蛋白包被的胶乳微球试剂及包被方法与流程

阅读：评论：0

1.本发明涉及体外诊断试剂制备领域，具体而言，涉及一种蛋白包被的胶乳微球试剂及包被方法。

背景技术：

2.胶乳免疫比浊法是体外诊断领域中有较高技术瓶颈的一种检测方法，其基本原理为将待测物质相对应的抗原/抗体包被在一定大小的胶乳颗粒上，加入待检测样本后，相应抗体/抗原与微球上抗原/抗体结合，发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳凝集成正比，也就是与待测抗原/抗体量成正比，从而提高试验的敏感性。
3.该方法学的主要的难点之一在于抗原或抗体和胶乳微球的偶联。常规的偶联方法有物理吸附法和化学偶联法，其中物理吸附法受限于缓冲液体系的影响，稳定性不佳，因此现在主流的偶联方法为化学偶联。化学偶联法是通过化合键将微球上的基团和抗原/抗体上的基团连接在一起，形成稳定的复合物。
4.目前市面上常用的化学偶联法有常规的一步法工艺和两步法工艺，其中一步法工艺是将胶乳微球、活化剂和抗原/抗体处于同一溶液中进行反应，将抗原/抗体偶联到羧基胶乳微球上面，但是该方法容易造成微球的团聚、降低抗体的使用率，并且需要在偶联、封闭结束后离心去除未结合上微球的抗体和活化剂，工艺耗时较长。两步法工艺是将活化和偶联过程进行分开，先将微球用一种活化剂进行活化，活化后离心去除多余的活化剂，然后再与抗体进行偶联，待偶联、封闭结束后再次进行离心储存，工艺比较复杂，限制了放大生产试剂的稳定性。
5.因此，亟需一种包被工艺能够在节约成本，提高试剂的生产效率同时，控制试剂的稳定性，保证产品性能。

技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于提供一种蛋白包被的胶乳微球试剂及包被方法，以解决现有工艺制备的胶乳微球偶联抗体或抗原相关试剂批次间稳定性差的问题。
7.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种胶乳微球的包被方法，该包被方法包括：采用混合活化剂对胶乳微球进行活化反应，得到活化微球；采用偶联缓冲液稀释活化微球和蛋白，分别得到稀释活化微球和稀释蛋白；将稀释活化微球与稀释蛋白进行偶联反应，得到偶联复合物；对偶联复合物依次进行封闭及储存处理，得到蛋白包被的胶乳微球溶液；其中，偶联缓冲液选自如下任意一种：硼砂缓冲液、磷酸盐缓冲液、hepes缓冲液及mops缓冲液；混合活化剂为edc和sulfo-nhs的混合溶液。
8.进一步地，采用混合活化剂对胶乳微球进行活化反应，得到活化微球包括：将羧基胶乳微球置于活化缓冲液中，得到微球溶液；按羧基胶乳微球：edc:sulfo-nhs＝10:(0.15-1):(0.15-1)的质量比，优选地为10:(0.5-0.75):(0.5-0.75)，将微球溶液与混合活化剂混
合后进行活化反应，不经离心，得到活化微球；优选地，微球溶液与混合活化剂混合后，羧基胶乳微球的终浓度为2％～8％(m/m)。
9.进一步地，活化缓冲液为mes缓冲液，更优选mes缓冲液的离子强度为20～100mm，更优选mes缓冲液的ph为5.8-6.4；进一步优选活化缓冲液为50mm ph6.0的mes缓冲液。
10.进一步地，在搅拌条件下进行活化反应，更优选搅拌的转速为100～500rpm；优选地，活化反应持续20～60min。
11.进一步地，偶联缓冲液的离子强度为20mm～100mm，更优选偶联缓冲液的ph为7.8-8.6；进一步优选地，偶联缓冲液为65.5mm ph 8.2的硼砂缓冲液。
12.进一步地，稀释活化微球中，羧基胶乳微球的浓度为1％～4％(m/m)；优选地，按照羧基胶乳微球：蛋白的质量比＝(40-2):1的比例进行偶联反应，得到偶联复合物；优选地，羧基胶乳微球的偶联浓度为1％～3％；优选地，偶联反应持续的时间为1.5h～24h。
