重组链球菌及其构建方法与应用

1.本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种重组链球菌及其构建方法与应用。

背景技术：

2.猪圆环病毒ⅲ型(porcinecircovirus 3，pcv3)是圆环病毒科圆环病毒属的一种无囊膜、共价闭环单股负链dna病毒(ssdna)，是目前为止发现的所有动物病毒中最小的之一。2016年前，全球范围内仅发现pcv1和pcv2两个基因型。其中，pcv1被认为是猪肾细胞pk-15污染物，但不产生细胞病变效应，对猪无致病性。pcv2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(pmws)主要病原，与猪皮炎和肾病综合征(pdns)、猪呼吸道疾病综合征(prdc)、繁殖障碍、增生性坏死性肺炎(pnp)和肠炎等疾病密切相关，均为猪圆环病毒相关疾病 (pcvad)。2015年6月，美国北卡罗来纳州某商品化猪场暴发pdns疫情，与历史平均值相比，该猪场母猪死亡率升高10.2％、受孕率下降0.6％。患病母猪厌食、皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，所产胎儿(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有相似临床症状。palinski等借助新一代测序(ngs)技术，从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出一种新病毒，该病毒与圆环病毒科病毒具有类似基因组结构和遗传相似性，但与其他圆环病毒衣壳蛋白氨基酸序列同源性低于70％，根据国际病毒分类委员会(ictv)圆环病毒分类标准，将其归类为一种新型圆环病毒，命名为pcv3。2017年，我国首次报道检测出pcv3，华中农业大学对采自我国11个省市35个猪场的222个样本进行了pcv3的检测，pcv3感染猪场阳性率高达68.6％(24/35)，说明现pcv3已普遍存在我国猪场。
3.pcv3基因全长为2000bp，含有3个主要开放阅读框(orf)，orf1编码病毒复制相关蛋白(rep)，含有279个氨基酸(aa)，orf2编码由214个aa 组成衣壳蛋白cap，orf3编码是一个由231个aa组成的功能未知蛋白质。cap 蛋白是病毒的免疫保护性抗原，宿主细胞含有与其结合的受体，与病毒的感染密切相关，含有病毒诱导机体产生特异性免疫应答的主要抗原表位。pcv2与 pcv3 cap蛋白aa同源性仅为30％，两者间存在交叉免疫保护可能性较低。因此，该蛋白是研制pcv3相关疫苗的焦点和检测pcv3特异性免疫反应的血清学诊断方法的靶抗原。
4.现已证实，pcv3对不同品种不同阶段的猪都具有易感性，但对断乳仔猪易感性较高，并表现出明显的临床症状。pcv3感染可导致免疫抵抗力下降和免疫抑制，猪只机体难以产生和维持对其他病原体的免疫抗体，从而继发其他疾病。研究揭示了多种与pcv3感染猪相关的并发感染病原体，猪链球菌就是其中之一。目前pcv3已在世界范围内广泛流行。pcv3并非一种新发病，在很早以前就已存在，由于其临床症状与pcv2相似，并且与pcv2混合感染率较高，人们忽视了它的存在，且pcv3与pcv2cap蛋白差异较大，现有的 pcv2疫苗对pcv3不产生交叉性免疫，目前尚没有有效的疫苗预防pcv3。因此，高效廉价的疫苗研发成为必要，增强免疫效果和降低经济损失。
5.猪链球菌病是由多种致病性链球菌感染引起的一种人兽共患病，有重要的公共卫生意义，同时也是当今危害养猪业最重要的细菌性疾病之一。猪链球菌菌体的细胞壁外包
围有一层由透明质酸组成的荚膜多糖(cps)。其被认为是细菌逃避宿主防御的毒力因子，是猪链球菌致病过程中的一个重要毒力因子。组成荚膜多糖的主要成分是透明质酸(ha)，ha是由尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡糖(udp-clcnac)和尿苷二磷酸-葡糖醛酸(udp-glca)合成而来，在细胞浆膜的膜内壁合成，生成的多糖链伸出细胞外。其合成方式为在合成酶的作用下，多糖链的还原末端所连的udp释放，交替连接上udp-glcnac或udp-glca来进行ha的合成。在链球菌中，含有三个涉及ha合成基因的操纵子(operon)，这三个基因分别被命名为hasa、hasb、hasc。猪链球菌透明质酸荚膜多糖形成过程中所需要的酶均由has基因家族决定。hasa负责编码透明质酸合成酶，hasb 负责编码udp-葡萄糖脱氢酶，而hasc则负责编码udp-葡萄糖焦磷酸化酶。
6.猪败血性链球菌st
171
属于c链球菌。1978年，甄辑铭等选用广东省斗门县分离的猪链球菌斗门系强毒菌种采用高温诱变培育法进行诱变，共经过 171代诱变最终育成st
171
弱毒菌种，经过安全性、免疫效力等试验证明其对猪已失去致病力，且具有良好的免疫原性和保护力。st
171
株弱毒活疫苗经过多年的应用证实，该疫苗免疫原性好，使用安全。至今，st
171
仍为目前市面上的猪链球菌细菌弱毒活疫苗制备的专用菌株之一。

