以及系统和谱柱体积以及梯度斜率用于开发聚焦梯度。为了分离靶向寡核苷酸(108)，将梯度聚焦在寡核苷酸洗脱百分比周围(106)提高了产物与其紧密洗脱的污染物峰之间的分离度，并增加获得纯产物的可能性。筛选梯度的大小可以变化。例如，用于初始分析的筛选梯度可为5％-50％或5％-95％的强溶剂。筛选梯度可以使寡核苷酸分离能够在随后使用具有浅斜率(例如，每柱体积0.2％-0.4％)和目标产物洗脱百分比周围的范围的所聚焦梯度执行。目标
产物洗脱百分比周围的范围可以变化。例如，该范围可以是8％，其中5％低于靶标且3％高于靶标，以确保靶向寡核苷酸的分离。
28.反相寡核苷酸分离通常在高温(60至90摄氏度)下执行。尽管分析谱中经常使用温度控制来改进分离，但在较大制备柱上实现有效的温度控制并不容易。放置在谱柱周围的加热套并不总是有效的。分离在平衡柱中入口溶剂的温度下发生，因此需要在溶剂进入谱柱之前加热溶剂。温度梯度通常在多于一维(例如，不仅通过谱柱的长度，也通过谱柱的宽度)的情况下发生。结果可能是谱柱不平衡。在室温下进行寡核苷酸的hilic分离消除了与加热制备柱相关联的固有复杂性。在一些示例中，室温从约20摄氏度(℃)延伸至约25摄氏度。
29.含有tea和hfip的流动相缓冲液通常用于采用质谱和电喷雾电离的反相方法。尽管hfip提高了寡核苷酸质量分析的灵敏度，但正如文献中报道的那样，hfip是有毒的，并且其使用成本可能过高。
30.用于hilic的缓冲液、改性剂和添加剂可能是常见的(例如，乙酸铵)，毒性比流动相缓冲液(诸如tea和hfip)低，易于处理且价格合理(成本不高)。本公开的流动相可含有20毫摩尔(mm)乙酸铵，ph调节至5.5。在一些示例中，ph大于5。可以根据过程条件(包括靶向寡核苷酸)调节ph。例如，不同的寡核苷酸序列可能需要不同的乙酸铵和/或ph调节。乙酸铵的一些优点包括：与质谱仪相容，在冻干过程中容易蒸发，并且成本合理。乙酸铵可用于在质量检测中的正负切换，并且寡核苷酸主要采用负电离模式检测。
31.为了用hilic分离靶向寡核苷酸(108)，可以使用短柱。在一些示例中，短柱包括2.1
×
50毫米(mm)或2.1
×
100mm。短柱的益处包括时间更短并且级分体积更小，该级分主要是比水可干燥得更快的有机溶剂。这些益处会对过程和成本产生积极影响。另外，本公开不限于2.1mm的谱柱。根据待纯化的产物的量，该过程可以扩展到更大直径的谱柱，包括7.8mm、10mm、19mm、30mm、50mm(并且可能甚至为更大直径的谱柱)。这些谱柱的示例性直径并不详尽，也可以使用其他直径。即使直径较大，使用更短的谱柱的益处仍然可以实现。并且，在一些示例中，也可以使用更长的谱柱。在一些示例中，谱柱大小/尺寸的确定可以至少部分地基于粗寡核苷酸反应混合物和期望的产物。
32.尽管uv普遍用于分析级和制备级两者的寡核苷酸检测，但ms导向纯化减少了仅与uv检测相关联的不确定性。大多数具有质量检测的系统也配置有uv/pda检测器，并且同时收集uv和ms谱图两者。双重检测适用于化合物质量落在质量检测器质量范围外的那些情况或电离势有限的化合物。靶向收集已知质量增加了更有效地分离正确产品的可能性。因为寡核苷酸易受多个质量电荷的影响，因此有时即使全长的分子质量高于ms的质量上限，落在质谱仪m/z范围内的质量也可用于靶向。计算寡核苷酸的多个电荷的软件程序有助于提供用于ms导向纯化的建议靶标。例如，使用质量导向纯化的具有多个电荷态的16聚体被指定为级分触发。
33.结果
34.使用比反相分离所需的更短的谱柱来分离三种寡核苷酸，在2.1
×
50mm torus diol谱柱上分离16聚体，以及在2.1
×