13.进一步地，对偶联复合物依次进行封闭及储存处理，得到蛋白包被的胶乳微球溶液包括：在搅拌条件下，将偶联复合物与封闭缓冲液等体积混合以进行封闭，不经离心，得到封闭混合液，并向封闭混合液中添加储存缓冲液，得到蛋白包被的胶乳微球溶液；优选地，搅拌的转速为100-500rpm；优选地，封闭缓冲液为含1％bsa的储存缓冲液；优选地，封闭持续时间为0.5～1h；优选地，储存缓冲液包括ph7.4 tris 12.1g/l、氯化钠10g/l、叠氮钠1.0g/l、吐温20 0.5ml/l及bsa 1g/l；优选地，蛋白包被的胶乳微球溶液中，蛋白包被的胶乳微球的终浓度为0.1％～0.5％。
14.进一步地，蛋白为抗原或抗体；优选地，蛋白选自如下任意一种抗原或其抗体：半胱氨酸蛋白酶抑制剂c、α1微球蛋白及抗链球菌溶血素“o”。
15.根据本技术的第二个方面，提供了一种蛋白包被的胶乳微球试剂，蛋白包被的胶乳微球通过上述任一种包被方法包被得到。
16.进一步地，蛋白包被的胶乳微球试剂中含有如下任意一种或多种成分：edc降解产物、sulfo-nhs、mes以及偶联缓冲液中的相关组分。
17.应用本发明的技术方案，本技术的包被工艺通过采用两种活化剂edc和sulfo-nhs对胶乳微球进行了活化，活化的胶乳微球在碱性的偶联缓冲液环境中与抗体或抗原等蛋白生成稳定的复合物，使用该工艺得到的试剂稳定性大大增强。
附图说明
18.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
19.图1示出了实施例2中的检测试剂的hook效应图。
20.图2示出了实施例2中的检测试剂与罗氏试剂对样本检测的比对结果图。
21.图3示出了实施例3中的检测试剂与九强试剂对样本检测的比对结果图。
22.图4示出了实施例3中检测试剂的hook效应图。
23.图5示出了实施例4中的检测试剂与罗氏试剂对样本检测的比对结果图。
24.图6示出了实施例4中检测试剂的hook效应图。
具体实施方式
25.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
26.术语解释：
27.cysc：半胱氨酸蛋白酶抑制剂c，胱抑素c
28.β2-mg：β2微球蛋白
29.α1-mg：α1微球蛋白
30.aso：抗链球菌溶血素“o”31.edc：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
32.sulfo-nhs：n-羟基硫代琥珀酰亚胺
33.bsa：牛血清白蛋白
34.mes：2-(n-吗啉)乙磺酸
35.bb：硼砂缓冲液
36.pb：磷酸缓冲液
37.hepes：(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)
38.mops：3-(n-啉)丙磺酸
39.胶乳微球，本技术中也简称为微球，主要指表面修饰有羧基的胶乳微球。适用于本技术的胶乳微球的具体种类列举如下：聚苯乙烯羧基胶乳微球，聚甲基丙烯酸甲酯羧基胶乳微球、苯乙烯-丙烯酸酯羧基胶乳微球等。
40.如背景技术部分提到的，现有技术中抗原/抗体的胶乳微球偶联方法中，存在工艺步骤繁琐，不仅成本高、且批间差较大，为改善这一现状，在本技术一种典型的实施方式中，提供了一种胶乳微球的包被方法，该包被方法包括：采用混合活化剂对胶乳微球进行活化反应，得到活化微球；采用偶联缓冲液稀释活化微球和蛋白，分别得到稀释活化微球和稀释蛋白；将稀释活化微球与稀释蛋白进行偶联反应，得到偶联复合物；对偶联复合物依次进行封闭及储存处理，得到蛋白包被的胶乳微球溶液；其中，偶联缓冲液选自如下任意一种：硼砂缓冲液、磷酸盐缓冲液、hepes缓冲液及mops缓冲液；混合活化剂为edc和sulfo-nhs的混合溶液。