技术实现要素：

7.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种重组链球菌及其构建方法与应用。
8.为了解决上述技术问题，本发明提供了用于敲除猪败血性链球菌中hasb 基因的引物，其核苷酸序列如seq id no.1～4所示。
9.本发明还提供了用于敲除猪败血性链球菌中hasb基因的质粒的构建方法，其包括：
10.提取猪败血性链球菌的基因组dna，采用如权利要求1所述的引物扩增 hasb上下同源臂片段；
11.将hasb上下同源臂片段连接至载体pg
+
host5中，即得到pg
+
host5δhasb 质粒。
12.本发明还提供了敲除hasb基因的猪败血性链球菌的构建方法，其包括采用如上述的构建方法所构建的质粒转染猪败血性链球菌。
13.本发明还提供了一种重组链球菌的构建方法，其包括：
14.构建敲除hasb基因的猪败血性链球菌；
15.构建包含有敲除hasb基因的猪败血性链球菌中szp基因上下同源臂片段和猪圆环病毒3型的cap蛋白的编码序列的重组载体；
16.将所述重组载体转化至所述敲除hasb基因的猪败血性链球菌中进行同源重组。
17.作为上述技术方案的改进，所述猪败血性链球菌为st
171
弱毒菌株。
18.作为上述技术方案的改进，所述猪圆环病毒3型的cap蛋白的编码序列如 seq id no.5所示。
19.作为上述技术方案的改进，所述构建包含有敲除hasb基因的猪败血性链球菌中szp基因上下同源臂片段和猪圆环病毒3型的cap蛋白的编码序列的重组载体的步骤包括：
20.提供/提取猪圆环病毒3型的基因组dna，采用核苷酸序列如seq id no. 6～7的引物扩增cap片段；
21.提取猪败血性链球菌的基因组dna，采用核苷酸序列如seq id no.8～11 所示的引物扩增szp上下同源臂片段；
22.将cap片段和szp上下同源臂片段连接至载体pg
+
host5中，得到 pg
+
host5-szp-cap重组载体。
23.作为上述技术方案的改进，所述将所述重组载体转化至所述敲除hasb基因的猪败血性链球菌中进行同源重组的步骤包括：
24.将pg
+
host5-szp-cap重组载体电转入敲除hasb基因的猪败血性链球菌中进行同源重组；
25.通过温度和抗性筛选得到st
171
δhasb-cap/pcv3重组链球菌；
26.采用核苷酸序列如seq id no.12～13的引物进行鉴定。
27.本发明还提供了一种重组链球菌，其特征在于，其由如上述的构建方法构建。
28.本发明还提供了一种质粒，其由上述的构建方法构建。
29.本发明还提供了一种猪败血性链球菌，其由上述的构建方法构建。
30.本发明还提供了一种重组载体，其为上述的pg
+
host5-szp-cap重组载体。
31.本发明还提供了上述的重组链球菌在(1)～(5)任一项中的应用；
32.(1)猪败血性链球菌减毒疫苗；
33.(2)猪败血性链球菌灭活疫苗；
34.(3)猪圆环病毒3型活载体疫苗；
35.(4)猪败血性链球菌和猪圆环病毒3型二联疫苗；
36.(5)免疫猪圆环病毒3型和/或链球菌的药物。
37.本发明还提供了上述的引物在(1)～(5)任一项中的应用；
38.(1)猪败血性链球菌减毒疫苗；
39.(2)猪败血性链球菌灭活疫苗；
40.(3)猪圆环病毒3型活载体疫苗；
41.(4)猪败血性链球菌和猪圆环病毒3型二联疫苗；
42.(5)免疫猪圆环病毒3型和/或链球菌的药物。
43.本发明还提供了上述的质粒在(1)～(5)任一项中的应用；
44.(1)猪败血性链球菌减毒疫苗；
45.(2)猪败血性链球菌灭活疫苗；
46.(3)猪圆环病毒3型活载体疫苗；
47.(4)猪败血性链球菌和猪圆环病毒3型二联疫苗；
48.(5)免疫猪圆环病毒3型和/或链球菌的药物。
49.本发明还提供了上述的猪败血性链球菌在(1)～(5)任一项中的应用；
50.(1)猪败血性链球菌减毒疫苗；
51.(2)猪败血性链球菌灭活疫苗；
52.(3)猪圆环病毒3型活载体疫苗；
53.(4)猪败血性链球菌和猪圆环病毒3型二联疫苗；
54.(5)免疫猪圆环病毒3型和/或链球菌的药物。
55.本发明还提供了上述的重组载体在(1)～(5)任一项中的应用；
56.(1)猪败血性链球菌减毒疫苗；
57.(2)猪败血性链球菌灭活疫苗；
58.(3)猪圆环病毒3型活载体疫苗；