100mm torus diol谱柱上分离30聚体和57聚体，两者粒度均为1.7μm。短柱节省时间和处理资源。所有谱柱均可从waters technologies corporation(美国马萨诸塞州米尔福德)商购获得。
35.图2a提供根据本公开的技术通过hilic进行16聚体寡核苷酸纯化的谱图。在16聚体寡核苷酸的此纯化中，使用了以下流动相：流动相a包含95水/5乙腈，含20mm乙酸铵，ph 5.5，并且流动相b包含5水/95乙腈，含20mm乙酸铵，ph 5.5。由于寡核苷酸是分子量约为4800g/mol的短寡核苷酸，因此其质荷比落在本公开系统中配置的ms装置的检测能力范围内。不同系统上的其他质谱仪可具有更宽的质量范围。在筛选运行中，用于分离16聚体的ms触发被确定为1214.3。分离聚焦在靶向寡核苷酸的洗脱百分比周围，并且靶向寡核苷酸的质量用于触发级分收集。图2a表明纯化是质量导向的，其中16聚体的分离条件聚焦在靶向寡核苷酸的洗脱百分比周围。
36.图2b提供了根据本公开的技术通过hilic进行30聚体寡核苷酸纯化的谱图。在30聚体寡核苷酸的此纯化中，使用了以下流动相：流动相a包含95水/5乙腈，含20mm乙酸铵，ph 5.5，并且流动相b包含5水/95乙腈，含20mm乙酸铵，ph 5.5。与16聚体相比，此寡核苷酸具有更高的分子量(例如，大约9200g/mol)。30聚体不具有落在本公开的系统中配置的质量检测器的质量范围内的质量电荷态。因此，产生最大化合物吸光度的uv波长被用作uv触发。在此示例中，uv触发被确定为260nm。类似于图2a，图2b表明纯化是uv导向的，其中分离条件聚焦在靶向寡核苷酸的洗脱百分比周围。
37.图2c提供了根据本公开的技术通过hilic进行57聚体寡核苷酸纯化的谱图。在57聚体寡核苷酸的此纯化中，使用了以下流动相：流动相a包含95水/5乙腈，含20mm乙酸铵，ph 5.5，并且流动相b包含5水/95乙腈，含20mm乙酸铵，ph 5.5。与16聚体相比，此寡核苷酸也具有更高的分子量(例如，大约17,500g/mol)。57聚体也不具有落在ms装置的检测能力内的质荷比。因此，使用uv检测器，并从筛选运行中识别uv触发。在此示例中，uv触发被确定为260nm。图2c表明纯化是uv导向的，其中分离条件聚焦在靶向寡核苷酸的洗脱百分比周围。聚焦在化合物的洗脱百分比的周围，ms或uv波长用于检测和级分触发。许多化合物在单一波长处吸收，而一种(或更少数量的化合物)将具有指定的质量。
38.在这些示例中，使用价格合理的流动相添加剂和uv和/或ms导向纯化，在50和100mm torus diol谱柱上使用hilic谱成功分离了平均长度的寡核苷酸。在室温下使用稳定且毒性较小的流动相添加剂进行分离。产物级分有机溶剂含量高，并且易于蒸发以用于使用正交方法进行纯化后分析。最终产物质量优异，如表1中所详述。
39.表1：hilic纯化(寡核苷酸纯度表)
40.寡核苷酸粗产物纯度最终纯度16聚体57.0％95.2％30聚体87.9％99.5％57聚体75.3％99.5％
41.在一些示例中，纯化所分离的靶向寡核苷酸包括纯化至大于或等于60％、65％、70％、75％、80.0％、85.0％、90.0％、95.0％、99％、99.5％或更高的最终浓度。
42.几种不同的hilic谱柱是实验研究的一部分，并且根据分子的特性，它们中的任何一种对于其他寡核苷酸都可能是可接受的。谱柱中的一些谱柱包括beh hilic、beh amide、atlantis hilic silica和torus diol，所有谱柱的长度均为50mm或100mm，内径为2.1mm。atlantis hilic silica谱柱用3μm颗粒填充，而其他谱柱用1.7μm颗粒填充。使用配置有waters fraction manager-analytical(wfma)和diol谱柱的h级系统成功分