41.本技术的上述包被工艺，通过采用两种活化剂edc和sulfo-nhs先对胶乳微球进行了活化，置换下来的edc大部分被水解，从而降低edc造成的抗体自交联。而活化的胶乳微球在碱性的偶联缓冲液环境中与抗体或抗原等蛋白进行脱水缩合的酰胺化反应生成稳定的复合物。进而显著缩小了批次间的包被产品的批间差。
42.具体地，上述硼砂缓冲液、磷酸盐缓冲液、hepes缓冲液及mops缓冲液偶联缓冲液，均为偏碱性的缓冲液，有助于脱水缩合反应，且产物稳定性更好。
43.本技术中的活化步骤后，活化剂不需要离心除去，所以活化剂、活化的胶乳微球和蛋白仍在同一体系中，本质上是一种一步法包被工艺。
44.需要说明的是，本技术中的胶乳微球可以根据需要合理选择。胶乳微球因其表面修饰有同种电荷的基团，基团所带有的同种电荷相互之间存在排斥作用，这使胶乳微球在溶液中通过这种排斥力的作用保持相对的稳定。胶乳微球合成的过程中通常都要添加一些表面活性剂，表面活性剂的存在有助于维持微球的稳定性，但表面活性剂的存在会对后续
微球与蛋白的偶联产生一定的影响。所以一般现在的胶乳微球生产工艺中都会尽可能的去除掉保存液中的表面活性剂。常规的胶乳微球保存液中主要成分是纯化水，包含有痕量的tween20表面活性剂及痕量的proclin300，独特的微球表面修饰技术使微球在该种缓冲液中可以稳定保存。
45.胶乳微球的主要材质是聚苯乙烯，该种材质是可以耐受一定的高温但是对低温不耐受，在保存和运输的过程中是不能够被冷冻的；在冻融的过程中微球的粒径和形状会发生改变，同时使胶乳微球之间更容易聚集结块，从而无法再分散开来。
46.需要说明的是，导致放大生产的试剂不同批次之间检测差异大的因素有很多种，本技术为改善这一问题，前期曾尝试调整了各项反应参数(比如缓冲液离子强度、活化微球浓度或离心时间)都没有解决该技术问题，在一次实验中，通过调整微球活化浓度和反应体系的离子强度，尤其是保证高的活化浓度，意外发现在该条件下，去除离心的步骤也可以达到试剂的性能要求，并且不同批次的偏差显著降低。因此推测，离心是导致放大生产的试剂盒的批间差大的主要因素。进一步地，在此基础上进行了大量实验验证，发现该条件下的确能够提升不同批放大生产试剂的稳定性。
47.在一些优选的实施例中，采用混合活化剂对胶乳微球进行活化反应，得到活化微球包括：将羧基胶乳微球置于活化缓冲液中，得到微球溶液；按羧基胶乳微球：edc:sulfo-nhs＝10:(0.15-1):(0.15-1)的质量比，将微球溶液与混合活化剂混合后进行活化反应，不经离心，得到活化微球；优选地，微球溶液与混合活化剂混合后，羧基胶乳微球的终浓度为2％～8％(m/m)。
48.上述优选实施例中，通过将羧基胶乳微球与两种活化剂按上述质量比进行活化反应，有助于尽可能多地形成微球-sulfo-nhs复合物的形态，从而提高胶乳微球的活化比例。而将羧基胶乳微球的终浓度控制在2％～8％(m/m)的范围内，具有减少偶联的体积、不需要特定的设备、方便放大生产的效果。
49.在一些优选的实施例中，活化缓冲液为mes缓冲液，更优选mes缓冲液的离子强度为20～100mm，更优选mes缓冲液的ph为5.8-6.4；进一步优选活化缓冲液为50mm ph6.0的mes缓冲液。
50.胶乳微球活化的缓冲液采用常用的mes缓冲液。本技术中采用mes缓冲液的ph值控制在5.8-6.4范围内(现有技术中的相对较低的ph值，比如ph4.7的mes缓冲液)，具有稳定活化剂edc进而提高微球活化效率的有益效果。而采用20～100mm的离子强度，相比15mm或200mm，具有稳定微球减少活化时微球的团聚和提高活化效率的优势。
51.在一些优选的实施例中，在搅拌条件下进行活化反应，更优选搅拌的转速为100～500rpm；优选地，活化反应持续20～60min。上述优选的实施例中，不用经历离心的过程，通过搅拌即可进行后续的实验步骤。
