一种利用诱导子提高反应器培养东北刺人参不定根中有效物质的方法

本发明为一种利用诱导子提高反应器培养东北刺人参不定根中有效物质的方法。当东北刺人参不定根在反应器培养至30～40d、生物量达到最大时，加入茉莉酸甲酯(200μmoL/L)、水杨酸(100μmoL/L)、普鲁兰多糖(200mg/L)后处理10d，结果发现不定根中黄酮含量均得到显著提高，含量由31.00mg/g提高到45.88mg/g，其中利用茉莉酸甲酯(200μmoL/L)和普鲁兰多糖(200mg/L)两种诱导子对不定根进行处理时，不定根中多糖含量大幅度提高，多糖含量分别提高了53.33、97.07mg/g、生产量分别提高了0.348、0.6865g/L。本发明可以有效提高不定根中黄酮及多糖含量，结合组织培养的手段，通过反应器不定根培养可在短期内获得较高含量黄酮及多糖的东北刺人参不定根，为珍稀东北刺人参的资源利用与保护提供一种方便而有效的方法。

1.一种利用诱导子提高反应器培养东北刺人参(OplopanaxellatusNakai)不定根中有效物质的方法，所用的诱导子分别是茉莉酸甲酯、水杨酸、普鲁兰多糖。东北刺人参不定根在生物反应器中生物量达到最大(培养30～40d)时，加入不同浓度诱导子进行处理。该方法通过生物反应器可在短时间内有效提高长白山珍贵植物东北刺人参不定根中黄酮和多糖含量，为东北刺人参商业化生产及产品的开发提供技术参考。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，为一种利用诱导子提高反应器培养东北刺人参不定根中有效物质的方法。

背景技术

东北刺人参(OplopanaxelatusNakai)又名刺参，五加科刺参属，多年生落叶灌木，是我国长白山特有的植物资源之一。东北刺人参药用价值极高，其根、根茎和茎是名贵的中药材，富含皂苷、多糖、黄酮、挥发油、蒽醌、脂肪酸等多种药用成分，可用于神经衰弱、低血压、阳萎、精神分裂、糖尿病等疾病，并具有抗真菌、抗抑郁、解热、镇痛和抗衰老的作用。近年来又发现叶中含有的一些成分与根和茎相近，所以叶也具有药用价值。由于其疗效显著，且无任何毒副作用，在长白山区被称作“木本人参”。目前，对东北刺人参化学成分及药理作用的研究较多，但临床应用研究则较少，因此开发及研制东北刺人参高效药物，对东北刺人参资源的利用具有重要意义。由于其药用价值很高，人们过度采挖导致其野生资源短缺，人工栽培方面，有性繁殖，结实率低，移栽成活率低；无性繁殖出现假死现象，且恢复期生长期长，繁殖材料来源短缺，在栽培过程中易受气候和化学农药的影响，产量不能保持稳定，具有较大风险，因此寻一种可以替代野生及人工栽培东北刺人参的方法已迫在眉睫，而利用植物组织培养进行中药资源繁殖并大规模生产已成为一条有效可行的发展途径，植物组织培养包括细胞培养，组织和器官培养，但药用植物细胞培养的弊端之一是有效成分含量不稳定，这主要是由于大多数有效成分均为次生代谢产物，其合成在细胞阶段表现不强而造成，而根培养可以解决这一问题。

不定根培养的优势在于其具有原始植物根所具有的巨大生物合成能力，根培养中细胞的高度分化使得次生代谢产物的合成能力明显提高，同时表现出明显的代谢稳定性和活力稳定性，加之与生物反应器的结合利用，使得东北刺人参不定根的大量生产得到了有效的保证，进而为东北刺人参野生资源的保护及开发提供了一条有效可行的方法。由于生产黄酮及多糖含量高且稳定的东北刺人参不定根在药物开发中极为重要，近年来，利用诱导子进行目标产物调控及生物合成已得到越来越多的国内外学者的关注，也是大幅度提高培养物中代谢产物的重要方法之一。