59.(4)猪败血性链球菌和猪圆环病毒3型二联疫苗；
60.(5)免疫猪圆环病毒3型和/或链球菌的药物。
61.实施本发明，具有如下有益效果：
62.本发明采用同源重组技术敲除猪败血性链球菌弱毒株st
171
的hasb基因，降低菌株毒力，以st
171
δhasb作为细菌活载体，把pcv3的cap基因插入st
171
δhasb 的szp基因中制成重组活载体疫苗。该疫苗毒力小，生产成本较低，而且能同时预防pcv3和链球菌的感染。
附图说明
63.图1为本发明实施例1提供的构建重组链球菌的流程示意图。
64.图2为本发明实施例1提供的敲除基因载体pg
+
host5δhasb的构建结果；其中 a为敲除载体的构建策略，b为敲除载体的酶切鉴定结果。
65.图3为本发明实施例1提供的敲除菌株st
171
δhasb的构建策略示意图。
66.图4为本发明实施例1提供的敲除菌株st
171
δhasb的鉴定结果。
67.图5为本发明实施例1提供的敲除菌株st
171
δhasb的电镜观察结果，其中a为敲除菌株st
171
δhasb透射电镜(100000
×
，60kv)，b为亲本菌株st
171
透射电镜 (100000
×
，60kv)。
68.图6本发明实施例1提供的重组基因载体pg
+
host5δhasb-cap/pcv3的构建结果；其中a为重组载体的构建策略，b为重组载体的酶切鉴定结果。
69.图7为本发明实施例1提供的重组菌株st
171
δhasb-cap/pcv3的构建策略示意图。
70.图8为本发明实施例1提供的重组菌株st
171
δhasb-cap/pcv3的鉴定结果。
71.图9为本发明实施例1提供的重组菌株st
171
δhasb-cap/pcv3荧光定量pcr 检测基因转录水平的结果。
72.图10为本发明实施例1提供的重组菌株st
171
δhasb-cap/pcv3液相谱电离串联质谱分析结果。
73.图11为本发明实施例1提供的重组菌株st
171
δhasb-cap/pcv3的pcv3特异性抗体检测结果。
74.图12为本发明实施例1提供的链球菌感染后小鼠存活曲线示意图。
具体实施方式
75.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
76.实施例1
77.本实施例提供一种构建重组链球菌的方法，构建思路如图1所示，具体包括如下流程：
78.1、引物设计与合成
79.本试验所用引物(表1)均使用primer 5设计，并于上海生工生物工程股份有限公
司合成。具体引物信息如下：根据ncbi网站所公布的sez atcc 35246 株基因序列(genbank登录号：cp002904)设计引物hasbl1、hasbl2用于扩增 hasb基因同源臂上臂片段；hasbl3、hasbl4用于扩增hasb基因同源臂下臂片段；hasb1、hasb2用于hasb基因验证；s1、s2用于扩增szp同源臂上臂片段；s3、 s4用于扩增szp同源臂下臂片段；设计m1、m2引物用于鉴定重组菌株。根据 pcv3 vrl 13-aug-2018株基因序列(genbank登录号：nc_031753.1)设计引物s-pcv-1、s-pcv-2用于扩增cap片段，设计引物pcv-s-1、pcv-s-2用于pcr 鉴定cap基因。
80.表1引物序列表
[0081][0082]
2、基因敲除质粒pg
+
host5δhasb的构建
[0083]
提取猪败血性链球菌st
171
的基因组dna，分别使用hasbl1、hasbl2与 hasbl3、hasbl4用于扩增hasb基因同源臂上下臂片段，使用以上片段酶切位点对应的酶将hasb上下同源臂片段酶切连接至链球菌温敏自杀型穿梭载体 pg
+
host5中，获得敲除基因载体pg
+
host5δhasb。
[0084]
图2为本发明实施例1提供的敲除基因载体pg
+
host5δhasb的构建结果；其中 a为敲除载体的构建策略，b为敲除载体的酶切鉴定结果。
[0085]
3、基因敲除菌株st
171
δhasb-cap/pcv3的构建
[0086]
将构建好的敲除基因载体pg
+
host5δhasb电转化转入链球菌感受态st
171