52.在一些优选的实施例中，偶联缓冲液的离子强度为20mm～100mm，更优选偶联缓冲液的ph为7.8-8.6；进一步优选地，偶联缓冲液为62.5mm ph8.2的硼砂缓冲液。上述偶联缓冲液，将上述各参数控制在上述范围，有助于提高批次间的稳定性，提高物料投料容错率的有益效果。
53.在一些优选的实施例中，稀释活化微球中，羧基胶乳微球的浓度为1％～4％(m/m)，优选2％～4％(m/m)；更优选地，稀释蛋白的总体积与稀释活化微球的总体积相等；在实
际操作过程中，该比例下能够避免某个局部的抗体浓度过高造成团聚。因而较优的方式是等体积混合。
54.在一些优选的实施例中，按照羧基胶乳微球：蛋白的质量比＝(40-2):1的比例进行偶联反应，得到偶联复合物；优选地，羧基胶乳微球的偶联浓度为1％～3％。在一些优选的实施例中，偶联反应持续的时间为1.5h～24h。按照上述优选的比例进行偶联，有助于提高羧基胶乳微球的偶联效率。此处羟基乳胶微球的偶联浓度是指加入偶联缓冲液后体系中，羧基胶乳微球的质量占整个液体体系质量的百分比。偶联反应的体系中，偶联缓冲液添加量多，偶联浓度低；偶联缓冲液添加量少，偶联浓度就高。若浓度太高容易团聚，浓度太低会影响偶联稳定性。在1％～3％的偶联浓度下，偶联效率相对较高，且稳定性高。
55.在一些优选的实施例中，对偶联复合物依次进行封闭及储存处理，得到蛋白包被的胶乳微球溶液包括：在搅拌条件下，将复合物与封闭缓冲液等偶联体积混合以进行封闭，不经离心，得到封闭混合液，并向封闭混合液中添加储存缓冲液，得到蛋白包被的胶乳微球溶液；优选地，搅拌的转速为100-500rpm；优选地，封闭缓冲液为含1％bsa的储存缓冲液；优选地，封闭持续时间为0.5～1h；优选地，储存缓冲液包括ph7.4 tris 12.1g/l、氯化钠10g/l、叠氮钠1.0g/l、吐温20 0.5ml/l及bsa 1g/l；优选地，蛋白包被的胶乳微球溶液中，蛋白包被的胶乳微球的终浓度为0.1％～0.5％。
56.需要说明的是，本技术的上述优选实施例中，对偶联复合物进行封闭也无需经过离心来实现封闭。在封闭缓冲液的搅拌作用下实现对羧基胶乳微球表面其他未被抗体或抗原等蛋白偶联结合的其他羧基，提高检测特异性，从而减少后续包被产品试剂在检测相应目标产物时的非特异性。
57.上述胶乳微球的蛋白包被工艺，适用于任何体外诊断检测试剂的相关蛋白。在一些优选的实施例中，蛋白为抗原或抗体；优选地，蛋白包括但不限于如下任意一种蛋白或其抗体：半胱氨酸蛋白酶抑制剂c、α1微球蛋白及抗链球菌溶血素“o”。
58.在本技术第二种典型的实施方式中，提供了一种蛋白包被的胶乳微球试剂，该蛋白包被的胶乳微球通过上述包被方法包被得到。
59.在一些优选的实施例中，蛋白包被的胶乳微球试剂中含有如下任意一种或多种成分：edc降解产物、sulfo-nhs、mes以及偶联缓冲液中的相关组分。
60.本技术的包被工艺整个过程中不包含离心的步骤，因而得到的抗体或抗原等蛋白包被的胶乳微球中不可避免地含有包被工艺过程中的试剂的残留，或其降解产物的残留。但经过试验验证，本技术的包被产物不仅不受残留物的影响，具有较高的稳定性，且不同批次间的差异也相对更小。
61.在本技术的一些更优选的实施例中，本技术的包被工艺包括如下步骤：
62.1)微球活化：羧基胶乳微球(10％浓度)置于20-100mm的ph(5.8-6.4)mes缓冲液中，加入质量比为微球：edc:sulfo-nhs＝10:(0.15-1):(0.15-1)比例的活化剂，加入活化剂后微球的终浓度为2％-8％，100-500rpm搅拌活化20min-1h。
63.2)微球的偶联：步骤1)中活化的羧基胶乳微球用偶联缓冲液(62.5mm ph8.2的硼砂缓冲液)稀释，300-500rpm搅拌混匀。抗体或抗原用偶联缓冲液稀释，优选地，稀释后抗体的总体积与稀释后微球的总体积相等。300-500rpm搅拌状态下，向微球中加入稀释后的抗体/抗原，其中羧基胶乳微球：抗体/抗原(质量比)＝(40-2):1，微球偶联浓度为1％-3％。抗
