肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用与一种检测试剂盒和检测系统的制作方法

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1.本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用与一种检测试剂盒和检测系统。

背景技术：

2.自闭症(autism)，又称孤独症或孤独性障碍(autistic disorder)等，是广泛性发育障碍(pervasive developmental disorder，pdd)的代表性疾病。《dsm-iv-tr》将pdd分为5种：孤独性障碍、retts综合症、童年瓦解性障碍、阿斯伯格综合症和未特定的pdd。其中，孤独性障碍与阿斯伯格综合症较为常见。
3.自闭症分为真性自闭症和假性自闭症。真性自闭症(器质性自闭症)是患者由于基因突变造成大脑思维功能缺失，失去或严重缺失思维功能。他们的面相与常人无异，但其先天缺失总结、归纳、分析、判断等逻辑思维能力，终身智力低下。假性自闭症(功能性自闭症)是指患儿大脑思维区域无器质性病变，具有正常的思维能力，但是他们智力的缺失是由于后天某项能力的发展不平衡。假性自闭症与真性自闭症存在本质的区别。真性自闭症是由基因突变所致，根据演算所得全球人类真性自闭症比例应该接近十五万分之一。真性自闭症是应该属于罕见疾病。目前没有有效的康复办法。假性自闭症是由于影响人类学习能力中的几项能力要素发展不均衡。即某项能力极弱或某项能力过强，致使患儿有可能丧失部分或全部的思维能力，造成终身智力缺陷，表现出真性自闭症的特质。
4.20世纪80年代，关于孤独症的研究进入全新阶段。人们开始抛弃所谓“父母抚养方式不当”的病因假说，从生物学领域探索孤独症的病因，并在临床症状的识别和临床诊断方面将孤独症与精神分裂症彻底分开。kolvin的研究表明，孤独症同成年精神病性障碍，尤其是成年精神分裂症没有关系。1980年出版的《dsm
‑ⅲ
》首次将童年孤独症视为一种广泛性发育障碍。之后，随着对孤独症研究的深入，逐步认识到孤独症是一种在一定遗传因素作用下，受多种环境因子刺激导致的弥漫性中枢神经系统发育障碍性疾病。在此认识的基础上，开展了从分子遗传到神经免疫、功能影像、神经解剖和神经化学等多方面的研究，人们试图从这些研究中到孤独症的致病原因。
5.由于目前仍没有任何一种假说能从根本上完美地解释孤独症的病因，因此自闭症的风险筛查、诊断、都没有很好的方法。
6.基于此提出本发明。

技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用与一种检测试剂盒和检测系统。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
9.本发明提供了肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用，所述肠
道菌标志物为：编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因。
10.作为优选，所述编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因的kegg id为k01710。
11.作为优选，所述肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用是通过检测肠道菌标志物在粪便样本中的丰度进行判断。
12.本发明还提供了一种自闭症风险筛查试剂盒，所述自闭症风险筛查试剂盒中包括用于检测所述肠道菌标志物的试剂。
13.作为优选，所述用于检测所述肠道菌标志物的试剂包括dna提取试剂、宏基因组建库和测序试剂。
14.作为优选，所述dna提取试剂为ctab法提取dna的试剂；
15.所述宏基因组建库和测序的试剂为illuminanovaseq6000高通量测序平台的建库和测序试剂。
16.本发明还提供了一种自闭症风险筛查系统，所述自闭症风险筛查系统包括检测所述肠道菌标志物的装置以及分析装置。
17.作为优选，所述检测肠道菌标志物的装置包括dna提取单元、宏基因组建库和测序单元、基因丰度检测单元。
18.作为优选，所述分析装置为统计软件；
19.所述统计软件为spss统计软件。
20.本发明提供了肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用与一种检测试剂盒和检测系统。