离了少量寡核苷酸。所有装备均可从waters technologies corporation(美国马萨诸塞州米尔福德)商购获得。该过程可以被扩展以包括更大的谱柱和系统，包括诸如7.8mm、10mm、19mm、30mm、50mm的谱柱(以及可能甚至更大直径的谱柱)。
43.可以基于预测的谱柱用途来选择谱柱填料的粒度。也可以使用具有较大粒度的谱柱填料。例如，可以使用1.7μm、3μm、5μm和10μm。较大的颗粒可潜在地用于大规模纯化。
44.靶向寡核苷酸的级分分析——正交结果
45.产物级分有机溶剂含量高，并且易于蒸发以用于使用正交方法(诸如使用质量分析的离子对rp分离)进行纯化后分析。
46.图3a为16聚体寡核苷酸级分的uv谱图。正交分析在2.1
×
50mm ost谱柱上使用离子对分离，并且温度保持在60摄氏度。对于流动相，存在两种溶剂：溶剂a和溶剂b。溶剂a为15mm tea和400mm hfip的水溶液。溶剂b为15mm tea和400mm hfip的甲醇溶液。流速为0.2ml/min。在该示例中，在260nm处监测离子对分离。
47.图3b为16聚体寡核苷酸级分的tic谱图。正交分析在2.1
×
50mm ost谱柱上使用离子对分离，并且温度保持在60摄氏度。对于流动相，存在两种溶剂：溶剂a和溶剂b。溶剂a为15mm tea和400mm hfip的水溶液。溶剂b为15mm tea和400mm hfip的甲醇溶液。流速为0.2ml/min。在此示例中，uv触发被确定为260nm。针对图3a和图3b描述的条件用于采用uv检测(图3a)和ms检测(图3b)执行的相同实验。图3a和图3b所示结果的比较示出了本公开的基于hilic的纯化方法的高纯度。
48.图4a为30聚体寡核苷酸级分的uv谱图。正交分析在2.1
×
50mm ost谱柱上使用离子对分离，并且温度保持在60摄氏度。对于流动相，存在两种溶剂：溶剂a和溶剂b。溶剂a为7mm tea和80mm hfip的水溶液。溶剂b为3.5mm tea和40mm hfip的50％甲醇溶液。流速为0.3ml/min。在该示例中，在260nm处监测离子对分离。
49.图4b为30聚体寡核苷酸级分的tic谱图。正交分析在2.1
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50mm ost谱柱上使用离子对分离，并且温度保持在60摄氏度。对于流动相，存在两种溶剂：溶剂a和溶剂b。溶剂a为7mm tea和80mm hfip的水溶液。溶剂b为3.5mm tea和40mm hfip的50％甲醇溶液。流速为0.3ml/min。在此示例中，uv触发被确定为260nm。图4a和图4b所示结果的比较示出了本公开的基于hilic的纯化方法的高纯度。
50.图5a、图5b和图5c提供57聚体寡核苷酸级分的数据处理结果。unifi中的数据处理结果具有24ppm质量精度误差。正交分析在2.1
×
50mm ost谱柱上使用离子对分离，并且温度保持在60摄氏度。流动相含有两种溶剂：溶剂a为7mm tea和80mm hfip的水溶液，而溶剂b为3.5mm tea和40mm hfip的50％甲醇溶液。流速为0.3ml/min。在260nm处监测离子对分离。左侧部分的谱图来自反相离子对分析(左侧，顶部)和tic分析(左侧，底部)。左侧的谱图来自反相离子对分析，包括在260nm处的uv分析(顶部)以及质量分析(总离子谱图，底部)。这些结果连同使用unifi(右侧部分)的数据处理示出了本公开的纯化过程的高纯度。