体/抗原与羧基胶乳微球混合后100-500rpm搅拌偶联1.5-24h。常用的偶联缓冲液为硼砂缓冲液，pbs缓冲液，hepes缓冲液，mops缓冲液，浓度为20-100mm，ph范围为7.8-8.6。
64.3)微球的封闭：步骤2)中偶联后的微球中100-500rpm搅拌添加等体积的封闭缓冲液(封闭缓冲液为含10g/l bsa的储存缓冲液)，继续100-500rpm搅拌30min-1h。
65.4)微球的储存：步骤3)中封闭后的混合液中添加储存缓冲液，最终微球浓度为0.1％-0.5％，100-500rpm搅拌10min，即得到成品试剂，成品试剂于2-8℃储存。
66.该一步法(即一步偶联)工艺中由于无离心的过程，在成品试剂中应该会有edc降解产物，sulfo-nhs以及mes和偶联缓冲液相关组分(即使含有这些残留，产品的性能也不受影响)。
67.下面将结合具体的实施例来进一步说明本技术的有益效果。需要说明的是，以下实施例以完整的相关检测试剂产品(即试剂盒)的形式来进行示例，这并不意味着相关检测试剂本身必须以试剂盒的形式售卖，比如，也可以以单独的偶联产物形式售卖，比如仅以以下实施例中的r2试剂的形式售卖。
68.实施例1包被工艺的筛选及应用于胱抑素c试剂的性能验证
69.1.以胱抑素c项目为例进行包被工艺的筛选
70.主要原料信息如下：羧基胶乳微球购自bangs lab公司(货号pc02n-11148)，原液浓度为10％，胱抑素c多克隆抗体为dako公司生产(货号a0451)，活化剂edc和sulfo-nhs购自sigma公司(货号为e7750和56485)。
71.固定r1组分为：ph7.4 tris 12.1g/l，氯化钠15g/l，叠氮钠1.0g/l，peg6000 10g/l，吐温20 0.5ml/l，bsa 0.5g/l。
72.r2组分为：终浓度为0.25wt％的偶联有胱抑素c多克隆抗体的胶乳微球，活化缓冲液mes ph6.0、胶乳微球:edc:sulfo-nhs(质量比)10:0.5:0.5、偶联缓冲液硼砂ph8.2、胶乳微球偶联浓度1.5％、胶乳微球与抗体质量比20:1、储存缓冲液(ph7.4 tris 12.1g/l，氯化钠10g/l，叠氮钠1.0g/l，吐温20 0.5ml/l，bsa 1g/l)。
73.固定上述组分，根据下表方案进行试剂配制，并配制三个批次，将配得的试剂在新产业生物生产的仪器bc1200上进行检测，探究不同工艺对批间差的影响，表2和表3分别为针对已知浓度的标准品以及随机待测样本的浓度检测：
74.表1：
[0075][0076]
表2：
[0077]
[0078][0079]
表3：
[0080][0081]
[0082]
上述表2和表3结果表明，按照方案3的工艺配置的三批试剂的最稳定，批号2与批号3相对于批号1的检测偏差均控制到了5％以内。
[0083]
2.其他性能指标测试
[0084]
以方案3批号1试剂为例，验证胱抑素c试剂的性能。
[0085]
1)重复性：
[0086]
表4
[0087][0088]
针对两个样本重复检测10次，计算测量值的平均值(x)和标准差(sd)。按式(1)计算变异系数(cv)。测试结果见表4。根据测量结果，计算出变异系数cv分别为1.17％和0.81％。
[0089]
cv＝sd/平均值(1)
[0090]
式中：cv——变异系数；sd——标准差。
[0091]
2)线性：
[0092]
表5：
[0093]
[0094][0095]
设置浓度梯度进行线性验证，r2＝0.9998，结果表明该方案配制得到的试剂线性良好，且从上述线性的数据中看出本方案灵敏度较高，即能够测出0.10mg/l的目标分析物。
[0096]
3)准确度：
[0097]
针对一定浓度的参考物质的检测准确性如表6所示。
[0098]
表6：
[0099][0100]
4)hook效应见图1。
[0101]