诱导子包括生物诱导子和非生物诱导子两大类，它具有专一性、快速性、浓度效应、时间效应以及协同效应，同一植物对不同诱导子的反应不同，因而刺激合成的代谢产物及其含量也有所不同，因此，在实际应用中应综合考虑与灵活运用，使诱导子在药用植物培养过程中发挥最佳促进作用。本发明选用三种非生物诱导子(茉莉酸甲酯、水杨酸、普鲁兰多糖)处理反应器培养的东北刺人参不定根，发现三种诱导子对东北刺人参不定根中黄酮含量均有大幅度提高，茉莉酸甲酯和普鲁兰多糖诱导子对不定根中多糖含量的积累也有明显促进作用，这对东北刺人参资源的开发利用有十分重要意义。

本发明利用气球型气升式生物反应器培养东北刺人参不定根，当不定根生物量达到最大时(培养30～40d)加入三种诱导子，处理10d，发现这三种诱导子处理后对不定根生物量影响不大，且促进不定根中黄酮的合成，使其含量得到显著提高；同时，利用茉莉酸甲酯和普鲁兰多糖作为诱导子可以提高东北刺人参不定根中多糖含量及生产量。该方法通过对反应器内不定根培养可在短时间内获得较高含量的东北刺人参黄酮及多糖，获得的高效代谢产物东北刺人参不定根对珍稀东北刺人参的资源利用与开发保护意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用诱导子提高反应器培养东北刺人参不定根中有效物质的方法。以反应器培养的东北刺人参不定根为材料，用茉莉酸甲酯、水杨酸及普鲁兰多糖对不定根进行处理，通过对三种诱导子浓度的筛选，制定提高东北刺人参中黄酮及多糖含量的具体方案，为珍稀东北刺人参资源的保护和开发利用提供一种新方法。

本发明采用了以下技术方案：

一种利用诱导子提高反应器培养东北刺人参不定根中有效物质的方法。

①东北刺人参不定根诱导和反应器培养

将东北刺人参无菌苗侧根诱导的不定根进行增殖，增殖获得的不定根称取20g(FW)接种于含有4L液体培养基的5L气球型气升式生物反应器中，通气量为300mL/min，温度为25℃条件下暗培养。

②诱导子处理

当反应器培养30～40d不定根生物量达到最大时(120～150g/L鲜物重)，收获反应器内不定根并收集培养液，称取10g不定根接种于含有100mL上述培养基的的三角瓶中，同时添加三种不同浓度的诱导子进行处理，10d后收获不定根，然后测定其生物量。

③东北刺人参不定根中黄酮含量及生产量的测定

将诱导子处理的东北刺人参不定根烘干并研磨成粉末，利用硝酸铝染法，通过紫外分光光度计(UV-2600，上海天河环境技术有限公司，中国)测定其黄酮含量并计算其生产量，生产量(mg/L)＝含量×干物重。

④东北刺人参不定根中多糖含量及生产量的测定

将诱导子处理的东北刺人参不定根烘干并研磨成粉末后，利用苯酚硫酸法，通过紫外分光光度计测定多糖含量并计算其生产量。

本发明整体考察了不同诱导子及其处理浓度对东北刺人参不定根中黄酮及多糖的作用效果，在此基础上优化并筛选出了合理的诱导子处理浓度，形成了一套完整的增加东北刺人参不定根中黄酮和多糖含量及生产量的途径。本发明可显著提高东北刺人参不定根的黄酮及多糖生产量。