21.本发明首次发现自闭症的致病与肠道菌编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因的丰度有关，因此将肠道菌编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因作为自闭症的检测标志物。本发明的标志物能够有效的用于诊断和非诊断目的的自闭症风险筛查患者。利用待测生物样本与健康样本进行肠道菌编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因丰度的检测，根据丰度差异结果判断待测样本是否易患自闭症。该肠道菌编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因kegg id为k01710基因。利用该方法可以得到准确、可靠、重复性好的结果。为自闭症的诊断提供科学的依据，不仅可以为自闭症的发病提供有效的预警，而且可对其进行确诊，克服了自闭症的诊断较大程度的依赖于主观经验判断的缺陷，极大提高了诊断准确率。
附图说明
22.图1为roc曲线图(横坐标表示特异性，纵坐标表示敏感性)。
具体实施方式
23.本发明提供了肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用，所述肠道菌标志物为：编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因。
24.在本发明中，编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因为rfbb、rmlb和rffg中的一种或几种。
25.在本发明中，所述编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因的kegg id为
k01710。
26.在本发明中，所述肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用是通过检测肠道菌标志物在粪便样本中的丰度进行判断。
27.在本发明中，所述检测肠道菌标志物在粪便样本中的丰度的方法为：提取粪便样本中的dna，之后对提取得到的dna进行宏基因组建库和测序，获得宏基因组测序数据，对宏基因组测序数据进行丰度分析，根据丰度分析结果判断自闭症患病几率；所述提取粪便样本中的dna的方法为ctab法；所述宏基因组建库和测序的方法为illumina novaseq6000高通量测序平台的建库和测序；所述粪便样本为健康人的粪便样本和自闭症人的粪便样本；所述根据丰度分析结果判断自闭症患病几率是根据健康人和自闭症人粪便样本中肠道菌标志物的丰度的差异进行判断的，当自闭症人粪便样本中肠道菌标志物kegg id为k01710的基因的丰度与健康人该标志物的丰度相比具有显著差异时，说明该人为易患自闭症的人。显著差异为通过分析软件分析后p《0.05表示差异显著。
28.本发明还提供了一种自闭症风险筛查试剂盒，所述自闭症风险筛查试剂盒中包括用于检测所述肠道菌标志物的试剂。
29.在本发明中，所述用于检测所述肠道菌标志物的试剂包括dna提取试剂、宏基因组建库和测序试剂。
30.在本发明中，所述dna提取试剂为ctab法提取核酸的试剂；
31.所述宏基因组建库和测序的试剂为illuminanovaseq6000高通量测序平台的建库和测序试剂。
32.本发明还提供了一种自闭症风险筛查系统，所述自闭症风险筛查系统包括检测所述肠道菌标志物的装置以及分析装置。
33.在本发明中，所述检测肠道菌标志物的装置包括dna提取单元、宏基因组建库和测序单元、基因丰度检测单元。
34.在本发明中，所述分析装置为统计软件；
35.所述统计软件为spss统计软件。
36.在本发明中，术语“生物标志物”应做广义理解，其包括任何能够反映异常状态的任何可检测生物指标，可以包含基因标志物，物种标志物(种标志物/属标志物)以及功能标志物(ko/og标志物)，其具有非常广泛的用途，可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人中的安全性及有效性。
37.肠道菌标志物在粪便样本中的丰度表示：编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因在粪便样本中的丰度，即指粪便样本中所含的各肠道菌编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因的含量。
38.宏基因组学(metagenomics)，是一种直接对微生物体中包含的全部基因组信息进行研究的手段。利用新一代测序技术(next generation sequencing)研究metagenomics，能快速准确的得到大量微生物基因数据和丰富的微生物研究信息，从而成为研究微生物多样性和落特征的重要手段。
39.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
40.除了我们耳熟能详的人体dna，其实还有另外一套基因组一直“潜藏”在我们体内，