图中的数值为吸光度(abs)随抗原浓度的变化关系。本发明提供的试剂在100mg/ml时不出现hook效应。
[0102]
5)稳定性：
[0103]
表7：
[0104]
[0105][0106]
针对试剂进行加热试验，验证其稳定性，结果如表7所示。
[0107]
6)样本比对测试结果见图2。
[0108]
与市售的性能参数较优的试剂盒进行比对，结果显示相关性良好。
[0109]
性能检测结果表明：使用方案3配制的胱抑素c试剂在稳定性、试剂精密度、线性、准确度、hook、效应等性能上均表现良好，由表2和表3的结果可知，使用本方案配制的三批试剂对不同样本进行检测，不同批检测结果的偏差可控制在5％以内，相较于传统试剂显著降低。
[0110]
实施例2α1-mg试剂的性能验证
[0111]
本实施例中，除特殊说明的原料和步骤外，其他原料和步骤均与实施例1相同，利用方案3的工艺进行3批试剂配制，除不同批次间的差异验证以外，其余试验均以批号1进行，在新产业生物生产的仪器bc1200上进行检测。其中，α1微球蛋白单克隆抗体为新产业生物自产(采用杂交瘤技术在实验室制备得到，为本领域常规手段)。
[0112]
测试结果如下：
[0113]
1)稳定性测试结果：
[0114]
表8：
[0115]
方案2-8℃37℃14天40℃7天标品浓度(mg/l)吸光度吸光度偏差吸光度偏差7.57.49-1.48％-3.39％1515.01-1.37％-1.75％3029.91-3.27％-0.25％6059.871.29％1.26％120120.32-1.26％1.55％
[0116]
针对试剂进行加热试验，验证其稳定性，结果如表8所示。
[0117]
2)与九强试剂的样本比对测试结果见图3。
[0118]
与市售的性能参数较优的试剂盒进行比对，结果显示相关性良好。
[0119]
3)重复性：
[0120]
表9：
[0121][0122]
针对两个样本重复检测10次，计算测量值的平均值(x)和标准差(sd)。按式(1)计算变异系数(cv)。测试结果见表7。根据测量结果，计算出变异系数cv＝0.83％和0.88％。
[0123]
cv＝sd/平均值(1)
[0124]
式中：cv——变异系数；sd——标准差。
[0125]
4)线性
[0126]
表10：
[0127][0128][0129]
设置浓度梯度进行线性验证，r2＝0.9987，结果表明该方案配制得到的试剂线性
良好，且从上述线性的数据中看出本方案灵敏度很高，即能够测出2mg/l的目标分析物。
[0130]
5)hook效应见图4。
[0131]
图中的数值为吸光度(abs)随抗原浓度的变化关系。本发明提供的试剂在1200mg/ml时不出现hook效应。
[0132]
6)针对3批试剂进行不同批次之间的差异验证。
[0133]
表11：对标准品检测的批次间的差异
[0134][0135]
表12：对待测样本检测的批次间的差异
[0136]
[0137][0138]
性能检测结果表明：使用本方案配制α1-mg用本方案试剂各项性能均良好，由表11和表12的结果可知，使用本方案配制的三批试剂对不同样本进行检测，不同批试剂的检测结果的偏差同样可控制在5％以内，相较于传统试剂显著降低。
[0139]
实施例3 aso试剂的性能验证
[0140]
本实施例中，除特殊说明的原料和步骤外，其他原料和步骤均与实施例1相同，利用方案3的工艺进行3批试剂配制，除不同批次间的差异验证以外，其余试验均以批号1进行，在新产业生物生产的仪器bc1200上进行检测。其中，aso蛋白由新产业生物公司生产((采用杂交瘤技术在实验室制备得到，为本领域常规手段)。
[0141]
测试结果如下：
[0142]
1)稳定性测试结果：
[0143]
表13
[0144]
[0145][0146]
针对试剂进行加热试验，验证其稳定性，结果如表13所示。
[0147]
2)与罗氏试剂进行样本比对，测试结果见图5。