中，使用5mm电转杯，电转参数为：电压2.5kv,电容25μfd，脉冲电阻500ω。将电转后的产物转移至1.5ml ep管中，28℃摇床培养2h后，涂布于含有红霉素的tsa平板上，28℃培养36h至单菌落出现。挑取单菌落在37℃进行第一次同源重组。之后再选取单菌落连续传代5代后筛选出红霉素敏感菌株。将筛选出的红霉素敏感菌株提取dna进行pcr验证，并送往生工测序。
[0087]
图3为敲除菌株st
171
δhasb的构建策略示意图。图4为敲除菌株st
171
δhasb 的鉴
定结果。
[0088]
4、敲除菌株st
171
δhasb透射电镜观察
[0089]
取对数生长期的st
171
亲本菌株和st
171
δhasb基因敲除菌株用2.5％戊二醛固定2h以上。用0.1m磷酸漂洗液三次每次15min，1％锇酸固定液固定2-3h，再用0.1m磷酸漂洗液三次每次15min；分别用50％、70％、90％乙醇脱水15-20min； 90％乙醇90％丙酮(1：1)4℃作用15-20min，90％丙酮4℃作用15-20min，100％丙酮室温作用15-20min；浸透后的菌团包埋于胶囊的纯树脂中，70℃处理12h 以聚合；随后置于37℃烘箱内过夜，45℃烘箱内12h，60℃烘箱内48h以固化；用leica uc 7超薄切片机成60nm超薄片后用醋酸双氧铀-柠檬酸铅染，最后置于hitachi日立h-7600透射电子显微镜中，拍片。
[0090]
图5为敲除菌株st
171
δhasb的电镜观察结果，其中a为敲除菌株st
171
δhasb 透射电镜(100000
×
，60kv)，b为亲本菌株st
171
透射电镜(100000
×
，60kv)。
[0091]
5、敲除菌株st
171
δhasb小鼠半数致死量测定
[0092]
分别挑取st
171
亲本菌株和hasb基因缺失突变株st
171
δhasb单菌落，接种于含5％犊牛血清tsb培养基中震荡培养12h。细菌计数后，pbs洗一遍,分别作梯度稀释至10-9
cfu/ml、10-8
cfu/ml、10-7
cfu/ml、10-6
cfu/ml，小鼠腹腔分别接种500μl，观察小鼠临床变化以测定st
171
亲本菌株和hasb基因缺失突变株 st
171
δhasb的半数致死量。半数致死量的计算采用改良寇氏法(karber氏法) 进行，计算公式为ld
50
＝log-1
[xm-i(∑p-0.5)]。
[0093]
表2为猪败血性链球菌弱毒株st
171
和基因缺失突变株st
171
δhasb的半数致死量测定结果。根据公式计算得出，ld
50
(st
171
)＝2.00
×
107，ld
50
(st
171
δhasb) ＝6.225
×
107。基因缺失突变株st
171
δhasb的毒力相对于st
171
较小。
[0094]
表2 st
171
与st
171
δhasb感染小鼠半数致死量测定
[0095][0096]
6、同源重组载体pg+host5-szp-cap的构建
[0097]
从猪圆环阳性猪的脾脏中提取dna，使用s-pcv-1、s-pcv-2引物扩增获得 cap片段；从st
171
中提取dna，分别使用s1、s2与s3、s4引物扩增获得szp上下同源臂片段。使用以上
片段酶切位点对应的酶将szp上下同源臂片段与cap片段酶切连接至链球菌温敏自杀型穿梭载体pg
+
host5中，获得同源重组载体 pg
+
host5-szp-cap。
[0098]
图6为同源重组载体pg
+
host5-szp-cap的构建结果，其中a为重组载体的构建策略，b为重组载体的酶切鉴定结果。
[0099]
7、重组菌株st
171
δhasb-cap/pcv3的构建
[0100]
将构建的同源重组载体pg
+
host5-szp-cap电转入链球菌感受态st
171
δhasb 中，使用5mm电转杯，电转参数为：电压2.5kv,电容25ufd，脉冲电阻500ω。将电转后的产物转移至1.5ml ep管中，28℃摇床培养2h后，涂布于含有红霉素的tsa平板上，28℃培养36h至单菌落出现。挑取单菌落在37℃进行第一次同源重组。之后再选取单菌落连续传代4代后筛选出红霉素敏感菌株。将筛选出的红霉素敏感菌株提取dna进行pcr验证，并送往生工测序。
[0101]
图7为重组菌株st
171
δhasb-cap/pcv3的构建策略示意图。图8为重组菌株 st
171
δhasb-cap/pcv3双交换的鉴定结果。
[0102]