伴随我们的终生，这就是肠道微生物菌。它所编码的基因有100万个以上。两套基因组相互协调、和谐一致，保证了人体的健康。为了评估肠道微生物菌基因结构能否作为自闭症的预测因子，本发明通过收集自闭症患者和健康人的样本，进行宏基因组测序，并对测序数据进行统计分析，发现与疾病相关的肠道菌的功能蛋白的基因，将肠道菌功能蛋白基因的丰度与疾病信息整合，最大程度预测自闭症患者。本发明通过宏基因组测序，首次发现了肠道菌中kegg id为k01710的基因(网址为：https://www.genome.jp/entry/k01710)的丰度与自闭症患者的相关性，自闭症组k01710的基因的丰度明显低于对照组，说明肠道菌中kegg id为k01710的基因的丰度可作为自闭症的预测因子。所述对照组为健康人。
41.实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件进行设置的。
42.实施例1
43.筛选与自闭症相关的肠道菌功能蛋白基因。
44.1、研究对象和样本收集
45.1.1研究对象
46.自闭症组纳入标准：诊断为自闭症的患者。排除标准：
①
患有其他精神疾病(如精神分裂症)和其他神经发育障碍疾病；
②
患有遗传代谢性疾病；
③
患有严重神经疾病以及颅脑损伤史等重大躯体疾病史；
④
近1个月内有胃肠道感染病史或抗生素使用史。
47.对照组纳入标准：
①
无精神疾病，身体健康；
②
与患者组年龄及性别匹配。排除标准同患者组。
48.本研究分两期，第一期为发现阶段，自闭症组共收集8例患儿，男6例，女2例；年龄4～7岁。对照组共收集8名儿童，男6名，女2名；年龄0～9岁。第二期为验证阶段，自闭症组共收集22例患儿，男18例，女4例；年龄3～7岁。共收集21名对照儿童，男11名，女10名；年龄2～9岁。
49.2、宏基因组测序
50.2.1.dna提取
51.使用基因组dna提取试剂盒自各组粪便样本中提取基因组dna，操作步骤按说明书进行。dna提取试剂盒的提取方法为ctab法。
52.2.2.dna样本纯度及浓度测定
53.利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna。
54.2.3.文库构建及库检
55.dna样品检测合格后，使用covaris超声波破碎仪随机打断，再经末端修复、加a尾、加测序接头、纯化、pcr扩增等步骤完成整个文库制备工作。文库构建完成后，先使用qubit 2.0进行初步定量，稀释文库，随后使用agilent 2100对文库的插入片段进行检测，插入片段大小符合预期后，使用q-pcr方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。
56.2.4.上机测序
57.文库检测合格后，按照有效浓度及目标下机数据量的需求将不同文库pooling至flowcell，cbot成簇后使用illuminanovaseq6000高通量测序平台进行测序。
58.3、数据分析
59.3.1.获取菌功能蛋白基因丰度信息
60.1)使用humann2软件，将质控和去宿主之后的序列与蛋白质数据库(uniref90)进
行比对；
61.2)过滤掉比对失败的reads；
62.3)统计uniref90各个蛋白的相对丰度。
63.4)根据uniref90的id和各个功能数据库(kegg、metacyc、eggnog、go、ec、cazy)id的对应关系(主要来自linkdb)，统计各个功能数据库对应功能相对丰度。
64.5)从各个数据库功能的相对丰度表出发，进行相对丰度柱形图展示，circos图展示，丰度聚类热图展示，组间功能差异lefse分析，组间功能差异pair-wise多重比较dunntest分析，显著差异功能物种来源柱形图分析，kegg通路图填，功能与环境因子(或者其它组学数据)的相关性分析。
65.3.2.肠道菌功能蛋白基因组间差异性分析
66.使用spss等统计软件进行组间肠道菌功能蛋白基因丰度的差异性分析，出对照组与自闭症具有显著差异性的功能蛋白基因；同时使用spss统计软件的roc曲线图工具绘制roc曲线并计算其auc面积。
67.4、结果
68.4.1发现阶段
69.从第一期的发现阶段，发现肠道菌kegg id为k01710的基因的丰度能显著区分自闭症患者和正常对照。结果如表1～2所示。
70.表1自闭症组与对照组k01710基因丰度显著性差异分析
[0071][0072]
表2自闭症组与对照组k01710基因丰度差异分析结果
[0073][0074]
表1显示，自闭症组与对照组相比k01710基因的丰度差异显著。
[0075]
表2显示，自闭症组与对照组相比k01710基因的丰度显著下降。
[0076]
4.2验证阶段
[0077]
从第二期的验证阶段，也发现肠道菌kegg id为k01710的基因的丰度能显著区分自闭症患者和正常对照。结果如表3～5所示。
[0078]
表3自闭症组与对照组k01710基因丰度检测数据表
[0079]
[0080][0081]
[0082]
表4自闭症组与对照组k01710基因丰度显著性差异分析
[0083][0084]
表5自闭症组与对照组k01710基因丰度差异分析结果
[0085][0086]