[0148]
与市售的性能参数较优的试剂盒进行比对，结果显示相关性良好。
[0149]
3)重复性：
[0150]
表14
[0151][0152]
针对两个样本重复检测10次，计算测量值的平均值(x)和标准差(sd)。按式(1)计算变异系数(cv)。测试结果见表7。根据测量结果，计算出变异系数cv＝1.17％和0.81％。
[0153]
cv＝sd/平均值
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0154]
式中：cv——变异系数；sd——标准差。
[0155]
5)线性：
[0156]
表15
[0157][0158]
设置浓度梯度进行线性验证，r2＝0.9993，结果表明该方案配制得到的试剂线性良好，且从上述线性的数据中看出本方案灵敏度较高，即能够测出30iu/ml的目标分析物。
[0159]
6)hook效应：见图6。
[0160]
图中的数值为吸光度(abs)随抗原浓度的变化关系。本发明提供的试剂在20000iu/ml时不出现hook效应。
[0161]
3)制备3个批次，批间差结果。
[0162]
表16：针对标准品进行批次间差异检测
[0163]
[0164][0165]
表17：针对随机样本进行批次间差异检测
[0166][0167]
性能检测结果表明：使用本方案配制aso试剂性能良好，并且，由表16和表17的结果可知，使用本方案配制的三批试剂对不同样本进行检测，不同批试剂的检测结果的偏差同样可控制在5％以内，相较于传统试剂显著降低。
[0168]
实施例4工艺参数验证
[0169]
以实施例1的胱抑素试剂为例，继续探究其他工艺条件的对配制的试剂的参数影
响：
[0170]
同实施例1，固定其余参数，根据表4进行试剂配制，并对表4中的试剂进行对标准品的检测，验证其余方案对检测值的影响。
[0171]
表18：
[0172]
[0173][0174]
针对上述各方案配制的分别对不同浓度的(0.5mg/l，1mg/l，2mg/l)样本进行检测，并基于方案3检测得到的结果计算偏差，结果见下表：
[0175]
表19：
[0176]
[0177][0178]
以方案3浓度
±
5％(0浓度点除外)作为接受标准，以上结果显示以上条件下对微球和抗体偶联得到的成品试剂无明显影响，即在以上条件的范围内所配制的试剂检测结果都准确。
[0179]
因此，该偶联方案适用范围主要如下表：
[0180]
表20：
[0181]
活化缓冲液离子强度20mm～100mm活化缓冲液phph5.8～ph6.4微球活化浓度2％～8％微球：edc：sulfo-nhs10：(0.15～1)：(0.15～1)活化时间20min～60min偶联缓冲液种类硼砂缓冲液、磷酸盐缓冲液、hepes缓冲液、mops缓冲液偶联缓冲液离子强度20mm～100mm偶联缓冲液phph7.8～ph8.6微球偶联浓度1％～3％微球与抗体投料质量比40：1～2：1偶联时间1.5h～24h
[0182]
从以上的实施例可以看出，本技术的制备方案能够有效提高胶乳比浊试剂的配制效率，也能够更好的控制批间差。
[0183]
此外，本技术的工艺方法能够有效的应用到不同类型的项目中，既适用于微球偶联抗体的项目，也适用于微球偶联抗原的项目。配制的试剂稳定性良好，能够满足长周期使用的要求。