附图说明

图1a：插头b：气泵c：空气流量计d：过滤膜e：多孔喷嘴(孔径15μm)f：出气口*箭头表示空气流动方向

图2茉莉酸甲酯浓度对东北刺人参不定根中黄酮含量及生产量的影响

图3水杨酸浓度对东北刺人参不定根中黄酮含量及生产量的影响

图4普鲁兰多糖浓度对东北刺人参不定根中黄酮含量及生产量的影响

图5茉莉酸甲酯浓度对东北刺人参不定根中多糖含量及生产量的影响

图6水杨酸浓度对东北刺人参不定根中多糖含量及生产量的影响

图7普鲁兰多糖浓度对东北刺人参不定根中多糖含量及生产量的影响

具体实施方式

(一)材料与方法

①东北刺人参不定根诱导及反应器培养

将打破休眠的东北刺人参种子播种于蛭石中，待子叶展开长出新植株后，将植株进行消毒，在无菌条件下接种于含有MS培养基的培养皿(Φ×h＝90×15mm)中形成根，将侧根切成1cm大小后接入含有25mL培养基(MS+IBA3.0mg/L+白糖50g/L+倍力凝8g/L，pH5.8)的培养皿中进行不定根的诱导，将诱导的不定根接种于上述培养基中，每隔25～30d继代培养一次，然后将继代培养获得的不定根称取20g(FW)，并切成1cm大小接种于含有4L液体培养基的5L气球型气升式生物反应器中，培养基：MS+IBA3mg/L+白糖50g/L，pH5.8，在通气量为300mL/min，温度为25℃条件下暗培养。

②诱导子处理

当反应器培养30～40d不定根生物量达到最大时(120～150g/L鲜物重)，收获反应器内不定根并收集培养液，称取10g不定根接种于含有100mL上述培养基的的三角瓶中，同时添加三种不同浓度的诱导子，将茉莉酸甲酯浓度设定为50、100、150、200和250μmoL/L；水杨酸浓度设定为25、50、75、100和125μmoL/L；普鲁兰多糖浓度设定为100、200、300、400和500mg/L。以未加入诱导子为对照。在转速为121r/min的振荡器(GTCS-2013B，金坛市科析仪器有限公司，中国)上进行暗培养，10d后将不定根取出，用自来水冲洗2～3次，置于干净的纱布中用手挤脱水，称鲜物重，然后分别放入标记好的培养皿中并置于45℃干燥箱(YHW1103，天津市华北实验仪器有限公司，中国)中烘干，2d后称干物重。

③东北刺人参不定根中黄酮含量的测定

标准曲线的制作：精密称取芦丁10mg，用70％的乙醇溶解并用250mL容量瓶定容摇匀。得到浓度为40μg/L的标准液，分别精密吸取此标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL置于试管中，加蒸馏水至2mL，以70％的乙醇为对照，分别加入0.3mL5％的NaNO2溶液，摇匀静止6min，加入0.3mL10％的Al(NO3)3溶液，摇匀静止6min，再加入4％的NaOH溶液2mL，反应10min后，在510nm处测定其吸光值。

样品溶液的制备：将上述处理的东北刺人参不定根干材料研磨，精密称取样品0.1g，置于离心管中，加入10mL70％的乙醇后置于60℃的水浴锅中2～3h，冷却后，在温度为4℃、转速为5000r/min条件下离心15min，取上清液定容至10mL，从中取出1mL稀释至25mL。精密吸取1mL按标准曲线项操作，并计算出黄酮含量。

④东北刺人参不定根中多糖含量的测定

标准曲线的制作：精密称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，室温下溶解于100mL的容量瓶中，得到浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液。再利用此标准液配制浓度为0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15mg/mL的葡萄糖对照溶液，各取葡萄糖对照液1mL置于试管中，以蒸馏水作为空白对照，然后用苯酚硫酸法在490nm处测定其吸光值。

多糖的提取：精密称取东北刺人参不定根粉末10g，用90％乙醇浸泡2次，每次6h，乙醇挥干后加入100mL的蒸馏水在45℃下水浴1h，滤纸过滤并收集提取液，将滤渣加入同等体积的蒸馏水再水浴提取，重复3次，将3次提取得到的混合液在5000r/min条件下离心15min，得到的上清液用Sevage试剂除蛋白3次。再加入95％的乙醇静止12h，用于沉淀多糖，之后进行抽滤，滤渣分别用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗3次，滤渣清洗后置于45℃的烘干箱中烘干，既得东北刺人参多糖。精密称取10mg的多糖加蒸馏水定容置100mL的容量瓶中，既得0.1mg/mL的多糖溶液。换算因子：f＝多糖的重量(mg)/多糖溶液体积(mL)×多糖液的葡萄糖浓度(mg/L)。