51.另选方案
52.存在许多可供在本公开中使用的替代方法和实施方案。虽然上述方法通常已相对于使用包含20mm乙酸铵且ph调节至5.5的流动相进行了讨论，但其他缓冲液、缓冲液量和ph
值也是可能的。此外，虽然上述示例展示了小规模的制备谱，但是预期本文所述的方法可以被平移和扩大规模以分离更大量的靶向化合物。这些和其他替代方法或实施方案对于本领域普通技术人员来说是可能的并且是可行的。

技术特征：

1.一种使用亲水相互作用液相谱(hilic)分离包含合成寡核苷酸的反应混合物的方法，所述方法包括：用hilic分离所述反应混合物中的靶向寡核苷酸；以及用质量导向技术纯化所分离的靶向寡核苷酸，其中所分离的靶向寡核苷酸具有落在指定质量范围内的质荷比。2.根据权利要求1所述的方法，其中纯化所分离的靶向寡核苷酸包括纯化至大于或等于95.0％的最终纯度。3.根据权利要求1所述的方法，其中使用所述质量导向技术包括使用在所述指定质量范围内具有检测能力的质谱仪。4.根据权利要求1所述的方法，其中使用所述质量导向技术包括使用具有质谱仪和紫外(uv)检测器的系统。5.一种使用亲水相互作用液相谱(hilic)分离包含合成寡核苷酸的反应混合物的方法，所述方法包括：用hilic分离所述反应混合物中的靶向寡核苷酸；以及将所分离的靶向寡核苷酸纯化至大于或等于95.0％的最终纯度。6.根据权利要求5所述的方法，还包括在室温下执行所述寡核苷酸的所述分离，并且其中室温在约20℃至约25℃的范围内。7.根据权利要求5所述的方法，其中用hilic分离包括用ph大于约5的流动相洗脱。8.一种使用亲水相互作用液相谱(hilic)在反应混合物内纯化靶向寡核苷酸的方法，所述方法包括：用hilic筛选所述反应混合物内的所述靶向寡核苷酸以产生初始反应混合物分布；确定所述靶向寡核苷酸的洗脱百分比；将hilic洗脱梯度聚焦在所述靶向寡核苷酸的所述洗脱百分比周围；以及在室温下使用所聚焦的洗脱梯度用hilic纯化所述靶向寡核苷酸。9.根据权利要求8所述的方法，其中纯化所述寡核苷酸包括纯化至大于或等于95.0％的最终纯度。10.根据权利要求8所述的方法，其中纯化所述寡核苷酸包括纯化至大于或等于99.0％的最终纯度。11.根据权利要求8所述的方法，还包括对所述靶向寡核苷酸执行正交方法技术以进行级分分析。12.一种分离包含合成寡核苷酸的反应混合物的方法，所述方法包括：用长度在50mm至100mm之间的谱柱分离所述反应混合物中的靶向寡核苷酸；以及用质量导向技术纯化所分离的靶向寡核苷酸，其中所分离的靶向寡核苷酸具有落在指定质量范围内的质荷比。13.根据权利要求12所述的方法，其中纯化所分离的靶向寡核苷酸包括纯化至大于或等于95.0％的最终纯度。14.根据权利要求12所述的方法，其中使用所述质量导向技术包括使用在所述指定质量范围内具有检测能力的质谱仪。15.根据权利要求12所述的方法，其中使用所述质量导向技术包括使用具有质谱仪和
紫外(uv)检测器的系统。

技术总结

本发明公开了使用亲水相互作用液相谱(HILIC)在反应混合物内纯化靶向寡核苷酸的方法。根据本公开的方法中的一种方法包括用HILIC筛选反应混合物内的靶向寡核苷酸以产生初始反应混合物分布；确定该靶向寡核苷酸的洗脱百分比；将HILIC洗脱梯度聚焦在该靶向寡核苷酸的该洗脱百分比周围；以及在室温下使用所聚焦的洗脱梯度用HILIC纯化该靶向寡核苷酸。一些实施方案可利用质量触发对该靶向寡核苷酸的级分收集。当质量落在MS检测器的质量范围外时，一些实施方案可利用UV触发。一些实施方案可利用UV触发。一些实施方案可利用UV触发。