8、qrt-pcr检验重组菌株cap基因转录水平
[0103]
使用传统法抽提重组菌株st
171
δhasb-cap/pcv3和亲本菌株st
171
δhasb的 rna。按照promega公司的dnase i试剂盒与反转录试剂盒对此次提取的细菌 rna进行处理。使用takara公司的荧光定量试剂与罗氏lightcycler480荧光定量 pcr仪对突变菌株的cap基因与亲本菌株的szp基因转录水平进行荧光定量pcr 分析。定量pcr体系为：tb green,10μl；上下游引物，各1μl；cdna，2μl；ddh2o，6μl；反应程序为95℃预变性30s；95℃变性5s、60℃退火30s、72℃延伸45s，40个循环。
[0104]
图9为荧光定量pcr检测基因转录水平的结果，可以看出，szp和cap都在重组菌株st
171
δhasb-cap/pcv3中顺利表达。
[0105]
9、液相谱电离串联质谱技术对重组菌株cap蛋白进行鉴定
[0106]
挑取突变菌株的单菌落，接种于含5％犊牛血清tsb培养基中震荡培养12h，菌液转入5ml离心管中4℃，6000rpm离心10min，弃上清后称量菌体湿重，按每0.1g菌体加入500μl pbs重悬菌体，加入5
×
loading buffer，置于100℃水浴锅煮10min。样品加入sds-page凝胶后进行电泳，电泳结束后进行考马斯亮蓝染和脱，切胶取16.8kda附近的蛋白条带送往中科新生命公司进行液相谱电离串联质谱分析。
[0107]
图10为液相谱电离串联质谱分析结果，可以看出质谱图中重组菌株 st
171
δhasb-cap/pcv3含有pcv3 cap蛋白的肽段，表明重组菌株中含有pcv3 cap蛋白，即重组菌株成功表达出pcv3抗原蛋白。
[0108]
10、重组菌株st
171
δhasb-cap/pcv3小鼠半数致死量测定
[0109]
分别挑取亲本菌株和突变菌株的单菌落，接种于含5％犊牛血清tsb培养基中震荡培养12h。细菌计数后，无菌pbs洗涤一遍，将菌液分别调整至10
9 cfu/ml、108cfu/ml、107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml，小鼠腹腔分别接种500μl，观察小鼠临床变化以测定突变菌株和亲本菌株的半数致死量。半数致死量的计算分析采用改良寇式法(karber氏法)进行，计算公式为ld
50
＝log-1[xm-i(σp-0.5)]。
[0110]
表3为猪败血性链球菌弱毒株st
171
和重组菌株st
171
δhasb-cap/pcv3的半数致死量测定结果。根据公式计算得出，ld
50
(st
171
δhasb)＝6.225
×
107，ld
50 (st
171
δhasb-cap/pcv3)＝3.27
×
107。基因重组菌株的毒力与亲本菌株差异不大。
[0111]
表3 st
171
与st
171-cap/pcv3感染小鼠半数致死量测定
[0112][0113]
11、elisa检验重组菌株诱导的抗体水平
[0114]
将6周龄的雌balb/c小鼠随机分为3组，每组6只。将突变菌株用无菌pbs 调整为2
×
106cfu/ml，通过腹腔注射免疫第一组小鼠，14天后相同步骤加强免疫，每次免疫剂量为500μl。第二组小鼠接种相同剂量的亲本菌株作为阴性对照，第三组接种无菌pbs作为空白对照，免疫程序同第一组。分别对二免后14 天的所有小鼠进行断尾采血并分离血清，使用猪圆环病毒3型抗体检测试剂盒检测pcv3 cap抗原特异性抗体水平。
[0115]
图11为pcv3特异性抗体检测结果，由图中可以看出重组菌株 st
171
δhasb-cap/pcv3在接种后产生的pcv3特异性抗体水平要显著高于阴性对照。
[0116]
12、链球菌感染小鼠试验
[0117]
将6周龄雌性balb/c小鼠随机分3组，每组6只。分别免疫接种重组菌株、亲本菌株和pbs与，免疫程序同7免疫程序。二次免疫14d后接种1
×
106cfu的马链球菌兽疫亚种野毒株c55138，观察小鼠死亡状况。
[0118]
图12为小鼠存活曲线示意图，从图中可以看出，重组菌株 st
171
δhasb-cap/pcv3可以对小鼠产生有效保护。
[0119]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：