表4显示，在验证阶段，自闭症组和对照组中k01710基因丰度的差异显著。
[0087]
表5显示，在验证阶段，自闭症组粪便中肠道菌k01710基因的丰度显著低于对照组。
[0088]
4.3roc曲线的绘制
[0089]
通过roc曲线对用k01710的基因丰度来判定自闭症的方法进行评价，具体的roc曲线如图1所示。
[0090]
图1显示，曲线下面积为0.701，临界值为107.5760时，灵敏度为0.810，特异性为0.545。表明用该方法进行自闭症的风险筛查具有较高灵敏度。
[0091]
实施例2
[0092]
根据肠道菌kegg id为k01710的基因丰度与自闭症的相关性，可以通过检测样本中kegg id为k01710的基因丰度来诊断自闭症，据此本发明提供了一种基于检测肠道菌kegg id为k01710的基因丰度的诊断自闭症的试剂盒。试剂盒组分如下：dna提取试剂、dna样品的检测试剂、pcr扩增及文库构建试剂，包括：反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dntps)、taq-聚合酶逆转录酶、dnase、rnase抑制剂、depc-水、无菌水、sybr green荧光染料等、以及illuminanovaseq6000等高通量测序平台测序所用的通用试剂。
[0093]
实施例3
[0094]
本实施例提供诊断自闭症的芯片，所述芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性识别肠道菌kegg id为k01710的基因，即
dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或其同工酶的基因(rfbb,rmlb和rffg)。
[0095]
由以上实施例可知，本发明提供了肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用与一种检测试剂盒和检测系统，本发明首次发现了肠道菌kegg id为k01710的基因的丰度与自闭症相关，其丰度在自闭症患者人中呈现明显降低，roc曲线分析其作为检测变量具有较高的特异性和敏感性，因此，可以将肠道菌kegg id为k01710的基因的丰度作为检测标志物应用于自闭症患者的诊断。以肠道菌kegg id为k01710的基因的丰度作为检测标志物，完全无创，准确性高。
[0096]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用，其特征在于，所述肠道菌标志物为：编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码dtdp-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因的kegg id为k01710。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用是通过检测肠道菌标志物在粪便样本中的丰度进行判断。4.一种自闭症风险筛查试剂盒，其特征在于，所述自闭症风险筛查试剂盒中包括用于检测权利要求1所述肠道菌标志物的试剂。5.根据权利要求4所述的自闭症风险筛查试剂盒，其特征在于，所述用于检测所述肠道菌标志物的试剂包括dna提取试剂、宏基因组建库和测序试剂。6.根据权利要求5所述的自闭症风险筛查试剂盒，其特征在于，所述dna提取试剂为ctab法提取dna的试剂；所述宏基因组建库和测序的试剂为illuminanovaseq6000高通量测序平台的建库和测序试剂。7.一种自闭症风险筛查系统，其特征在于，所述自闭症风险筛查系统包括检测权利要求1所述肠道菌标志物的装置以及分析装置。8.根据权利要求7所述的自闭症风险筛查系统，其特征在于，所述检测肠道菌标志物的装置包括dna提取单元、宏基因组建库和测序单元、基因丰度检测单元。9.根据权利要求8所述的自闭症风险筛查系统，其特征在于，所述分析装置为统计软件；所述统计软件为spss统计软件。

技术总结

本发明提供了肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用与一种检测试剂盒和检测系统，涉及生物医学技术领域。本发明的方案为肠道菌标志物在作为自闭症风险筛查的标志物中的应用，所述肠道菌标志物为：编码dTDP-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因。本发明首次发现的编码dTDP-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因与自闭症相关。并通过实验验证了肠道菌标志物与自闭症间的关系。因此肠道菌标志物编码dTDP-葡萄糖4，6-脱水酶或同工酶的基因可以作为自闭症风险筛查的标志物。为后期自闭症的研究提供了理论基础。后期自闭症的研究提供了理论基础。后期自闭症的研究提供了理论基础。