样品溶液的制备：精密称取0.1g东北刺人参不定根粉末，90％乙醇浸泡2次，每次6h，乙醇挥干后加入50mL的蒸馏水在45℃下水浴3h，将滤液定容置100mL，既得样品溶液，同上利用苯酚硫酸法测定样品的吸光值。按下列公式计算多糖含量，多糖含量(mg/g)＝Cf×1000

(二)结果与分析

通过对不定根鲜物重和干物重的测定，并利用紫外分光光度计对东北刺人参不定根中的黄酮及多糖含量进行分析，得到如下结果：

①诱导子对不定根中黄酮含量及生产量的影响

将茉莉酸甲酯浓度设定为50、100、150、200、250μmoL/L；水杨酸浓度设定为25、50、75、100和125μmoL/L；普鲁兰多糖浓度设定为100、200、300、400和500mg/L。不定根反应器培养30～40d时，分别加入不同浓度的诱导子，处理10d后将不定根取出称鲜物重与干物重，并用紫外分光光度计测定黄酮含量并计算其生产量，结果发现：三种诱导子处理后不定根的鲜物重和干物重无明显变化，200μmoL/L茉莉酸甲酯对不定根进行处理，得到的黄酮含量最高(42.73mg/g)，而未进行诱导子处理的不定根中黄酮含量及生产量仅为28.33mg/g和219.84mg/L。水杨酸处理浓度为100μmoL/L时，不定根中黄酮含量由未处理的31.00mg/g提高到45.88mg/g，而普鲁兰多糖的浓度为200mg/L时，不定根中黄酮的含量由33.42mg/g提高到43.51mg/g。由此可见，适当浓度的三种诱导子对不定根中黄酮含量均有所提高。

②诱导子对不定根中多糖含量及生产量的影响

东北刺人参不定根反应器培养30～40d时分别加入不同浓度的诱导子，将茉莉酸甲酯浓度设定为50、100、150、200、250μmoL/L；水杨酸浓度设定为25、50、75、100和125μmoL/L；普鲁兰多糖浓度设定为100、200、300、400和500mg/L，处理10d后将不定根取出，测定其生物量及多糖含量和生产量。研究结果发现三种诱导子对不定根的生物量积累无影响，但是只有一定浓度的茉莉酸甲酯和普鲁兰多糖对不定根中多糖含量有促进作用。当茉莉酸甲酯浓度为150～200μmoL/L时有利于多糖含量的积累，多糖含量由153.87mg/g提高到186.93～207.20mg/g，200μmoL/L茉莉酸甲酯处理不定根其多糖生产量显著高于其他处理。普鲁兰多糖浓度为200mg/L时，不定根中多糖含量由108.37mg/g提高到205.44mg/g，由此可见，加入200mg/L的普鲁兰多糖对反应器内不定根的多糖含量有明显提高效果。

通过对三种诱导子浓度的筛选结果，可知反应器培养30～40d的不定根经三种诱导子处理后，对不定根的鲜物重和干物重影响并不大，同时，发现三种诱导子对不定根中黄酮的积累均有所提高，茉莉酸甲酯(200μmoL/L)、水杨酸(100μmoL/L)、普鲁兰多糖(200mg/L)处理不定根后黄酮生产量分别提高了98.07、104.94、64.7mg/L；其中，茉莉酸甲酯和普鲁兰多糖两种诱导子也有利于不定根中多糖含量的积累。

因此，在东北刺人参不定根生产中，可在不定根生物量达到最大时加入茉莉酸甲酯(200μmoL/L)或普鲁兰多糖(200mg/L)进行处理以达到提高黄酮和多糖产量的目的，倘若目标产物为黄酮也可利用水杨酸(100μmoL/L)对不定根进行处理。