[0184]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种胶乳微球的包被方法，其特征在于，所述包被方法包括：采用混合活化剂对胶乳微球进行活化反应，得到活化微球；采用偶联缓冲液稀释所述活化微球和蛋白，分别得到稀释活化微球和稀释蛋白；将所述稀释活化微球与所述稀释蛋白进行偶联反应，得到偶联复合物；对所述偶联复合物依次进行封闭及储存处理，得到蛋白包被的胶乳微球溶液；其中，所述偶联缓冲液选自如下任意一种：硼砂缓冲液、磷酸盐缓冲液、hepes缓冲液及mops缓冲液；所述混合活化剂为edc和sulfo-nhs的混合溶液。2.根据权利要求1所述的包被方法，其特征在于，采用混合活化剂对胶乳微球进行活化反应，得到活化微球包括：将羧基胶乳微球置于活化缓冲液中，得到微球溶液；按所述羧基胶乳微球:所述edc:所述sulfo-nhs＝10:(0.15-1):(0.15-1)的质量比，优选地为10:(0.5-0.75):(0.5-0.75)，将所述微球溶液与所述混合活化剂混合后进行所述活化反应，不经离心，得到所述活化微球；优选地，所述微球溶液与所述混合活化剂混合后，所述羧基胶乳微球的终浓度为2％～8％(m/m)。3.根据权利要求2所述的包被方法，其特征在于，所述活化缓冲液为mes缓冲液，更优选所述mes缓冲液的离子强度为20～100mm，更优选所述mes缓冲液的ph为5.8-6.4；进一步优选活化缓冲液为50mm ph6.0的mes缓冲液。4.根据权利要求2所述的包被方法，其特征在于，在搅拌条件下进行所述活化反应，更优选搅拌的转速为100～500rpm；优选地，所述活化反应持续20～60min。5.根据权利要求1所述的包被方法，其特征在于，所述偶联缓冲液的离子强度为20mm～100mm，更优选所述偶联缓冲液的ph为7.8-8.6；进一步优选地，所述偶联缓冲液为65.5mm ph8.2的硼砂缓冲液。6.根据权利要求5所述的包被方法，其特征在于，所述稀释活化微球中，所述羧基胶乳微球的浓度为1％～4％(m/m)；优选地，按照所述羧基胶乳微球：所述蛋白的质量比＝(40-2):1的比例进行所述偶联反应，得到所述偶联复合物；优选地，所述羧基胶乳微球的偶联浓度为1％～3％；优选地，所述偶联反应持续的时间为1.5h～24h。7.根据权利要求1至6中任一项所述的包被方法，其特征在于，对所述偶联复合物依次进行封闭及储存处理，得到蛋白包被的胶乳微球溶液包括：在搅拌条件下，将所述偶联复合物与封闭缓冲液等体积混合以进行所述封闭，不经离心，得到封闭混合液，并向所述封闭混合液中添加储存缓冲液，得到所述蛋白包被的胶乳微球溶液；优选地，所述搅拌的转速为100-500rpm；优选地，所述封闭缓冲液为含1％bsa的所述储存缓冲液；优选地，所述封闭持续时间为0.5～1h；
优选地，所述储存缓冲液包括ph7.4 tris 12.1g/l、氯化钠10g/l、叠氮钠1.0g/l、吐温20 0.5ml/l及bsa 1g/l；优选地，所述蛋白包被的胶乳微球溶液中，所述蛋白包被的胶乳微球的终浓度为0.1％～0.5％。8.根据权利要求1所述的包被方法，其特征在于，所述蛋白为抗原或抗体；优选地，所述蛋白选自如下任意一种抗原或其抗体：半胱氨酸蛋白酶抑制剂c、α1微球蛋白及抗链球菌溶血素“o”。9.一种蛋白包被的胶乳微球试剂，其特征在于，所述蛋白包被的胶乳微球通过权利要求1-8中任一项所述的包被方法包被得到。10.根据权利要求9所述的蛋白包被的胶乳微球试剂，其特征在于，所述蛋白包被的胶乳微球试剂中含有如下任意一种或多种成分：edc降解产物、sulfo-nhs、mes以及所述偶联缓冲液中的相关组分。

技术总结

本发明提供了一种蛋白包被的胶乳微球试剂及包被方法。其中，该包被方法包括：采用混合活化剂对胶乳微球进行活化反应，得到活化微球；采用偶联缓冲液稀释活化微球和蛋白，分别得到稀释活化微球和稀释蛋白；将稀释活化微球与稀释蛋白进行偶联反应，得到偶联复合物；对偶联复合物依次进行封闭及储存处理，得到蛋白包被的胶乳微球溶液；其中，偶联缓冲液选自如下任意一种：硼砂缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液及MOPS缓冲液；混合活化剂为EDC和Sulfo-NHS的混合溶液。该方法解决了现有工艺制备的胶乳微球偶联抗体或抗原相关试剂放大生产后不稳定的问题。生产后不稳定的问题。生产后不稳定的问题。