1.用于敲除猪败血性链球菌中hasb基因的引物，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1～4所示。2.用于敲除猪败血性链球菌中hasb基因的质粒的构建方法，其特征在于，包括：提取猪败血性链球菌的基因组dna，采用如权利要求1所述的引物扩增hasb上下同源臂片段；将hasb上下同源臂片段连接至载体pg
+
host5中，即得到pg
+
host5δhasb质粒。3.敲除hasb基因的猪败血性链球菌的构建方法，其特征在于，包括采用如权利要求2所述的构建方法所构建的质粒转染猪败血性链球菌。4.一种重组链球菌的构建方法，其特征在于，包括：构建敲除hasb基因的猪败血性链球菌；构建包含有敲除hasb基因的猪败血性链球菌中szp基因上下同源臂片段和猪圆环病毒3型的cap蛋白的编码序列的重组载体；将所述重组载体转化至所述敲除hasb基因的猪败血性链球菌中进行同源重组。5.如权利要求2、3或4所述的构建方法，其特征在于，所述猪败血性链球菌为st
171
弱毒菌株。6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述猪圆环病毒3型的cap蛋白的编码序列如seq id no.5所示。7.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述构建包含有敲除hasb基因的猪败血性链球菌中szp基因上下同源臂片段和猪圆环病毒3型的cap蛋白的编码序列的重组载体的步骤包括：提供/提取猪圆环病毒3型的基因组dna，采用核苷酸序列如seq id no.6～7的引物扩增cap片段；提取猪败血性链球菌的基因组dna，采用核苷酸序列如seq id no.8～11所示的引物扩增szp上下同源臂片段；将cap片段和szp上下同源臂片段连接至载体pg
+
host5中，得到pg
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host5-szp-cap重组载体。8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述将所述重组载体转化至所述敲除hasb基因的猪败血性链球菌中进行同源重组的步骤包括：将pg
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host5-szp-cap重组载体电转入敲除hasb基因的猪败血性链球菌中进行同源重组；通过温度和抗性筛选得到st
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δhasb-cap/pcv3重组链球菌；采用核苷酸序列如seq id no.12～13的引物进行鉴定。9.重组链球菌，其特征在于，其由如权利要求4～8任一项所述的构建方法构建。10.质粒，其特征在于，其由如权利要求2或4所述的构建方法构建。

技术总结

本发明公开了一种重组链球菌及其构建方法与应用，涉及基因编辑技术领域。本发明采用同源重组技术敲除了猪败血性链球菌弱毒株ST

技术研发人员：

付强 夏怡 徐建琦 赵贤杰 郭健锋 林梓华 胡俊冶

受保护的技术使用者：

佛山科学技术学院

技术研发日：

2022.05.20

技术公布日：

2022/12/1